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Articolo di ricerca

Meccanismo della decoczione di Jianpi Shengxue nell'alleviare la mielosoppressione indotta da ciclofosfamide nei topi

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DOI:

10.3791/69542

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2 gennaio 2026

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo chiarisce sistematicamente come la decoction di Jianpi Shengxue mitighi la mielosoppressione indotta da ciclofosfamide attraverso un approccio integrato di farmacologia di rete e esperimenti su animali, rivelando i suoi meccanismi multi-bersaglio e il potenziale come terapia adiuvante.

Abstract

L'articolo mira a indagare come il Decocto Jianpi Shengxue (JPSXD) allevia la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia attraverso la farmacologia di rete e esperimenti sugli animali. Per fare ciò, sono stati analizzati componenti chiave e bersagli, e sono state costruite reti di interazione proteica-proteina (PPI) e reti erba-componente-bersaglio. Gene Ontology (GO) e l'arricchimento della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) hanno identificato le principali vie di lavoro. Un modello di mielosoppressione indotto da ciclofosfamide (CTX) è stato stabilito in 60 topi C57/BL6. JPSXD è stato somministrato a dosi diverse per 7 giorni. Sono stati valutati i globuli ematici periferici, le citochine (trombopoietina [TPO], eritropoietina [EPO], fattore stimolante della colonia granulociti-macrofagi [GM-CSF]), indice del timo, morfologia del midollo osseo, cellule CD34+ e espressione di AKT1, JAK2 ed EGFR. L'analisi di rete ha identificato 172 composti e 454 bersagli, evidenziando i percorsi PI3K-Akt e JAK-STAT. In vivo, CTX ha ridotto i livelli di leucociti e proteine di segnalazione, mentre JPSXD ha ripristinato i conteggi, aumentato AKT1, JAK2 ed EGFR, e migliorato l'indice timo (p < 0,05). JPSXD a dosi medie e alte ha aumentato TPO, EPO, GM-CSF, CD34+ e migliorato la struttura del midollo osseo, con la dose elevata che ha mostrato l'effetto più forte. In conclusione, JPSXD allevia la mielosoppressione tramite la regolazione multi-bersaglio e multi-percorso, supportando il suo potenziale come terapia aggiuntiva per la leucopenia indotta dalla chemioterapia.

Introduzione

La chemioterapia è una pietra miliare nel trattamento di varie neoplasie, principalmente inibendo la proliferazione e la sopravvivenza delle celluletumorali 1,2, estendendo così la sopravvivenza del paziente. Tuttavia, a causa della mancanza di selettività nel colpire i tessuti normali, i farmaci chemioterapici spesso causano gravi danni alle cellule e ai tessuti sani, portando a una serie di effetti avversi3. Uno degli effetti collaterali più comuni e gravi della chemioterapia è la mielosoppressione, caratterizzata da una riduzione della produzione di globuli del sangue, inclusi globuli bianchi (GBC), globuli rossi (RBC) e piastrine (PLT)2,4. La mielosoppressione compromette gravemente il sistema di difesa immunitaria, aumentando il rischio di infezioni, sanguinamento, anemia e altre complicazioni. Riduce inoltre significativamente la qualità della vita dei pazienti e può persino essere pericolosa per lavita 5. Pertanto, alleviare e prevenire la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia è fondamentale per migliorare la tolleranza dei pazienti alla chemioterapia e la sopravvivenza complessiva.

I trattamenti clinici attuali per la mielosoppressione coinvolgono principalmente fattori di crescita ematopoietici come fattore stimolante delle colonie di granulociti [G-CSF], eritropoietina [EPO]) e la terapiatrasfusionale 6,7. Tuttavia, questi approcci sono spesso associati a costi elevati, potenziali effetti collaterali e un'efficacia limitata. Di conseguenza, esplorare metodi più sicuri ed efficaci per prevenire e alleviare la mielosoppressione rimane un importante focus di ricerca. Negli ultimi anni, la medicina tradizionale cinese (MTC) ha attirato notevole attenzione per il suo ruolo nel trattamento del cancro e nella gestione degli effetti collaterali indotti dallachemioterapia 8,9. Molte formulazioni di MTC si ritiene abbiano effetti tonificanti e immunoregolatori, come il decocto Shengxuebao10, le compresse Dihuang Shengbai11 e i composti ginsenosidi12, che non solo proteggono le cellule normali e riducono gli effetti collaterali tossici, ma aumentano anche l'efficacia antitumorale.

