Articolo metodologico

Purificazione di trofoblasti extravillosi HLA-G+ da tessuti placentari a termine umani per fenotipizzazione e analisi funzionale

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DOI:

10.3791/69545

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13 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo consente la purificazione, la caratterizzazione e la coltura dei trofoblasti extravillosi primari HLA-G+ (EVT) dalla decidua basali e dalla membrana corionica delle placente a termine umane. Le colture primarie di EVT mantengono la vitalità per 96 ore, permettendo la co-coltura con cellule immunitarie materne abbinate a campioni e la successiva analisi citometrica e molecolare del flusso delle loro interazioni.

Abstract

L'interfaccia materno-fetale umana rappresenta un ambiente immunologico unico in cui le cellule immunitarie materne e i trofoblasti estravillosi fetali (EVT) entrano in contatto cellulare diretto per stabilire e mantenere la tolleranza immunitaria. L'EVT presenta un immunofenotipo distinto caratterizzato dall'espressione di molecole tollerogeniche, tra cui HLA-G, PD-L1 e PD-L2, che svolgono ruoli fondamentali nel modulare le risposte immunitarie materne. Inoltre, gli EVT umani esprimono HLA-C che possono essere direttamente riconosciuti dalle cellule NK e T materne e ne promuovono l'attivazione. È importante notare che non sono presenti ortologi di HLA-C o HLA-G nei modelli animali utilizzati per la ricerca, e il trofoblasto murino manca di espressione di MHC. Pertanto, indagare le proprietà fenotipiche e funzionali dell'EVT umana dai tessuti placentari, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, è essenziale per chiarire i meccanismi alla base del mantenimento della gravidanza e della fisiopatologia dell'infiammazione placentare associata a preeclampsia, parto pretermine, restrizione della crescita fetale e placenta accerta. Questo protocollo delinea una metodologia completa per l'isolamento e la caratterizzazione dell'EVT primaria umana dal tessuto placentario a termine sano, così come dopo il parto pretermine e la preeclampsia. Include: (1) la dissezione dei tessuti placentari e corionici della membrana; (2) digestione enzimatica e preparazione di sospensioni a cellule singole; (3) purificazione EVT tramite ordinamento FACS; (4) Caratterizzazione fenotipica tramite citometria di flusso ad alta dimensione; e (5) coltura in vitro a breve termine e co-coltura con cellule immunitarie materne per un massimo di 96 ore. Si pone l'accento sull'ottenere EVT altamente pura e valida, adatta ad applicazioni a valle come saghi funzionali immunologici, analisi dell'espressione proteica e genica. L'implementazione di questo protocollo consente una piattaforma robusta e riproducibile per avanzare nella comprensione delle interazioni tra EVT e cellule immunitarie materne e delle sue implicazioni sia in gravidanze sane che complesse.

Introduzione

La placenta umana contiene quattro ampie categorie di tipi di trofoblasti: cellule staminali trofoblastiche, sincitiotroblasti, citotrofoblasti villosi e trofoblasti extravillosi (EVT), ciascuno con funzioni e caratteristiche fenotipiche distinte. Tra queste, l'EVT presenta caratteristiche immunologiche uniche, tra cui un'elevata espressione di molecole immunosoppressive, come HLA-G, PD-L1, PD-L2 e membri della famiglia B7, oltre a HLA-Cpolimorfo 1,2,3,4,5,6. La EVT invade profondamente il tessuto deciduale materno, le arterie spirali e il miometrio, mettendoli in contatto diretto con le cellule immunitariematerne 7. Gli EVT sono caratterizzati da un'espressione prominente di HLA-C polimorfico, un mediatore chiave delle interazioni con le cellule T e NK materne che devono essere controllate per preservare la tolleranza immunitaria durante la gravidanza. Essendo l'unica molecola classica di MHC espressa dall'EVT, HLA-C consente anche la presentazione di antigeni alle cellule T della memoria materna e supporta la protezioneimmunitaria 8. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che l'EVT aumenta direttamente le cellule T CD4 regolatorie e gli stati tollerogeni delle cellule T CD8 e delle cellule NK per proteggersi dalla citotossicità e dal rigettoimmunitario 9,10,11,12,13. Inoltre, alcuni studi hanno riportato cambiamenti immunologici nelle cellule immunitarie materne e nell'EVT delle placente ottenute dopo preeclampsia, parto pretermine o aborto spontaneo rispetto ai controlli sani 14,15,16,17,18,19,20,21. Diverse possibilità potrebbero essere alla base di questi cambiamenti immunologici, tra cui i) anomalia materna preesistente delle cellule T (T cellulari); ii) funzioni immunosoppressive compromesse dell'EVT; oppure iii) interazioni interrotte tra i due tipi cellulari. Per chiarire i fattori meccanicistici sottostanti, sono essenziali i sistemi sperimentali di modellazione ex vivo che permettono la valutazione delle cellule immunitarie materne e delle interazioni con l'EVT.

