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Articolo metodologico

Approcci sperimentali per l'analisi biochimica della proteina acida fibrillare gliale e delle sue varianti associate alla malattia

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DOI:

10.3791/69523

⸱

28 novembre 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In questo articolo

Sommario

Questo studio delinea metodi sperimentali per caratterizzare biochimicamente il GFAP e le sue mutazioni patogene, concentrandosi sull'assemblaggio, aggregazione e modifica post-traduzionale dei filamenti. Sono state analizzate proteine GFAP ad alta purezza, rivelando intuizioni sui meccanismi della malattia di Alexander che potrebbero fornire un quadro per studiare potenziali bersagli terapeutici e comprendere le mutazioni GFAP e i disturbi correlati.

Abstract

La Proteina Acida Fibrillaria Gliale (GFAP) è una proteina filamento intermedia fondamentale per mantenere l'integrità strutturale e la funzione degli astrociti nel sistema nervoso centrale. Le mutazioni nella GFAP sono la causa principale della malattia di Alexander (AxD), una rara e spesso fatale patologia neurodegenerativa caratterizzata dall'aumento dei livelli di GFAP e dall'accumulo di GFAP sotto forma di fibre di Rosenthal. Qui, delineiamo un insieme completo di approcci sperimentali per la caratterizzazione biochimica del GFAP e delle sue varianti causanti la malattia. Utilizzando tecniche di espressione ottimizzata e purificazione avanzate, abbiamo raggiunto elevati rendimenti e purezza sia di proteine GFAP di tipo selvatico che mutanti. Sono stati impiegati saggi biochimici per valutare gli effetti delle mutazioni patogeniche sull'assemblaggio, la solubilità e l'aggregazione dei filamenti. Inoltre, abbiamo esplorato il ruolo delle modifiche posttraduzionali aberranti nell'aggregazione GFAP e il loro impatto sulle proprietà dei filamenti. Questo lavoro approfondisce la nostra comprensione del ruolo della GFAP nell'AxD e getta le basi per sviluppare strategie terapeutiche che affrontino la disfunzione della GFAP. Inoltre, le metodologie qui presentate rappresentano strumenti preziosi per indagare le conseguenze biochimiche delle mutazioni GFAP e per promuovere interventi per i disturbi correlati alla GFAP.

Introduzione

La malattia di Alexander (AxD) è un disturbo genetico derivante da mutazioni dominanti nel gene che codifica per la proteina acida gliale fibrillare (GFAP)1, una proteina di tipo III a filamento intermedio (FI) presente prevalentemente negli astrociti maturi. AxD è caratterizzata da una regolazione all'alza diGFAP 2, astrogliosireattiva 3 e l'accumulo di fibre di Rosenthal, che sono inclusioni proteiche composte principalmente da GFAP insieme a proteine associate come αB-cristallina4 e ubiquitina5. Le mutazioni nel gene GFAP interrompono l'assemblaggio normale delfilamento 6, portando a aggregazione anomala, induzione di risposte cellulariallo stress 7 e ulteriore destabilizzazione tramite modifiche post-traduzionali aberranti (PTM) come fosforilazione8,ossidazione 9 e ubiquitinazione10.

Nonostante il ruolo centrale della GFAP nella patologia dell'AxD, i meccanismi molecolari con cui la GFAP mutante interrompe l'assemblaggio dei filamenti, favorisce l'aggregazione e induce stress cellulare restano poco compresi. Questa lacuna di conoscenza ostacola lo sviluppo di terapie mirate per affrontare l'aggregazione e la tossicità GFAP. Studiare le proprietà biochimiche del GFAP e delle sue varianti associate all'AxD è fondamentale per scoprire i meccanismi molecolari alla base della progressione della malattia. Tuttavia, la proprietà incline all'aggregazione del GFAP e il suo comportamento alterato di assemblaggio nelle varianti associate a malattie presentano sfide uniche per l'analisi sperimentale. Gli studi biochimici controllati richiedono GFAP purificato, ottenuto sia da modelli animali che tramite espressione ricombinante, per indagare gli effetti delle mutazioni dell'AxD sull'assemblaggio, aggregazione e modifiche patologiche dei filamenti.