Il Decocto Jianpi Shengxue (JPSXD) è una formula classica della MTC che esemplifica i principi terapeutici per tonificare il Qi e nutrire ilsangue 13. Questa formula è una modifica sofisticata del Decocto Sijunzi combinato con Er Zhi Wan, che integra gli effetti sinergici di più erbe per affrontare la carenza di Qi esangue 14. La formula comprende ginseng (Ren Shen), astragolo (Huang Qi), epimedium (Yin Yang Huo), atractylodes (Bai Zhu), igname (Shan Yao), salvia (Dan Shen), rehmannia preparata (Shu Di Huang), semi di dodder (Tu Si Zi), lupo di baca (Gou Qi Zi), ligustrum (Nv Zhen Zi), angelica (Dang Gui), orzo fritto (Chao Mai Ya), venterella di pollo fritto (Chao Ji Nei Jin), buccia di mandarino secca (Chen Pi), semi di coix (Yi Yi Ren) e diverse altre erbe aromatiche. Ogni erba svolge un ruolo specifico nella formula, aderendo al principio della MTC di erbe sovrane, ministra, assistente e guida, garantendo un effetto terapeutico equilibrato e mirato.

La Decoczione Sijunzi, una formula fondamentale della MTC, è rinomata per la sua capacità di tonificare il Qi e rafforzare la milza. È stato ampiamente utilizzato per trattare condizioni associate a Qi e carenza di sangue, come stanchezza, scarso appetito e immunità indebolita. Studi farmacologici moderni hanno dimostrato che la Decoction di Sijunzi migliora la funzione immunitaria, promuove l'ematopoiesi e migliora le capacità di auto-riparazionedell'organismo. Sulla base di questa base, JPSXD incorpora erbe aggiuntive per migliorare ulteriormente la sua efficacia nel nutrire il sangue e affrontare carenze più complesse. Ad esempio, rehmannia e angelica preparate sono erbe chiave che nutrono il sangue17, mentre astragolo e ginseng agiscono sinergicamente per aumentare il Qi e migliorare la vitalitàcomplessiva 18.

Studi recenti hanno evidenziato i potenziali effetti antitumorali del JPSXD, suggerendo che il suo approccio multi-componente e multi-bersaglio possa inibire la crescita tumorale e aumentare l'efficacia dei trattamenti convenzionali controil cancro 19,20. La capacità della formula di modulare le risposte immunitarie e migliorare la funzione ematopoietica la rende particolarmente preziosa nel supportare i pazienti sottoposti a chemioterapia o radioterapia, che spesso sperimentano carenza di Qi e sangue come effetto collateraledel trattamento 21. Inoltre, l'inclusione di erbe come salvia ed epimedium ha dimostrato migliorare la microcircolazione e migliorare i meccanismi di riparazione cellulare, contribuendo ai benefici terapeutici complessivi dellaformula 22.

Studi farmacologici moderni hanno dimostrato che ogni singola erba in JPSXD possiede attività farmacologiche legate alla funzione ematopoietica, all'anti-mielosoppressione, all'immunomodulazione e all'antiossidazione, nonché al miglioramento microcircolatorio, fornendo supporto indiretto alla ricerca per l'uso di JPSXD nell'alleviamento della mielosoppressione indotta dalla chemioterapia. La Tabella 1 riassume gli effetti farmacologici principali di ciascuna erba insieme ai relativi riferimenti, con particolare attenzione agli studi che indagano l'ematopoiesi, l'attività antimielosoppressiva, l'immunomodulazione e le proprietà antiossidative o mielosoppressive. La complessa sinergia dei componenti in JPSXD coinvolge sia interazioni cooperative che antagoniste tra le erbe, mirando a molteplici vie per ottenere un effetto terapeutico olistico. Ad esempio, mentre ginseng e astragolo lavorano insieme per tonificare il Qi, salvia e rehmannia preparata collaborano per nutrire il sangue e migliorare la circolazione. Allo stesso tempo, erbe come la buccia di mandarino essiccata e l'orzo fritto aiutano a regolare la digestione e a prevenire la stagnazione, assicurando che gli effetti tonificanti della formula vengano efficacemente assorbiti e utilizzati dal corpo23. Questo approccio multifaccettato si allinea con la filosofia della MTC che cerca di trattare la causa principale della malattia affrontandone i sintomi.

