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Articolo metodologico

Effetto della prescrizione di Yi-Nao-jie-Yu sulla depressione post-ictus nei ratti utilizzando l'occlusione dell'arteria cerebrale media combinata con la contenzione comportamentale

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DOI:

10.3791/69537

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9 gennaio 2026

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1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello ratto di depressione post-ictus (PSD) combinando l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) con stress cronico lieve, contenzione comportamentale e alloggio di isolamento, e la valutazione degli effetti terapeutici della prescrizione Yi-nao-jie-yu (YNJYP) tramite test comportamentali.

Abstract

La depressione post-ictus (PSD) è una complicanza comune e trattabile dell'ictus, caratterizzata da sintomi depressivi e somatici che compromettono il recupero e la qualità della vita del paziente. Questo studio descrive un protocollo che combina l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) con la contenzione comportamentale e l'isolamento per stabilire un modello PSD nel ratto, e valuta l'effetto terapeutico della prescrizione Yi-nao-jie-yu (YNJYP) sulla neurogenesi adulta nei ratti PSD. Per l'elaborazione del modello, i ratti nei gruppi ictus, PSD, fluoxetina cloridrato (FXT) e YNJYP sono stati sottoposti a MCAO: una sutura monofilamenta è stata avanzata dall'arteria carotide interna all'arteria cerebrale media (MCA) per 2 ore di ischemia, seguita da reperfusione. Dal giorno 7 post-MCAO, i ratti nei gruppi PSD, FXT e YNJYP sono stati custoditi in un singolo alloggio e trattenuti su una piattaforma a T personalizzata per 2 ore al giorno per 7 giorni. Le valutazioni comportamentali includevano il test del nuoto forzato (FST, per la disperazione), il test del consumo di saccarosio (SCT, per l'anedonia) e il test in campo aperto (OFT, per il comportamento esplorativo). A 4 e 8 settimane dall'ictus, i ratti PSD hanno mostrato un tempo di immobilità più lungo nella FST e una preferenza per il saccarosio inferiore nella SCT rispetto ai ratti ictus (P < 0,01). YNJYP ha invertito questi comportamenti depressivi (P < 0,01), con un'efficacia paragonabile a quella della FXT. Questo protocollo conferma la validità del modello PSD e il potenziale terapeutico di YNJYP, supportato da esperimenti rigorosi e analisi dei dati.

Introduzione

La depressione post-ictus (PSD) è una complicanza comune e curabile dell'ictus, che influisce significativamente sul processo di riabilitazione e sulla qualità della vita dei pazienti. I pazienti con PSD non solo soffrono di deficit funzionali fisici, ma affrontano anche disturbi mentali come basso umore e perdita di interesse. Questo ostacola notevolmente il recupero delle funzioni neurologiche e aumenta persino il tasso di mortalità. Attualmente, la patogenesi della PSD è complessa e coinvolge molteplici aspetti come la neurobiologia, lo squilibrio dei neurotrasmettitori e la risposta infiammatoria. C'è un urgente bisogno di esplorare a fondo metodi di intervento efficaci.

L'obiettivo generale di questo metodo è stabilire un modello di PSD su ratto affidabile e riproducibile che imiti da vicino la condizione umana combinando l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) con stress lieve cronico (CMS, principalmente contenzione comportamentale) e alloggio di isolamento, e utilizzare questo modello per valutare potenziali terapie come la prescrizione Yi-nao-jie-yu (YNJYP). La motivazione per lo sviluppo di questa tecnica deriva dalla necessità di integrare sia l'insulto ischemico iniziale sia lo stress psicologico cronico successivo, riconosciuti come componenti chiave nella patogenesi della PSD, in un unico modellostandardizzato 1,2,3. Rispetto a metodi alternativi, come quelli che si basano esclusivamente su ampi paradigmi CUMS, questo protocollo offre un approccio più focalizzato e replicabile impiegando una forma specifica di contenzione comportamentale progettata per simulare la restrizione di movimento spesso sperimentata dai pazienti con ictus 3,4,5.

