Il protocollo per lo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione
- Ottenete 216 maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) senza patogeni specifici (SPF), con un peso di 300-320 g.
- Abituare i ratti all'ambiente abitativo per una settimana prima dell'esperimento.
- Mantieni le condizioni abitative a 23 ± 3 °C, 45% ± 5% di umidità e un ciclo di 12 ore luce e buio (luci accese alle 8:00 e spente alle 20:00).
- Ospitano cinque ratti per gabbia con accesso ad libitum a cibo e acqua standard sterili.
NOTA: Minimizzare il numero di animali utilizzati e ridurre la sofferenza attraverso una maneggiamento delicato e procedure ottimizzate (ad esempio, contenzioni regolabili per prevenire la soppressione respiratoria).
2. Chirurgia dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)
NOTA: Questo passaggio descrive l'istituzione del modello MCAO/reperfusion (MCAO/R), modificato da Bederson et al.6.
- Preparate i ratti per l'intervento.
- Fai digiunare i ratti durante la notte (12 ore) prima dell'intervento (senza restrizione idrica).
- Anestesiare i ratti tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio all'1% (50 mg/kg).
NOTA: Non sono stati somministrati ulteriori analgesici, poiché il pentobarbital sodio veniva usato esclusivamente come agente anestetico.
ATTENZIONE: Il pentobarbital sodico è un anestetico controllato. Maneggiare in una cappa aspirante, indossare guanti e occhiali protettivi e conservare in un armadietto chiuso a chiave secondo le normative istituzionali.
- Mettere in sicurezza e preparare il sito chirurgico.
- Posiziona i ratti anestetizzati in posizione supina e sistema gli arti.
- Radere il pelo del collo e disinfettare la pelle con un disinfettante appropriato (ad esempio, etanolo al 75%).
- Espone e prepara i vasi del collo.
- Fai un'incisione mediana di 2-3 cm nella pelle del collo, poi seziona in modo diretto ghiandole sottocutanee e fascia. Separare l'arteria carotide comune (CCA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA), che sono formate dai rami della CCA.
- Individua il CCA, posiziona due suture sotto di esso come riserva, lega uno vicino all'estremità del cuore e lega un nodo vivo vicino alla biforcazione del CCA con l'altro.
- Usa una pinza arteriosa per chiudere l'estremità distale della CCA vicino alla biforcazione.
- Individua l'ECA e legala con una sutura.
- Inserisci la sutura per occludere l'MCA.
- Incidi con cura un'incisione sulla parete tra il sito di legatura dell'estremità prossimale della CCA e il punto di clampaggio della clip dell'arteria, poi inserisci un plug filettatore speciale (sutura monofilamento) in questa incisione.
- Apri la clip arteriosa e inserisci il tappo filettatore nell'ICA dalla forcella finché non si percepisce una leggera resistenza, poi fermati (Figura 1).
NOTA: La lunghezza della sutura (18 mm ± 2 mm) è fondamentale per un'occlusione costante dell'MCA; Regola leggermente in base al peso del ratto (300-320 g).
- Indurre ischemia e reperfusione.
- Mantieni l'ischemia per 2 ore (rigorosamente cronometrato con un cronometro).
- Dopo 2 ore, estrai delicatamente il punto per ripristinare il flusso sanguigno MCA, taglia il punto in eccesso e rimuovi la clip arteriosa.
- Chiudi il sito chirurgico e monitora il recupero.
- Irrigare l'incisione con soluzione salina sterile, poi sutura il tessuto sottocutaneo e la pelle.
- Mettere i ratti in una gabbia di recupero (mantenuta a 25 ± 1 °C) fino a quando non riprendono conoscenza; monitorare per emorragie o disturbi per 24 ore.
- Istituire il gruppo operativo finto.
- Esegui la stessa dissezione del collo ed esposizione dei vasi dei passaggi 2.1-2.3.
- Inserire la sutura nel CCA per soli 5 mm, poi rimuoverla immediatamente; Sutura l'incisione senza occlusione MCA.
3. Raggruppamento degli animali
- Dividere casualmente i ratti in sei gruppi (n = 36 per gruppo inizialmente) per il punteggio neurologico.
- Gruppo ictus: solo MCAO, nessuna contenzione comportamentale o trattamento farmacologico.