In conclusione, JPSXD è una formula di MTC ben bilanciata e scientificamente supportata che incarna i principi del Qi e della disintossicazione del sangue. Le sue potenziali applicazioni nel rafforzare l'immunità, promuovere l'ematopoiesi e supportare la terapia antitumorale lo rendono un'aggiunta preziosa sia alle pratiche mediche tradizionali che moderne. Tuttavia, mancano prove cliniche di alta qualità che valutino direttamente l'efficacia del JPSXD nell'alleviare la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarirne i meccanismi sottostanti e ottimizzare le strategie di applicazione clinica. Pertanto, questo studio mira a fornire una prova di concetto dei potenziali effetti terapeutici del JPSXD da una prospettiva meccanicistica preclinica.

La farmacologia di rete, con la sua natura sistemica e integrativa, è stata ampiamente utilizzata per identificare gli ingredienti attivi dei medicinali cinesi e chiarire i loro meccanismi d'azione24,25. In questo studio, la farmacologia di rete è stata impiegata per analizzare le potenziali vie di segnalazione e i principali target colpiti dal JPSXD nel contesto della mielosoppressione. Inoltre, è stato stabilito un modello murino mielosoppressore indotto da ciclofosfamide (CTX) per valutare indicatori rilevanti e valutare gli effetti di JPSXD sulla mielosoppressione. È stata inoltre condotta una validazione preliminare dei principali target e delle vie identificate tramite la farmacologia della rete. Questo è il primo studio a integrare sistematicamente la farmacologia di rete con esperimenti su animali per chiarire il meccanismo molecolare con cui JPSXD allevia la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia attraverso la regolazione multi-bersaglio delle vie di segnalazione, come la via PI3K-AKT, colmando così una lacuna nella comprensione meccanicistica degli effetti protettivi ematopoietici di questa formula composta.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con il Regolamento sull'Amministrazione degli Animali da Laboratorio e le linee guida etiche del Centro Sperimentale per Animali dell'Ospedale Oncologico di Hunan. Il protocollo dello studio è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale del Cancro di Hunan (N.º di approvazione: KNZY-202416). Durante tutto lo studio, i ricercatori hanno fatto ogni sforzo per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e alleviare la loro sofferenza.

Preparazione degli animali
Un totale di 60 maschi di topi C57/BL6 di 10 settimane sono stati ottenuti dalla Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Licenza: SCXK [Hu] 2021-0002). Tutti i topi sono stati ospitati presso l'Experimental Animal Center dell'Ospedale Oncologico di Hunan in condizioni ambientali controllate: temperatura: 23 ± 2 °C, umidità: 50% ± 10%, e ciclo di 12 ore luce/buio (8:30-20:30). I topi avevano accesso ad libitum a cibo e acqua. Prima della sperimentazione, venivano abituati all'ambiente tramite una maneggiamento quotidiano di 5 minuti in un periodo di 3 giorni. Dopo l'acclimatazione, tutti e 60 i topi sono stati stratificati per peso corporeo e assegnati casualmente in sei gruppi (n = 10 per gruppo) utilizzando una tabella dei numeri casuali generata al computer. I gruppi includevano: controllo a vuoto, modello, controllo salino normale (NS), JPSXD ad alta dose (40 mg/kg), JPSXD a dose media (30 mg/kg) e a bassa dose JPSXD (20 mg/kg). Il processo di randomizzazione ha garantito che non si siano verificate differenze significative nel peso corporeo medio tra i gruppi (p > 0,05). La sequenza di randomizzazione è stata generata ed eseguita da ricercatori non coinvolti in procedure sperimentali successive per minimizzare il bias.

Preparazione dei materiali
Sicurezza e smaltimento dei rifiuti: Questo studio ha coinvolto il CTX, un agente chemioterapeutico altamente tossico. Tutte le procedure sono state condotte in rigorosa conformità con il Regolamento sulla Gestione della Sicurezza delle Sostanze Chimiche Pericolose e gli standard di laboratorio di Livello 2 di Biosicurezza. Le precauzioni specifiche includevano l'uso di abbigliamento protettivo usa e getta, guanti in nitrilo, respiratori N95 e occhiali protettivi da parte di tutto il personale. La preparazione e la somministrazione del CTX venivano eseguite all'interno di un armadietto di biosicurezza di Classe II. La preparazione della soluzione di iniezione CTX è stata effettuata in una cappa con strumenti dedicati per prevenire la formazione di aerosol. Oggetti taglienti e contaminati con CTX, come siringhe e guanti, venivano scartati in contenitori per oggetti taglienti a prova di perforazione. Altri materiali contaminati (ad esempio, lettiera, tessuti animali) sono stati inattivati per immersione in ipoclorito di sodio al 10% per 24 ore e successivamente inceneriti da un fornitore certificato di smaltimento dei rifiuti medici. In caso di fuoriuscita di CTX, l'area veniva immediatamente coperta con cotone assorbente e neutralizzata con una soluzione di tiosolfato di sodio all'1%. L'incidente è stato poi segnalato al supervisore della sicurezza.