Gli approcci sperimentali presentati in questo studio offrono diversi vantaggi rispetto alle tecniche alternative. Ad esempio, sebbene i modelli cellulari11 e gli studi immunoistochimici12 forniscano preziose informazioni sull'espressione e localizzazione della GFAP, spesso non riescono a catturare i meccanismi biochimici precisi dell'assemblaggio e aggregazione dei filamenti a causa della complessità degli ambienti cellulari. Al contrario, i metodi qui descritti, come gli saghi di assemblaggio dei filamenti in vitro , le analisi della sedimentazione e la caratterizzazione PTM, permettono un'indagine controllata delle proprietà biochimiche intrinseche del GFAP e delle sue varianti associate alla malattia. Questi approcci permettono ai ricercatori di analizzare il comportamento di assemblaggio e aggregazione dei filamenti in un sistema semplificato, facilitando l'identificazione dei meccanismi molecolari alla base della disfunzione GFAP. Studi precedenti hanno dimostrato l'utilità di tali tecniche biochimiche nell'analisi delle proteine IF, tra cui desmin13 echeratina 14, sottolineandone l'applicabilità alla ricerca GFAP.

Inoltre, questo manoscritto fornisce informazioni per aiutare i lettori a determinare se i metodi descritti siano appropriati per le loro specifiche applicazioni. I ricercatori interessati a studiare le proprietà biochimiche del GFAP, il suo comportamento di assemblaggio, o PTM, troveranno queste tecniche particolarmente utili per indagare varianti associate a malattie e i loro effetti patologici. Integrando questi approcci biochimici con altri sistemi sperimentali, come studi cellulari o modelli animali, i ricercatori possono ottenere una comprensione più completa della disfunzione GFAP nell'astrocitopatia AxD e in altre correlate.

L'obiettivo generale di questo metodo è presentare approcci sperimentali per l'analisi biochimica del GFAP e delle sue varianti associate all'AxD, incluse tecniche di purificazione proteica, sagaggi di assemblaggio filamentorum in vitro , analisi della sedimentazione e caratterizzazione PTM. Questi metodi forniscono intuizioni fondamentali sulla base molecolare della disfunzione GFAP nell'AxD, aprendo la strada allo sviluppo terapeutico. Inoltre, l'applicazione di queste tecniche sperimentali farà avanzare la nostra comprensione della biochimica GFAP in AxD e contribuirà al più ampio campo della ricerca sull'IF.

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Protocollo

Gli animali utilizzati in questo studio sono ratti modello AxD con la mutazione knock-in R237H11. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del College of Life Sciences and Medicine della National Tsing Hua University (Approvazione NTHU IACUC n. 109088 e 111060) e in conformità con le linee guida della Guida Agricola per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.

1. Purificazione del GFAP ricombinante dai batteri (Figura 1)

  1. Trasformare il ceppo pLysS BL21(DE3) di E. coli con il vettore pET 23b contenente cDNA di GFAP WT o mutante.
  2. Coltura di batteri in 1 L di mezzo Luria-Bertani integrato con 100 μg/mL di ampicillina e 34 μg/mL di cloroanfenicolo a 37 °C fino a OD600 di ~0,2.
  3. Aggiungere isopropilico β-D-1-tiogalattociranoside (IPTG, 0,5 M) a una concentrazione finale di 0,5 mM per indurre un'espressione di GFAP a 37 °C per 4 ore.
  4. Prelevare i batteri tramite centrifugazione a 6.371 xg per 30 minuti a 4 °C.
  5. Batteri di lisi in 50 mL di TEN buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) integrati con 0,2 mM fluoruro di phnenilmetanassolponile (PMSF) tramite omogeneizzazione in un omogeneizzatore Dounce.
  6. Centrifugare la licata batterica a 22.045 xg per 20 minuti a 4 °C, poi estrarre il pellet nel tampone Triton X-100 (DIECI con 1% (v/v) Triton X-100).
  7. Dopo la centrifugazione nelle stesse condizioni, si estrae il pellet risultante nel tampone ad alto contenuto di sale (TEN con 1% (v/v) Triton X-100 e 1,5 M KCl).
  8. Dopo la centrifugazione nelle stesse condizioni, lavare il pellet con il tampone TEN.
  9. Sciogliere l'ultimo pellet in 10 mL di tampone di urea (8 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA e 0,2 mM PMSF) mescolare per 3 ore a temperatura ambiente.
  10. Centrifuga l'urea estrae a 80.000 xg in un'ultracentrifuga da tavolo a 4 °C per 20 minuti.
  11. Aggiungere polietilenemina (1% (v/v)) alla frazione ureasolubile fino a una concentrazione finale dello 0,06% (v/v) e incubare sul ghiaccio per 5 minuti.
  12. Centrifugare a 80.000x g a 4 °C per 20 minuti, poi dialisi la frazione soprantantante contro il tampone A (6 M urea, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-mercaptoetanolo).
  13. Caricare i dialisati su una colonna di scambio ionico CM-Sepharose pre-bilanciata nel buffer A in un sistema di cromatografia NGC.
  14. Proteine elute con un gradiente lineare di 0-0,5 M NaCl nel tampone A per 1 ora a portata di 1 mL/min.
  15. Raccogliere le frazioni contenenti GFAP e dialisi contro il tampone B (6 M urea, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM EDTA).
  16. Carica dialisata su una colonna di scambio anionico pre-equilibrata nel buffer B. Elute proteine con un gradiente lineare di 0-0,5 M NaCl nel buffer B per 1 ora a portata di 1 mL/min.
  17. Analizza le frazioni di colonna tramite colorazione blu SDS-PAGE e Coomassie. Raccogli quelle contenenti GFAP purificato e conserva a -80 °C.
    NOTA: La lisi batterica può essere facilitata da diversi cicli di congelamento e discongelamento. La concentrazione finale di polietilenemina non dovrebbe superare lo 0,06% (v/v), oltre la quale precipitano anche le proteine. Quando si lavora con materiali pericolosi come PMSF e β-mercaptoetanolo, è fondamentale includere linee guida e istruzioni chiare sulla sicurezza per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi. Il PMSF è altamente tossico e può causare irritazione alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie. Prepara soluzioni PMSF fresche in una cappa e evita il contatto diretto. Usa β-mercaptoetanolo in un'area ben ventilata poiché emette fumi forti e tossici.