- Gruppo PSD: MCAO + contenzione comportamentale + isolamento alloggio, nessun trattamento farmacologico.
- Gruppo FXT: MCAO + contenzione comportamentale + alloggio isolante + gavage di fluoroxetina cloridrato.
- Gruppo YNJYP: MCAO + contenzione comportamentale + alloggio isolato + Yi-nao-jie-yu prescrizione (YNJYP) di gavage.
- Gruppo vuoto: nessuna operazione eseguita.
- Gruppo operatorio fittizio: nessuna ostruzione dell'arteria cerebrale media.
- Escludere i ratti con punteggi di 0 o 4 o quelli che sono morti dopo l'intervento.
- Eseguire il punteggio neurologico Longa7 24 ore dopo MCAO per selezionare i ratti qualificati.
- Usa la scala di Longa a 5 punti: 0 = nessun deficit; 1 = flessione dell'arto anteriore quando sollevata dalla coda; 2 = camminata circolare verso il lato paretico; 3 = cadere verso il lato paretico; 4 = incoscienza o incapacità di camminare.
4. Somministrazione di fluoxetina cloridrato (FXT) e YNJYP
- Prepara YNJYP e FXT.
NOTA: YNJYP contiene sei materiali medicinali cinesi: Ciwujia (radici di Acanthopanax senticosus ) 30 g, Yujin (rizomi di Curcuma longa ) 10 g, Wuweizi (frutti di Schisandra chinensis ) 15 g, Zhizi (frutti di Gardenia jasminoides ) 10 g, Danshen (radici di Salvia miltiorrhiza ) 15 g e Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong rizomi) 15 g (forniti dal Dipartimento di Farmacia, Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Pechino). Sulla base di studiprecedenti 8, la dose di somministrazione intragastrica è stata determinata in 9,92 g/(kg·g).
- Sciogliere le capsule di cloridrato di fluoxetina in acqua distillata per ottenere una concentrazione di 0,233 g/L quando vengono utilizzate. Basandosi sulla dose per adulti moltiplicata per sette, imposta la dose per i ratti a 2,33 mg/(kg·d).
- Somministrare farmaci tramite gavage.
- Inizia il Gavage dal primo giorno post-MCAO e prosegui fino alla fine dell'esperimento, con la procedura eseguita costantemente al mattino in tutti i gruppi.
- Somministrare la FXT al gruppo FXT a 2,33 mg/(kg·g) al giorno, YNJYP al gruppo YNJYP a 9,92 g/(kg·g) e allo 0,9% di soluzione fisiologica normale (10 mL/kg) ai gruppi ictus e PSD.
NOTA: Usa un ago da 1 mL; Assicurati che l'ago venga inserito nello stomaco (non nella trachea) per evitare l'aspirazione.
5. Stress cronico lieve (restrizione comportamentale) combinato con isolamento abitativo
- Inizia la contenzione comportamentale e l'isolamento al settimo giorno post-MCAO (per evitare la fase acuta di ictus).
- Prepara la piattaforma di contenimento personalizzata a forma di T.
- La piattaforma è composta da una base (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) e un'area di contenimento (22 cm × 6,6 cm).
- L'area di contenzione contiene fessure per fissare la testa e gli arti del ratto e tre cinghie regolabili per adattarsi a diverse dimensioni di ratti (Figura 2, Figura 3 e Figura 4).
NOTA: La piattaforma è stata modificata da Chen3 e Tian4, con slot aggiunti per gli arti anteriori per simulare la postura paretica dei pazienti con ictus.
- Esegui la contenzione quotidiana.
- Seleziona casualmente una finestra di 2 ore ogni giorno (ad esempio, 9:00-11:00 o 14:00-16:00) per evitare il bias circadiano.
- Fissare ogni ratto alla piattaforma usando le fessure e le cinghie; Regola la tensione per evitare difficoltà ma non la soppressione respiratoria.
- Mantieni la contenzione per 2 ore consecutive per 7 giorni consecutivi.
- Topi domestici in isolamento.
- Trasferire i ratti nei gruppi PSD, FXT e YNJYP dagli alloggi di gruppo (cinque ratti per gabbia) a gabbie singole all'inizio della contenzione comportamentale.