Farmaci e reagenti: l'iniezione CTX è stata ottenuta da Baxter Oncology GmbH, Germania (Lotto n.: HJ20160467). Il JPSXD è stato preparato dal Dipartimento di Medicina Tradizionale Cinese dell'Ospedale Oncologico di Hunan. Era composta da 15 erbe tradizionali — Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, malto fritto, rivestimento di bagciglia di pollo, buccia di mandarino essiccato e semi di Coix — combinate secondo i rapporti classicidi compatibilità 20. Il decocto è stato concentrato fino a una concentrazione finale di 3 kg/L (cioè 3 g/mL). Prima del magave, il concentrato veniva diluito con NS per raggiungere le concentrazioni richieste per ciascun gruppo dosificante: 4 mg/mL per il gruppo ad alta dose (40 mg/kg), 3 mg/mL per il gruppo a dosi medie (30 mg/kg) e 2 mg/mL per il gruppo a bassa dose (20 mg/kg)26. Il volume di gavage è stato calcolato come 0,1 mL ogni 10 g di peso corporeo, risultando in un volume finale di somministrazione di 0,2-0,25 mL per topo (basato su un intervallo di peso di 20-25 g)27.

Kit ELISA: Sono stati utilizzati kit ELISA disponibili commercialmente per fattore stimolante di colonie di granulociti e macrofagi (GM-CSF), EPO e trombopoietina (TPO) del muro. I campioni di siero sono stati diluiti 1:5 in PBS buffer (pH 7,4) prima del test. Gli standard furono riorganizzati a 100 μL per pozzo.

Anticorpo secondario: l'IgG anti-coniglio di capra coniugato con HRP è stato diluito 1:5000 (concentrazione finale: 0,04 μg/mL) in un tampone TBST contenente il 5% di latte secco scremato e lo 0,05% Tween-20. La soluzione è stata preparata frescamente e incubata a temperatura ambiente per 1 ora.

Anticorpi primari per il Western blot: GAPDH (policlonale del coniglio), AKT (policlonale del coniglio), JAK2 (monoclonale del coniglio) ed EGFR (monoclonale del topo). Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in un tampone TBST contenente il 5% di BSA: GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) ed EGFR (1:800). Il volume di incubazione era di 100 μL per membrana.

Fissatore tissutale: Una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% è stata preparata sciogliendo la polvere di PFA in PBS (pH 7,4). I tessuti sono stati fissati per 24 ore su 24.

Soluzione di colorazione di ematossilina ed eosina (H&E): Soluzione di ematossilina (0,1% di ematossilina Harris) e soluzione di eosina Y (0,5%) sono state preparate secondo i protocolli patologicistandard 28. Le durate della colorazione sono state di 5 minuti per l'ematossilina e 3 minuti per l'eosina.

Buffer bloccante dell'immunofluorescenza: per il blocco è stato utilizzato un buffer PBS contenente il 10% di siero di capra e l'1% di BSA, con incubazione di 30 minuti.

Tampone di diluizione degli anticorpi per l'immunofluorescenza: Gli anticorpi primari (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) per l'immunofluorescenza sono stati diluiti in un buffer PBS contenente l'1% di BSA, seguendo il rapporto di diluizione raccomandato dal produttore (1:200), ottenendo una concentrazione finale di 2,5 μg/mL. Il volume di incubazione era di 50 μL per sezione tissutale.

Induzione di un modello animale
60 topi sono stati divisi casualmente in sei gruppi (n = 10 per gruppo): controllo vuoto, modello, alta dose, media dose, bassa dose e NS controllo. Ad eccezione del gruppo di controllo a vuoto, tutti i topi hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di CTX (20 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni consecutivi per stabilire un modello mielosoppressore. Tutti i topi modello hanno mostrato < globuli globuli (WB) di 1,8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L e una riduzione del >55% delle cellule nucleate del midollo osseo a 24 ore dopo l'iniezione finale. Questo protocollo è in linea con i modelli consolidati di mielosoppressione indottada CTX 29,30. Dopo l'iniezione, i topi venivano monitorati quotidianamente per verificare le condizioni generali, inclusi il livello di attività, l'aspetto del mantello e le variazioni del peso corporeo. Dall'inizio della modellazione fino alla fine dell'esperimento, il peso corporeo veniva registrato alla stessa ora ogni giorno tramite una bilancia elettronica. Il tasso di variazione del peso corporeo è stato calcolato come segue: (peso finale / peso iniziale) x 100%, per valutare lo stato fisiologico generale e il potenziale effetto protettivo del JPSXD. Dopo l'iniezione, i topi venivano ospitati in gabbie ventilate singolarmente (IVC), ciascuna chiaramente etichettata come contaminata da CTX. La biancheria veniva cambiata ogni 2 giorni e tutta la biancheria usata veniva smaltita in conformità con i protocolli sui rifiuti pericolosi descritti sopra.