I metodi e gli approcci presentati qui presentano diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti che utilizzano linee classiche di trofoblasti, modelli di cellule staminali trofoblasti o organoidi. Soprattutto, le linee cellulari classiche di trofoblasti e i modelli di cellule staminali trofoblastici non ripresentano caratteristiche essenziali dell'EVT primaria, inclusi i loro profili di espressioneMHC 3,5,22,23. In secondo luogo, i complessi requisiti di mezzo delle colture di cellule staminali trofoblastiche umane (hTSC) e organoidi che includono diversi inibitori molecolari influenzano direttamente le funzioni e il fenotipo delle cellule immunitari, impedendo una valutazione adeguata delle interazioni tra EVT e celluleimmunitarie 22,24,25,26,27 . Infine, la diversità cellulare delle colture di hTSC dopo la differenziazione e la natura inversa delle strutture organoidi placentarie permettono interazioni immunitarie con tipi di trofoblasti che non hanno rilevanza invivo, riducendo la chiarezza deglistudi 22,27.

Qui descriviamo metodi per purificare l'EVT primario HLA-G+ da tessuti placentari a termine umano, permettendo la coltura fino a 96 ore in presenza o assenza di popolazioni di cellule immunitarie. Il mezzo è privo di inibitori molecolari che influenzano l'EVT e le funzioni delle cellule immunitarie mantenendone la vitalità. Questo approccio fornisce una piattaforma preziosa per studi direttamente ex vivo sulle interazioni tra EVT e cellule immunitarie in gravidanze sane e complesse. Si prevede che contribuisca alla scoperta dei principali fattori che determinano la tolleranza immunitaria materno-fetale e identifichi bersagli terapeutici per risolvere l'infiammazione placentare.

Protocollo

Il comitato di revisione istituzionale del Cincinnati Children's Hospital ha approvato questo protocollo di ricerca (Approvazione #2021-0336), che soddisfa i requisiti relativi a considerazioni bioetiche, gestione delle informazioni personali, patogeni infettivi e procedure di consenso informato in conformità con la legge statunitense. Ogni laboratorio dovrebbe ottenere un'approvazione che rispetti le linee guida nazionali di ricerca prima di iniziare l'esperimento.

Questo protocollo si concentra sulla coltivazione primaria di HLA-G+ EVT che mantengono la vitalità fino a 96 ore per il test funzionale secondario, migliorando il nostro precedenteprotocollo 2,28. Fare riferimento a Hamilton et al.2 per stabilire la linea cellulare HLA-G+ simile all'EVT e a Ikumi et al.28 per coinvolgere linfociti deciduali materni compatibili.

1. Allestire il laboratorio (giorno 0).

NOTA: Utilizzare un armadietto di biosicurezza di classe II (BSL2) per la maneggiatura dei campioni.

  1. Prepara due bagni d'acqua a 39 °C e 37 °C. Installa un incubatore umidificato di CO2 a 37 °C.
  2. Prepara 1x PBS, Wash Medium A, Wash Medium B, EVT Culture Medium A, B e C (Tabella 1 e Tabella 2).
  3. Scongelare 15 mL di soluzione DNase I da 10 mg/mL (Tabella 1) e 500 mL di tripsina/EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Posizionare un contenitore riempito di soluzione biocida/virucida (ad esempio, candeggina al 10%) nell'armadietto BSL2 per la raccolta dei rifiuti liquidi. Prepara un contenitore per i rifiuti con una borsa biohazard nell'armadietto BSL2 per i rifiuti solidi.
  5. Prepara assorbenti, strumenti sterili per la dissezione (pinzette a punta curva e forbici da 6 1/2"), filtri metallici sterili, portatubi e tubi conici sterili da 50 mL nell'armadio BSL2.
  6. Prepara tre tubi conici da 50 mL (due con 1x PBS ciascuno e uno con Wash Medium A per la raccolta dei pezzi di tessuto placentario durante la dissezione).