- Mantenere alloggi singoli fino al completamento della contenzione comportamentale (dopo MCAO giorno 14).
6. Test del consumo di saccarosio (SCT)
NOTA: Seleziona casualmente sei ratti di ogni gruppo a 2, 4 e 8 settimane dopo l'MCAO. Testare tutti i ratti nell'ordine SCT, OFT e FST.
- Prepara i topi per il test.
- Digiunare e privare i ratti dell'acqua per 24 ore prima del test.
- Assicurati che la temperatura della stanza di prova (23 ± 2 °C) e l'illuminazione corrispondano all'ambiente dell'alloggiamento.
- Esegui il test.
- Posiziona due bottiglie (da 150 mL ciascuna) in ogni gabbia: una contenente acqua del rubinetto e l'altra con soluzione di saccarosio all'1%.
- Dopo 1 ora di consumo gratuito, annota i volumi di soluzione di saccarosio e acqua consumata.
- Calcola la preferenza per il saccarosio.
- Usa la formula: preferenza per il saccarosio (%) = (Volume della soluzione di saccarosio consumato / Volume totale consumato) × 100%.
- Scambia le posizioni delle due bottiglie a metà del periodo di bevuta per eliminare il bias di posizione.
7. Test in campo aperto (OFT)
NOTA: Seleziona lo stesso lotto di ratti di ogni gruppo utilizzato per la FST a 2, 4 e 8 settimane. Digiunare e privare i ratti di acqua per 24 ore prima del test per mantenere condizioni fisiologiche costanti.
- Preparate l'apparato da campo aperto.
- Usa una scatola quadrata nera con il pavimento diviso in 25 griglie uguali.
- Tieni la sala test silenziosa e debolmente illuminata.
- Esegui il test.
- Metti ogni ratto nella griglia centrale della scatola e inizia un timer di 5 minuti.
- Registra l'attività orizzontale (numero di incroci a griglia con tre quarti delle zampe in una nuova griglia) e l'attività verticale (numero di schiene con due quarti delle zampe sollevate dal pavimento tramite osservazione manuale usando segnali portatili.
- Annota il tempo trascorso nelle griglie centrali e la frequenza di toelettatura (opzionale, per ulteriori approfondimenti comportamentali).
8. Test di nuoto forzato (FST)
NOTA: Seleziona lo stesso lotto di ratti di ogni gruppo utilizzato per la FST a 2, 4 e 8 settimane. Digiunare e privare i ratti di acqua per 24 ore prima del test per mantenere condizioni fisiologiche costanti.
- Prepara l'apparecchio di prova.
- Riempi un cilindro di vetro con una quantità adeguata d'acqua, assicurandoti che il livello dell'acqua sia sufficientemente alto da impedire al ratto di sostenersi toccando il fondo con i piedi.
- Regola la temperatura dell'acqua a 25 ± 1 °C.
- Esegui il test.
- Metti ogni ratto nel cilindro e lascialo nuotare per 5 minuti.
- Registra il tempo totale di immobilità durante i 5 minuti.
- Definisci 'immobilità' come il galleggiamento passivo (solo movimenti minimi per mantenere il muso sopra l'acqua) e 'attività' come remare con gli arti o graffiare il muro.
- Prendersi cura dei ratti dopo il test.
- Rimuovi il ratto dal cilindro dopo 5 minuti, asciugalo con un asciugamano e mettilo sotto una lampada riscaldante (30 ± 2 °C) per 30 minuti per prevenire l'ipotermia (Figura 5).
9. Analisi statistica
- Organizza i dati come media ± deviazione standard (media ± SD).
- Analizza i dati utilizzando il software SPSS versione 20.0.
- Prima di eseguire test parametrici, si testano i dati per la normalità (usando il test di Shapiro-Wilk) e l'omogeneità delle varianze (usando il test di Levene). I dati di ciascun gruppo conformano a una distribuzione normale e soddisfano l'omogeneità della varianza.
- Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA unidirezionale) per confrontare le medie campionarie tra gruppi, combinate con i test di differenza minima significativa (LSD) e Student-Newman-Keuls (SNK). Usa il test di Welch quando le varianze sono disuguali.
- Imposta la significanza statistica a p < 0,05.