Questo modello contribuisce alla più ampia letteratura sulla PSD fornendo un quadro dettagliato e pratico per indurre e valutare la PSD nei roditori, rispondendo alla necessità di standardizzazione nella ricerca preclinica. I ricercatori interessati a studiare gli effetti fisiopatologici combinati dell'ischemia cerebrale e dello stress post-ictus, o a selezionare interventi innovativi per la PSD, potrebbero trovare questo protocollo appropriato, poiché delinea procedure chiare per la creazione del modello, l'applicazione dello stress e la valutazione comportamentale.

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Protocollo

Il protocollo per lo studio sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Pechino. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione

  1. Ottenete 216 maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) senza patogeni specifici (SPF), con un peso di 300-320 g.
  2. Abituare i ratti all'ambiente abitativo per una settimana prima dell'esperimento.
    1. Mantieni le condizioni abitative a 23 ± 3 °C, 45% ± 5% di umidità e un ciclo di 12 ore luce e buio (luci accese alle 8:00 e spente alle 20:00).
    2. Ospitano cinque ratti per gabbia con accesso ad libitum a cibo e acqua standard sterili.
      NOTA: Minimizzare il numero di animali utilizzati e ridurre la sofferenza attraverso una maneggiamento delicato e procedure ottimizzate (ad esempio, contenzioni regolabili per prevenire la soppressione respiratoria).

2. Chirurgia dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)

NOTA: Questo passaggio descrive l'istituzione del modello MCAO/reperfusion (MCAO/R), modificato da Bederson et al.6.

  1. Preparate i ratti per l'intervento.
    1. Fai digiunare i ratti durante la notte (12 ore) prima dell'intervento (senza restrizione idrica).
    2. Anestesiare i ratti tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio all'1% (50 mg/kg).
      NOTA: Non sono stati somministrati ulteriori analgesici, poiché il pentobarbital sodio veniva usato esclusivamente come agente anestetico.
      ATTENZIONE: Il pentobarbital sodico è un anestetico controllato. Maneggiare in una cappa aspirante, indossare guanti e occhiali protettivi e conservare in un armadietto chiuso a chiave secondo le normative istituzionali.
  2. Mettere in sicurezza e preparare il sito chirurgico.
    1. Posiziona i ratti anestetizzati in posizione supina e sistema gli arti.
    2. Radere il pelo del collo e disinfettare la pelle con un disinfettante appropriato (ad esempio, etanolo al 75%).
  3. Espone e prepara i vasi del collo.
    1. Fai un'incisione mediana di 2-3 cm nella pelle del collo, poi seziona in modo diretto ghiandole sottocutanee e fascia. Separare l'arteria carotide comune (CCA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA), che sono formate dai rami della CCA.
    2. Individua il CCA, posiziona due suture sotto di esso come riserva, lega uno vicino all'estremità del cuore e lega un nodo vivo vicino alla biforcazione del CCA con l'altro.
    3. Usa una pinza arteriosa per chiudere l'estremità distale della CCA vicino alla biforcazione.
    4. Individua l'ECA e legala con una sutura.
  4. Inserisci la sutura per occludere l'MCA.
    1. Incidi con cura un'incisione sulla parete tra il sito di legatura dell'estremità prossimale della CCA e il punto di clampaggio della clip dell'arteria, poi inserisci un plug filettatore speciale (sutura monofilamento) in questa incisione.
    2. Apri la clip arteriosa e inserisci il tappo filettatore nell'ICA dalla forcella finché non si percepisce una leggera resistenza, poi fermati (Figura 1).
      NOTA: La lunghezza della sutura (18 mm ± 2 mm) è fondamentale per un'occlusione costante dell'MCA; Regola leggermente in base al peso del ratto (300-320 g).
  5. Indurre ischemia e reperfusione.
    1. Mantieni l'ischemia per 2 ore (rigorosamente cronometrato con un cronometro).
    2. Dopo 2 ore, estrai delicatamente il punto per ripristinare il flusso sanguigno MCA, taglia il punto in eccesso e rimuovi la clip arteriosa.
  6. Chiudi il sito chirurgico e monitora il recupero.
    1. Irrigare l'incisione con soluzione salina sterile, poi sutura il tessuto sottocutaneo e la pelle.
    2. Mettere i ratti in una gabbia di recupero (mantenuta a 25 ± 1 °C) fino a quando non riprendono conoscenza; monitorare per emorragie o disturbi per 24 ore.
  7. Istituire il gruppo operativo finto.
    1. Esegui la stessa dissezione del collo ed esposizione dei vasi dei passaggi 2.1-2.3.
    2. Inserire la sutura nel CCA per soli 5 mm, poi rimuoverla immediatamente; Sutura l'incisione senza occlusione MCA.