Somministrazione intragastrica
I topi nei gruppi ad alta, media e bassa dose hanno ricevuto JPSXD tramite gavage a dosi rispettivamente di 40 mg/kg, 30 mg/kg e 20 mg/kg. Il gruppo di controllo salino ricevette un volume uguale di NS. Le soluzioni Gavage sono state preparate a concentrazioni rispettivamente di 4 mg/mL, 3 mg/mL e 2 mg/mL, e somministrate a un volume di 0,1 mL ogni 10 g di peso corporeo. Tutti i topi sono stati colpiti 2 volte al giorno per 7 giorni consecutivi. Il gruppo di controllo salino ha ricevuto 0,2-0,25 mL per topo di NS. Non è stato somministrato alcun trattamento ai gruppi blank e modello. L'assenza di tosse o difficoltà durante il maneggio indicava una corretta procedura di somministrazione.

Raccolta del sangue e preparazione del siero
Ilterzo giorno dopo l'iniezione di CTX, sono stati raccolti 0,2 mL di sangue dalla vena caudale per valutare il successo dell'istituzione del modello misurando il conteggio delle cellule del sangue periferico utilizzando un analizzatore ematologico completamente automatizzato. A 24 ore dopo l'ultimo ciclo di JPSXD, è stato raccolto sangue dal seno orbitale di topi selezionati casualmente (n = 10 per gruppo). Una parte del sangue veniva utilizzata per un'analisi completa dei conteologi, mentre il resto veniva elaborato per la preparazione del siero. I campioni sono stati centrifugati a 3.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Il soprandanante (uno strato superiore trasparente, giallo pallido) veniva raccolto come siero e allicito per la conservazione a -80 °C per successivi test ELISA e test di funzionalità epatica/renale. Lo strato siero è stato osservato chiaramente separato dallo strato delle cellule del sangue, senza segni di emolisi o torbidità. I parametri ematologici misurati includevano i livelli di GLB, RBC, PLT e emoglobina (Hb).

Valutazione della funzionalità epatica e renale
Un analizzatore biochimico completamente automatizzato è stato utilizzato per misurare i marcatori della funzione epatica sierica — alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) — e i marcatori della funzione renale — azoto ureico nel sangue (BUN) e creatinina (Cre). Tutte le procedure seguivano il protocollo operativo standard dello strumento. In particolare, 100 μL di siero sono stati miscelati con i relativi kit di analisi (ALT, AST, BUN e Cre) e incubati a 37 °C per 5 minuti. L'assorbanza è stata misurata a 340 nm. Ogni campione è stato testato in duplicato e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi.

Calcolo dell'indice dell'organo
A 24 ore dall'ultima somministrazione con goffa di JPSXD, i topi sono stati soppressi con inalazione graduale di anidride carbonica (CO2) (portata di portata: 20% volume camerale/minuto) seguita da una lussazione cervicale come metodosecondario 31. Immediatamente dopo l'eutanasia, fegato, reni, milza e timo sono stati prelevati asetticamente attraverso un'incisione ventrale della linea mediana. Gli organi venivano delicatamente sezionati liberi dai tessuti connettivi e dal grasso circostanti, poi risciacquati con soluzione salina normale gelida (NS) per rimuovere il sangue residuo. Gli organi venivano asciugati con carta filtrante pre-pesata a pressione standardizzata (3 presse delicate) e pesati immediatamente su una bilancia elettronica calibrata (accuratezza: ±0,1 mg) a temperatura ambiente (22 ± 1°C).

Tutte le procedure venivano eseguite su un vassoio in acciaio inox pre-raffreddato per minimizzare l'autolisi. L'indice degli organi è stato calcolato come peso dell'organo (mg) diviso per il peso corporeo (g) per valutare gli effetti del JPSXD sugli organi principali. Porzioni di ciascun tessuto sono state riservate all'analisi Western blot, mentre i campioni rimanenti sono stati fissati in PFA al 4% per una successiva valutazione istologica.