2. Assemblaggio in vitro e saggio di sedimentazione (Figura 2)

  1. Diluire WT purificato o GFAP mutante a 0,3 mg/mL in 6 M urea in tampone a basso contenuto di sale (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA e 14,4 mM β-mercapetanolo).
  2. Dialisi i campioni contro il tampone a basso contenuto di sale contenente 4 M e poi 2 M di urea per 4 ore a temperatura ambiente.
  3. Dialisi campioni contro il tampone a basso contenuto di sale senza urea durante la notte a 4 °C.
  4. Dialisi i campioni contro il tampone di assemblaggio (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl e 14,4 mM β-mercapetanolo) a temperatura ambiente per 12-16 ore.
  5. Trasferire le miscele dell'assemblaggio sulla sommità di un cuscino di saccarosio contenente 0,2 mL di saccarosio 0,85 M nel tampone dell'assemblaggio.
  6. Nel saggio di sedimentazione ad alta velocità, centrifugare le miscele a 80.000x g per 20 minuti a 20 °C utilizzando una micro-ultracentrifuga da tavolo.
  7. Concentrare GFAP non assemblato nella frazione soprantantante eseguendo precipitazione con metanolo/cloroformio 15. La risospensione precipita in 0,2 mL di tamponamento di Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (w/v) dodecil solfato (SDS), 12,5% (v/v) glicerolo, 0,01% (w/v) blu di bromofenolo e 355 mM β-mercaptoetanolo).
  8. Risospensa il GFAP assemblato nella frazione di pellet nel tampone di campione di Laemmli.
  9. Eseguire sia frazioni di sovrantanti che di pellet su gel di elettroforesi in gel di poliacrilammide SDS al 10% (w/v) e colorare con 10 mL di blu Coomassie.
  10. Nel saggio di sedimentazione a bassa velocità, la centrifuga assembla miscele a 3.000 xg per 5 minuti a 20 °C utilizzando una centrifuga da banco.
  11. Aggiungere 0,2 mL di buffer campione di Laemmli alle forme non aggregate di GFAP nella frazione soprantante.
  12. Sospendere GFAP aggregato direttamente nella frazione di pellet nel buffer campione di Laemmli in un volume proporzionale alla frazione soprandante.
  13. Analizzare sia le frazioni di sovrantanti che di pellet con il gel SDS-PAGE al 10% (c/v), seguito dalla colorazione blu Coomassie.
    NOTA: Metanolo e cloroformio sono solventi tossici e possono causare gravi effetti sulla salute. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Maneggiare con attenzione in una cappa per evitare fuoriuscite.