3. Raggruppamento degli animali

  1. Dividere casualmente i ratti in sei gruppi (n = 36 per gruppo inizialmente) per il punteggio neurologico.
    1. Gruppo ictus: solo MCAO, nessuna contenzione comportamentale o trattamento farmacologico.
    2. Gruppo PSD: MCAO + contenzione comportamentale + isolamento alloggio, nessun trattamento farmacologico.
    3. Gruppo FXT: MCAO + contenzione comportamentale + alloggio isolante + gavage di fluoroxetina cloridrato.
    4. Gruppo YNJYP: MCAO + contenzione comportamentale + alloggio isolato + Yi-nao-jie-yu prescrizione (YNJYP) di gavage.
    5. Gruppo vuoto: nessuna operazione eseguita.
    6. Gruppo operatorio fittizio: nessuna ostruzione dell'arteria cerebrale media.
  2. Escludere i ratti con punteggi di 0 o 4 o quelli che sono morti dopo l'intervento.
    1. Eseguire il punteggio neurologico Longa7 24 ore dopo MCAO per selezionare i ratti qualificati.
    2. Usa la scala di Longa a 5 punti: 0 = nessun deficit; 1 = flessione dell'arto anteriore quando sollevata dalla coda; 2 = camminata circolare verso il lato paretico; 3 = cadere verso il lato paretico; 4 = incoscienza o incapacità di camminare.

4. Somministrazione di fluoxetina cloridrato (FXT) e YNJYP

  1. Prepara YNJYP e FXT.
    NOTA: YNJYP contiene sei materiali medicinali cinesi: Ciwujia (radici di Acanthopanax senticosus ) 30 g, Yujin (rizomi di Curcuma longa ) 10 g, Wuweizi (frutti di Schisandra chinensis ) 15 g, Zhizi (frutti di Gardenia jasminoides ) 10 g, Danshen (radici di Salvia miltiorrhiza ) 15 g e Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong rizomi) 15 g (forniti dal Dipartimento di Farmacia, Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Pechino). Sulla base di studiprecedenti 8, la dose di somministrazione intragastrica è stata determinata in 9,92 g/(kg·g).
    1. Sciogliere le capsule di cloridrato di fluoxetina in acqua distillata per ottenere una concentrazione di 0,233 g/L quando vengono utilizzate. Basandosi sulla dose per adulti moltiplicata per sette, imposta la dose per i ratti a 2,33 mg/(kg·d).
  2. Somministrare farmaci tramite gavage.
    1. Inizia il Gavage dal primo giorno post-MCAO e prosegui fino alla fine dell'esperimento, con la procedura eseguita costantemente al mattino in tutti i gruppi.
    2. Somministrare la FXT al gruppo FXT a 2,33 mg/(kg·g) al giorno, YNJYP al gruppo YNJYP a 9,92 g/(kg·g) e allo 0,9% di soluzione fisiologica normale (10 mL/kg) ai gruppi ictus e PSD.
      NOTA: Usa un ago da 1 mL; Assicurati che l'ago venga inserito nello stomaco (non nella trachea) per evitare l'aspirazione.