ELISA
Le concentrazioni sieriche di TPO, EPO e GM-CSF sono state misurate utilizzando kit ELISA secondo le istruzioni del produttore. Tutti i passaggi di centrifugazione, inclusi il lavaggio del campione e la ricostituzione dei reagenti, sono stati eseguiti a temperatura ambiente a 1.000 x g per 5 minuti. I passaggi di lavaggio sono stati eseguiti utilizzando il tampone PBST (PBS contenente 0,05% Tween-20), con 300 μL di soluzione di lavaggio aggiunti per pozzo e ripetuti 3 volte. Dopo il lavaggio, non rimaneva alcun liquido residuo sul fondo dei pozzi. Dopo lo sviluppo del colore, era visibile un precipitato blu distinto. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche dopo la fine della reazione.

Colorazione H&E
Dopo l'eutanasia, sono stati prelevati il timo e il femore. Il timo veniva pesato per calcolare l'indice del timo (peso del timo [mg]/peso corporeo [g]). Dopo la pesata, parte del timo è stata utilizzata per l'analisi Western blot, mentre il resto, insieme al femore, è stato fissato al 4% di PFA. I campioni di femore sono stati sottoposti a disidratazione con etanolo classificato (70%, 80%, 95% e 100%, ciascuno per 1 ora). La corretta disidratazione era indicata da un aspetto uniformemente bianco, senza ammorbidimento o deformazione. I blocchi tissulari incorporati in paraffina sono stati sezionati a 4 μm di spessore utilizzando un microtomo rotante dotato di lame di carburo di tungsteno ad alta precisione (Tipo H31). Le sezioni venivano fatte galleggiare su un bagno d'acqua a 40 °C contenente soluzione di gelatina allo 0,5% per eliminare le rughe, quindi montate su vetrine al microscopio. Tutte le sezioni hanno mostrato morfologia intatta, bordi lisci e trasparenza uniforme sotto microscopia fotografica, confermando una qualità ottimale di sezionamento. È stata eseguita una colorazione H&E, seguita dal montaggio con un mezzo di montaggioacquoso 28. Dopo la colorazione, i nuclei apparivano blu e il citoplasma rosa, con un'architettura cellulare ben definita sotto osservazione microscopica tramite microscopio al microscopio invertito. L'analisi istomorfologica è stata condotta tramite software. Per ogni sezione colorata con H&E, sono stati selezionati tre campi casuali con un ingrandimento di 200x. Il software quantificava automaticamente il numero di cellule nucleate per unità di area dopo la delineazione manuale della regione di interesse, e i risultati venivano espressi come media ± deviazione standard (x̄ ± s).

Tachia occidentale
I tessuti del timo (50 ± 2 mg/campione) sono stati omogeneizzati in un tampone RIPA gelido contenente 1x cocktail inibitori di proteasi con un rapporto preciso di 100 mg di tessuto per 1 mL di tampon, utilizzando un omogeneizzatore motorizzato a pellet dotato di pestelli senza RNasi. L'omogeneizzazione è stata eseguita sul ghiaccio con 15 impulsi (1 s di impulso/2 secondi di pausa), seguita da un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio con vortice ogni 10 minuti. L'omogenato è stato centrifugato a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C, e il soprannatante risultante è stato raccolto per la quantificazione delle proteine. Il sovrantantante appariva chiaro e trasparente, privo di precipitati o strati lipidici. La concentrazione proteica è stata misurata utilizzando un kit di analisi proteica BCA, con un intervallo di curva standard da 0 a 2000 μg/mL. Il Western blot è stato eseguito per valutare i livelli di espressione di AKT1, JAK2 ed EGFR nel tessuto timo, utilizzando GAPDH come controllo interno. Dopo elettroforesi e trasferimento di membrana, il marcatore proteico (10-200 kDa) mostrava bande chiare e le bande bersaglio allineate con i pesi molecolari attesi (AKT1: 60 kDa, JAK2: 130 kDa, EGFR: 170 kDa, e GAPDH: 37 kDa).