3. Colorazione negativa e microscopia elettronica (Figura 2)

  1. Scarica glow sulle griglie di rame Formvar/rivestite di carbonio per 45 s a 20 mA in un sistema di pulizia a scarica glow.
  2. Fornire le miscele di assemblaggio alla griglia scaricata dal glow e permettere ai campioni di legarsi alla pellicola di supporto per 60 secondi.
  3. Rimuovi il liquido in eccesso assorbendo il bordo della griglia con un foglio di carta assorbente.
  4. Lava le griglie con acqua distillata, poi tingi con 20 μL di acetato di uranile all'1% (p/v) per 60 secondi.
  5. Rimuovere la soluzione di macchia in eccesso e lasciare asciugare la griglia all'aria per 30 secondi.
  6. Esaminare le griglie sotto un microscopio elettronico a trasmissione (TEM) H-7600 utilizzando la modalità ad alta risoluzione a una tensione di accelerazione di 100 kV.
    NOTA: Scaricare le griglie con glow in un evaporatore a vuoto prima di aggiungere il campione proteico migliora l'adsorbimento del campione alla griglia. L'acetato di uranile è una sostanza chimica radioattiva e altamente tossica comunemente utilizzata nella microscopia elettronica per la colorazione negativa. La sua manipolazione richiede il rigoroso rispetto dei protocolli di sicurezza e delle istruzioni per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi al minimo dei rischi di esposizione per il personale e l'ambiente. Prepara soluzioni di acetato di uranile solo in una cappa per evitare l'inalazione di particelle o vapori in sospeso nell'aria.

4. Modifica ossidativa (Figura 3)

  1. Diluire il GFAP a 0,3 mg/mL in 6 M urea in un tampone a basso contenuto di sale (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA e 14,4 mM β-mercapetanolo) a temperatura ambiente per 2 ore.
  2. Dialisi contro il tampone a basso contenuto di sale contenente 4 urea M per 2,5 ore a temperatura ambiente. Mescola delicatamente il tampone utilizzando uno agitatore magnetico per mantenere una distribuzione uniforme e prevenire gradienti di concentrazione.
  3. Dopo 2,5 ore, trasferire la membrana della dialisi nel tampone a basso contenuto di sale contenente 2 urea M per altre 2,5 ore a temperatura ambiente, assicurando una mescolata delicata durante tutto il processo.
  4. Dialisi contro il tampone a basso contenuto di sale senza urea a 4 °C per 18 ore.
  5. Trattare i campioni dialisi con 10 mMH 2O 2 per 15 minuti, seguiti dal trattamento con 10 o 100 mM di ditiotreitolo (DTT) per ulteriori 15 minuti a temperatura ambiente.
  6. Analizzare i campioni proteici con SDS-PAGE standard al 10% (w/v) senza β-mercapethanol e colorare con 10 mL di blu Coomassie.
    NOTA: Quando si usaH2O2, maneggiarlo con cautela perché è un potente agente ossidante e può causare ustioni. Indossa dispositivi di protezione individuale per evitare il contatto con pelle e occhi. La DTT può causare irritazione alla pelle, agli occhi e al sistema respiratorio. Quando si lavora con DTT e H2O 2, è essenziale seguire i protocolli di sicurezza adeguati per minimizzare i rischi.

5. Purificazione del GFAP dal cervello dei ratti AxD (Figura 4A,B)

  1. Estrarre i tessuti cerebrali con 10 mL di TEN buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl e 5 mM EDTA) utilizzando un omogeneizzatore Douce.
  2. Centrifugare il cervello omogenea a 76.000x g a 4 °C per 20 minuti, poi estrarre il pellet risultante con 10 mL di tampone Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 in tampone TEN).
  3. Centrifugare a 76.000x g a 4 °C per 20 minuti, poi estrarre il pellet risultante con 10 mL di tampone di saccarosio (0,85 M saccarosio e 0,5% (v/v) Triton X-100 in TEN buffer).
  4. Centrifugare a 76.000x g a 4 °C per 20 minuti, poi estrarre il pellet risultante con 10 mL di tampone ad alto contenuto di sale (1,5 M KCl e 0,5% (v/v) Triton X-100 in tampone TEN).
  5. Centrifugare a 76.000x g a 4 °C per 20 minuti, poi estrarre il pellet finale con 10 mL di tampone di urea (8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 e 5 mM EDTA).
  6. Raccogliere la frazione soprantantante e dialisi contro il buffer della colonna Q (6 urea M, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA e 14,4 mM β-mercaptoetanolo).
  7. Carica i dializzati su una colonna di scambio anioico in un sistema di cromatografia NGC.
  8. Eludi la proteina legata con un gradiente lineare di 0-0,5 M NaCl in tampone Q a una portata di 1 mL/min.
  9. Pool la frazione contenente GFAP e dialisi contro il tampone della colonna S (6 M urea, 20 mM MES, pH 6 e 14,4 mM β-mercaptoetanolo).
  10. Applicare dialisi a una colonna di scambio cationico, poi eluire le proteine legate con un gradiente lineare di 0-1 M NaCl in buffer S a una portata di 1 mL/min.
  11. Analizzare le frazioni eluate tramite SDS-PAGE e colorazione blu Coomassie, e raccogliere quelle contenenti GFAP purificato.