5. Stress cronico lieve (restrizione comportamentale) combinato con isolamento abitativo

  1. Inizia la contenzione comportamentale e l'isolamento al settimo giorno post-MCAO (per evitare la fase acuta di ictus).
  2. Prepara la piattaforma di contenimento personalizzata a forma di T.
    1. La piattaforma è composta da una base (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) e un'area di contenimento (22 cm × 6,6 cm).
    2. L'area di contenzione contiene fessure per fissare la testa e gli arti del ratto e tre cinghie regolabili per adattarsi a diverse dimensioni di ratti (Figura 2, Figura 3 e Figura 4).
      NOTA: La piattaforma è stata modificata da Chen3 e Tian4, con slot aggiunti per gli arti anteriori per simulare la postura paretica dei pazienti con ictus.
  3. Esegui la contenzione quotidiana.
    1. Seleziona casualmente una finestra di 2 ore ogni giorno (ad esempio, 9:00-11:00 o 14:00-16:00) per evitare il bias circadiano.
    2. Fissare ogni ratto alla piattaforma usando le fessure e le cinghie; Regola la tensione per evitare difficoltà ma non la soppressione respiratoria.
    3. Mantieni la contenzione per 2 ore consecutive per 7 giorni consecutivi.
  4. Topi domestici in isolamento.
    1. Trasferire i ratti nei gruppi PSD, FXT e YNJYP dagli alloggi di gruppo (cinque ratti per gabbia) a gabbie singole all'inizio della contenzione comportamentale.
    2. Mantenere alloggi singoli fino al completamento della contenzione comportamentale (dopo MCAO giorno 14).

6. Test del consumo di saccarosio (SCT)

NOTA: Seleziona casualmente sei ratti di ogni gruppo a 2, 4 e 8 settimane dopo l'MCAO. Testare tutti i ratti nell'ordine SCT, OFT e FST.

  1. Prepara i topi per il test.
    1. Digiunare e privare i ratti dell'acqua per 24 ore prima del test.
    2. Assicurati che la temperatura della stanza di prova (23 ± 2 °C) e l'illuminazione corrispondano all'ambiente dell'alloggiamento.
  2. Esegui il test.
    1. Posiziona due bottiglie (da 150 mL ciascuna) in ogni gabbia: una contenente acqua del rubinetto e l'altra con soluzione di saccarosio all'1%.
    2. Dopo 1 ora di consumo gratuito, annota i volumi di soluzione di saccarosio e acqua consumata.
  3. Calcola la preferenza per il saccarosio.
    1. Usa la formula: preferenza per il saccarosio (%) = (Volume della soluzione di saccarosio consumato / Volume totale consumato) × 100%.
    2. Scambia le posizioni delle due bottiglie a metà del periodo di bevuta per eliminare il bias di posizione.

7. Test in campo aperto (OFT)

NOTA: Seleziona lo stesso lotto di ratti di ogni gruppo utilizzato per la FST a 2, 4 e 8 settimane. Digiunare e privare i ratti di acqua per 24 ore prima del test per mantenere condizioni fisiologiche costanti.

  1. Preparate l'apparato da campo aperto.
    1. Usa una scatola quadrata nera con il pavimento diviso in 25 griglie uguali.
    2. Tieni la sala test silenziosa e debolmente illuminata.
  2. Esegui il test.
    1. Metti ogni ratto nella griglia centrale della scatola e inizia un timer di 5 minuti.
    2. Registra l'attività orizzontale (numero di incroci a griglia con tre quarti delle zampe in una nuova griglia) e l'attività verticale (numero di schiene con due quarti delle zampe sollevate dal pavimento tramite osservazione manuale usando segnali portatili.
    3. Annota il tempo trascorso nelle griglie centrali e la frequenza di toelettatura (opzionale, per ulteriori approfondimenti comportamentali).

8. Test di nuoto forzato (FST)

NOTA: Seleziona lo stesso lotto di ratti di ogni gruppo utilizzato per la FST a 2, 4 e 8 settimane. Digiunare e privare i ratti di acqua per 24 ore prima del test per mantenere condizioni fisiologiche costanti.