L'analisi densitometrica delle bande Western blot è stata condotta utilizzando software. Prima dell'analisi, le bande venivano ispezionate visivamente per confermare l'assenza di sbavagamento o diffusione. La procedura di analisi includeva: selezione manuale delle regioni delle bande target dopo l'importazione dell'immagine, con rilevamento automatico dei bordi da parte del software, seguita da sottrazione locale dello sfondo utilizzando le regioni adiacenti alle bande per correggere i valori di grigio. Successivamente, è stato effettuato il calcolo del rapporto di valori grigi tra la proteina bersaglio e il controllo interno per la quantificazione relativa. La formula di normalizzazione utilizzata era:

Espressione relativa della proteina bersaglio = (valore grigio della banda bersaglio −fondo locale) / (valore grigio del controllo interno −fondo locale)

Immunoistochimica
La colorazione immunoistochimica è stata eseguita su sezioni del femore. Le fette sono state permeabilizzate con il 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti, seguite da bloccare per 30 minuti. Gli anticorpi primari sono stati incubati durante la notte a 4 °C, mentre gli anticorpi secondari sono stati incubati per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, sono stati osservati segnali positivi distinti con basso fondo e nessuna colorazione aspecifica al microscopio ottico. Le vetrine venivano montate utilizzando un mezzo anti-sfumatura contenente DAPI, che tingeva i nuclei di blu. È stata quindi valutata l'espressione di CD34+, TPO, EPO e GM-CSF. Le immagini immunoistochimiche sono state analizzate utilizzando software di patologia digitale (Versione 2.1.0). Prima dell'analisi, le immagini sono state verificate come prive di sovraesposizione o degradazione del segnale. Il procedimentodi analisi 32includeva:

Selezione del modello: Un modello pre-addestrato di segmentazione del midollo osseo (basato su U-Net) è stato utilizzato per identificare automaticamente le regionitissutali 33.
Impostazione della soglia: Le soglie di segnale positive sono state definite in base al gruppo di controllo negativo. Le regioni con intensità cromogenica superiore alla media di fondo di tre deviazioni standard sono state classificate come positive.
Definizione del ROI: Il software ha diviso automaticamente ogni campo in regioni della griglia da 500 × 500 μm e ha calcolato il numero di celle positive per unità di area (conteggio positivo delle celle/area del campo).
Esportazione dati: Un rapporto statistico della densità cellulare positiva è stato generato automaticamente.

Analisi statistica
L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software SPSS (Versione 22.0). I dati erano espressi come x̄ ± s. Prima dei confronti tra gruppi, la normalità è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk e l'omogeneità delle varianze è stata verificata con il test di Levene. Se sono state confermate sia la distribuzione normale (p > 0,05) sia l'omogeneità della varianza (p > 0,05), è stata utilizzata ANOVA unidirezionale per i confronti di gruppo. Confronti multipli post hoc sono stati condotti utilizzando il metodo della Minima Differenza Significativa (LSD); per controllare l'errore di Tipo I, tutti i valori P post hoc sono stati aggiustati utilizzando la correzione di Bonferroni, con p < 0,05 aggiustato considerato statisticamente significativo.

Se i dati non soddisfavano le assunzioni di normalità o omogeneità della varianza (p ≤0,05 in uno dei due test), veniva applicato il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn per l'analisi post hoc con correzione di Bonferroni. Tutti i grafici statistici e le visualizzazioni sono stati generati utilizzando GraphPad Prism (Versione 9.0). Il livello di significatività è stato fissato a α = 0,05. Tutti i valori p riportati erano valori correttivi. I valori anomali sono stati identificati tramite il test di Grubbs (α = 0,05) ed esclusi solo se chiaramente attribuibili a errori sperimentali. Tutti i dati rimanenti sono stati inclusi nell'analisi finale. I risultati sono presentati come x̄ ± s.

Metodologia della farmacologia delle reti
Questo studio ha utilizzato un approccio di farmacologia di rete per esplorare i potenziali meccanismi con cui JPSXD allevia la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia. Innanzitutto, i costituenti chimici del JPSXD e i relativi obiettivi sono stati recuperati dal Traditional Chinese Chinese Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). I criteri di screening sono stati stabiliti come segue: biodisponibilità orale (OB) ≥30% e somiglianza farmacologica (DL) ≥0,18. Per i composti non inclusi nel database TCMSP, la previsione dei target è stata effettuata utilizzando la piattaforma SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Per garantire che i composti selezionati coprissero i principali componenti bioattivi del JPSXD, è stato fatto riferimento alla Farmacopea della Repubblica PopolareCinese 34. In particolare, abbiamo identificato composti marcatori come ginsenovidi, astragaloside IV, icariina e acidi salvianolici esaminando le sezioni di Identificazione e Analisi per ciascuna erba. Questi composti, comunemente utilizzati come marcatori di controlloqualità 35, hanno strutture chimiche definite e requisiti quantitativi. Per accuratezza, abbiamo incrociato le Notifiche Generali e le Appendici della Farmacopea per confermare le convenzioni di denominazione e i metodi analitici (ad esempio, cromatografia liquida ad alte prestazioni, HPLC). L'analisi ha confermato che i criteri di screening (OB ≥30%, DL ≥0,18) hanno effettivamente catturato i composti principali della formula36, inclusi costituenti farmacopeici chiave come ginsenosidi Rg1 e Rb1 (da Panax ginseng), astragaloside IV (da Astragalus membranaceus) e icariina (da Epimedium brevicornum), indicando che i composti selezionati sono rappresentativi e comprendono gli ingredienti attivi principali responsabili della tonificazione di qi e sangue di JPSXD effetti.