6. Analisi dell'ubiquitinazione del GFAP tramite immunoblotting (Figura 4C)

  1. Esegui GFAP purificato su gel SDS-PAGE al 10% (con v).
  2. Trasferisci le proteine dal gel a una membrana di nitrocellulosa.
  3. Bloccare la membrana incubandola con 10 mL di albumina sirica bovina al 3% (w/v) in soluzione salina Tris-buffered (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) contenente 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Incubare la membrana con 5 μL di anti-GFAP e 5 μL di anticorpi primari anti-ubiquitina diluiti in 5 mL di TBST a 4 °C durante la notte. Lava la membrana tre volte con TBST.
  5. Incubare la membrana con 5 μL di anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti, diluiti in 5 mL di TBST, a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Lava la membrana tre volte con TBST.
  6. Acquisire immagini utilizzando un sistema di rilevamento a fluoro.
  7. Analizzare l'assemblaggio in vitro del GFAP nativo tramite saggi TEM e sedimentazione (Figura 5) utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 2.1-2.13 e 3.1-3.6.

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Risultati

Per indagare come le mutazioni causatrici di AxD influenzino le proprietà di assemblaggio del GFAP, abbiamo prodotto proteine ricombinanti nei batteri utilizzando un sistema di espressione basato su PET. Descriviamo i protocolli per l'espressione e la purificazione del GFAP, usando come esempio il GFAP del WT. Dopo l'induzione dell'IPTG (Figura 1A, corsia 2), il GFAP è stato purificato tramite un processo in tre fasi che prevede la preparazione del corpo di inclusione (F...

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Discussione

Questo protocollo stabilisce un quadro sperimentale completo per la caratterizzazione biochimica del GFAP e dei suoi mutanti associati alla malattia. Fornendo un approccio affidabile e standardizzato, questo metodo è una risorsa preziosa che migliora la nostra comprensione dei ruoli biologici della GFAP e delle sue implicazioni patologiche, in particolare nel contesto dell'AxD. In questa sezione discutiamo diversi aspetti critici del protocollo, tra cui potenziali modifiche e strategie d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo la dottoressa Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) per aver fornito i ratti R237H. I suggerimenti e il supporto del Prof. Albee Messing (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) su questo studio sono molto apprezzati. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (111-2320-B-007-008 e 112-2320-B-007-006 a N.-H. L. e M.-D.P.). Ringraziamo inoltre BioTEM presso la National Tsing Hua University (MOST-104-2731-M-007-002) per l'uso delle apparecchiature in questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione 30% di acrilammide/Bis 37,5:1Biorad1610158
Persolfato di ammonio (APS)Biorad1610700
AmpicillinaUSB11259
Anticorpo anti-GFAPTecnologia di segnalazione cellulare12389
Anticorpo anti-ubiquitinaMilliporeST 1200Clone FK2
Centrifuga Avanti J-26S XPBeckman
CloroanfenicoloUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Colorante blu CoomassieUSB32826
Griglia in rameTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultra-centrurgeHitachiNA
Omogeneizzatore a dounceWheaton
DTTURDTT
Ceppo pLysS di E. coli BL21(DE3)Agilent
EasiGlowTed Pella
Reagente ECLPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
Colonna S di HiResCytiva2927 5877
Colonna HiTrap QCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)USB75851
LB medium (LB Broth)BD Difco244620
mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
Sistema di cromatografia NGCBioRad
Optima XE-90 UltracentrifugaBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
PolietileneiminaSigma-AldrichP3143
RotoreBeckman
Rotore S55SHitachi
Rotore S80AT3Hitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 capra anti-topo IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 capra anti-coniglio IgG BioRad12004161
SucrosioSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Microscopio elettronico a trasmissione H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Acetato di uranyleScienze del microscopio elettronico  22400
UreaHoneywell15604H

Riferimenti

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