  1. Prepara l'apparecchio di prova.
    1. Riempi un cilindro di vetro con una quantità adeguata d'acqua, assicurandoti che il livello dell'acqua sia sufficientemente alto da impedire al ratto di sostenersi toccando il fondo con i piedi.
    2. Regola la temperatura dell'acqua a 25 ± 1 °C.
  2. Esegui il test.
    1. Metti ogni ratto nel cilindro e lascialo nuotare per 5 minuti.
    2. Registra il tempo totale di immobilità durante i 5 minuti.
    3. Definisci 'immobilità' come il galleggiamento passivo (solo movimenti minimi per mantenere il muso sopra l'acqua) e 'attività' come remare con gli arti o graffiare il muro.
  3. Prendersi cura dei ratti dopo il test.
    1. Rimuovi il ratto dal cilindro dopo 5 minuti, asciugalo con un asciugamano e mettilo sotto una lampada riscaldante (30 ± 2 °C) per 30 minuti per prevenire l'ipotermia (Figura 5).

9. Analisi statistica

  1. Organizza i dati come media ± deviazione standard (media ± SD).
  2. Analizza i dati utilizzando il software SPSS versione 20.0.
  3. Prima di eseguire test parametrici, si testano i dati per la normalità (usando il test di Shapiro-Wilk) e l'omogeneità delle varianze (usando il test di Levene). I dati di ciascun gruppo conformano a una distribuzione normale e soddisfano l'omogeneità della varianza.
    1. Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA unidirezionale) per confrontare le medie campionarie tra gruppi, combinate con i test di differenza minima significativa (LSD) e Student-Newman-Keuls (SNK). Usa il test di Welch quando le varianze sono disuguali.
  4. Imposta la significanza statistica a p < 0,05.

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Risultati

In questo studio sono stati creati in totale 5 gruppi sperimentali per la rilevazione rilevante. Dopo l'analisi statistica dei dati comportamentali di ciascun gruppo di ratti, è emerso che alla quarta settimana dell'esperimento, il tempo di immobilità dei ratti del gruppo PSD nella FST era significativamente aumentato rispetto a quelli del gruppo ictus, e la differenza tra i due gruppi era statisticamente significativa (P < 0,01); allo stesso tempo, la preferenza di saccarosio dei ratti ...

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Discussione

Nel processo di costruzione del modello di ischemia cerebrale del ratto, esistono vari metodi di modellazione, tra cui il metodo della legatura, la craniotomia, il metodo dell'asfissia e il metodo dell'occlusione con filo. Rispetto ai tre metodi di modellazione: legatura, craniotomia e asfissia, il metodo dell'occlusione a filo mostra vantaggi significativi e unici. Questi vantaggi risiedono principalmente in tre aspetti chiave: la natura minimamente invasiva del funzionamento, la precis...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Yuankai Su e Yonghao Sun scrissero il manoscritto, inclusa l'interpretazione dei risultati e la sezione di discussione. Huiling Tian ha condotto gli esperimenti e analizzato i dati. Ning Ding e Xin Wang esaminarono il manoscritto. Zitong Yang e Jingyao Zhao hanno dato contributi alla ricerca dei dati.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Maschi adulti di ratti Sprague-DawleyVital River Laboratory Animal Technology, Pechino, CinaNo. SCXK2012-0001300– 320 g
Capsule di cloridrato di fluoxetinaPatheon Francia, Jiangsu, Cina0943A
Granuli di YNJYPil Dipartimento di Farmacia, Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di PechinoFatti in casa
Scatola aperta per test in campo apertoFatti in casa -
Pentofenobarbital sodioSigma Corporation of AmericaP3761-5
Il filo dell'occlusioneBeijing Shadong Biotechnology Co., Ltd2838-A4
Serbatoio d'acqua per l'esperimento di nuoto forzatoFatti in casa -

Riferimenti

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