Successivamente, i bersagli genici associati alla mielosoppressione sono stati recuperati dal database GeneCards (https://www.genecards.org/) e i risultati sono stati scaricati in un foglio di calcolo. Sono stati selezionati geni con un punteggio di rilevanza ≥44 per ulteriori analisi. L'intersezione tra i target di farmaci e i geni correlati alla malattia è stata visualizzata utilizzando un diagramma di Venn, e i geni sovrapposti sono stati importati nel database STRING (https://string-db.org/). L'organismo era impostato su umano e le fonti di interazione erano limitate a Esperimenti e Database con un punteggio minimo richiesto > 0,7. La rete di interazione proteina-proteina (PPI) risultante è stata poi analizzata per le caratteristiche topologiche per identificare i bersagli principali e visualizzata utilizzando Cytoscape 3.10.2.

Sulla base dei target principali identificati, sono state condotte analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando il database DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). I parametri sono stati impostati come: conteggio ≥5, punteggio EASE ≥0,05 e valore p < 0,01. I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati tramite la piattaforma Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). L'analisi delle vie ha ulteriormente chiarito le principali vie di segnalazione e i marcatori regolatori coinvolti, rivelando così i potenziali meccanismi attraverso cui JPSXD mitiga la mielosoppressione indotta dalla chemioterapia.

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Risultati

Analisi farmacologica delle reti
Identificazione di composti attivi e bersagli
Abbiamo innanzitutto identificato i principali composti marcatori di ciascuna erba in JPSXD sulla base della letteratura pergarantire una selezione completa34. In particolare, consultando le voci farmacopee per le erbe rilevanti (ad esempio, Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), abbiamo compilato un elenco dei costituenti ...

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Discussione

In mezzo all'aumento dell'incidenza globale del cancro, la comunità medica si trova ad affrontare due sfide: non solo il trattamento del cancro in sé, ma anche la gestione degli effetti collaterali associati, tra cui la mielosoppressione è una reazione avversa particolarmente comunee grave 43. Questo studio ha indagato sistematicamente il ruolo e i potenziali meccanismi del JPSXD nell'alleviare la mielosoppressione indotta da CTX nei topi, utilizzando una combinaz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal progetto Integrative Western and Traditional Chinese Medicine Focus-DCA Mode Intervention for Prevent Post-Operative Infections in Older Patients with Gastrointestinal Malignities, con il numero di progetto A2023053, finanziato dall'Amministrazione Provinciale di Medicina Tradizionale Cinese dell'Hunan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% Paraformaldeide (PFA)Sigma-AldrichP6148
AKT (padella) Rabbit mAbTecnologia di segnalazione cellulare#4691
Lavatrice automatica per microplaccheBioTek (Agilent)ELx405
Analizzatore auto-ematologico BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Microtomo criostaticoThermo Fisher ScientificCryoStar NX50
Iniezione di ciclofosfamideBaxter Oncology GmbHN/A (Gruppo: HJ20160467)
Microscopio E100NikonE100
Anticorpo EGFR (A-10)Santa Cruz BiotecnologiaSC-373746
Macchina di IncorporamentoLeicaEG1150
EPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemi DMEP00B
Anticorpo policlonale GAPDH RabbitProteintech10494-1-AP
GM-CSF (Mouse) ELISA KitR& Sistemi DMMC00B
Capra Anti-Coniglio IgG HRP-coniugatoJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Kit di colorazione ESigma-AldrichHT10
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàThermo Fisher ScientificSorvall ST 16R
Smicolatrice di tessuti ad alta produttivitàServicebioKZ-II
Penna per immunoistochimicaLaboratori VectorH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Cocco Jianpi Shengxue (JPSXD)Farmacia dell'Ospedale Oncologico di HunanFormulazione personalizzata
Lettore di microplaccheBioTek (Agilent)Sinergia H1
Soluzione fisiologica normaleBaxter2B1324X
Microtomo rotatorioLeicaRM2016
Processore di tessutiLeicaASP300S
TPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemi DMTP00B
Miscelatore a vorticeServicebioMX-F

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