2. Raccolta di campioni (giorno 0)

NOTA: Utilizzare placente umane con membrane ottenute tramite taglio cesareo tra la 24ª e la 42ª settimana di gestazione. Una placenta espulsa vaginalmente può produrre meno EVT.

  1. Inizia a processare immediatamente la placenta in un armadietto BSL2, idealmente entro 1-2 ore dal parto, per massimizzare la resa delle cellule vitali. Mantieni la placenta sempre a temperatura ambiente.
  2. Ispezionare la placenta e, se necessario, annotarne la dimensione, il peso e l'aspetto morfologico grossolano.

3. Dissezione tissutale (giorno 0)

  1. Dissezione a membrana
    1. Posiziona la placenta rivolta verso l'alto verso il lato fetale (la parte di inserimento del cordone è visibile). Rimuovere l'amnion, che è lo strato di membrana più vicino al lato fetale, staccandolo manualmente dalla membrana laterale verso il sito di inserimento del cordone ombelicale; taglia e scarta l'amnion.
    2. Taglia la membrana coriodeciduale in strisce da 2 pollici a partire dalla base della placenta verso l'alto, lasciando la striscia della membrana attaccata alla placenta.
    3. Posizionare la striscia di membrana coriodeciduale sulle due dita rivolte verso l'alto e raschiare delicatamente la decidua parietale materna dal corione usando le pinze sterili curve della punta.
      NOTA: Lavora in modo efficiente e non lasciare che la membrana corionica si secchi.
    4. Raccogli la membrana corionica in un tubo conico da 50 mL con 20 mL di Wash Medium A.
    5. Raccogliere la decidua parietalis per l'isolamento deciduale dei linfociti nel tubo conico da 50 mL con 20 mL di PBS e seguire il protocollo descritto da Ikumi et al. per l'isolamento deilinfociti 28.
    6. Taglia la membrana corionica con forbici nel tubo da 50 mL finché non diventa piccoli pezzi di <2mm2.
      NOTA: La quantità totale della membrana sedimentata è idealmente di 30 mL dopo il taglio.
    7. Scartare il Wash Medium A e lavare con PBS più volte finché il sovrantato non diventa pulito.
  2. Dissezione della placenta
    1. Posiziona la placenta rivolta verso l'alto verso la madre e rimuovi i coaguli di sangue. Tagliare i pezzi della placca basale della placenta (lunghezza 2 cm, larghezza 2 cm, profondità 0,5 cm) usando forbici sterili, evitando le parti necrotiche, calcificate o ischemiche.
    2. Posiziona il pezzo di decidua basalis sulle dita rivolte verso l'alto verso il villi (lato fetale). Rimuovere con attenzione i villosi dalla decidua basali con forbici per ottenere 2-3 mm di membrana, rimanendo solo uno sottile strato di villosi sulla decidua basali.
    3. Raccogliere tessuto decidua basale nel tubo conico da 50 mL con 20 mL di PBS. Taglia le decidua basalis finché non diventano piccoli pezzi di <2mm 2.
      NOTA: La quantità totale di tessuto sedimentato è idealmente di 15 mL dopo il taglio.
    4. Scartare il PBS e lavare la basale deciduale con PBS più volte finché il soprantantante non diventa trasparente senza sangue visibile.
    5. Dividere 15 mL di sospensione tissutale in due tubi conici da 50 mL (7,5 mL per ciascuno).
      NOTA: Il protocollo di isolamento dei linfociti dalla decidua basalis è distinto da questo protocollo. Fare riferimento al protocollo fornito in Hamilton et al.2.

4. Digestione dei tessuti (giorno 0)

  1. Dopo il lavaggio finale della membrana corionica e della decidua basalis nella sezione 3, riempi tutti i tubetti con 1x PBS, centrifugali a 200 × g per 1 minuto e versa via il surnadante.
  2. Prepara il cocktail enzimatico per la digestione dei tessuti (Tabella 1). Aggiungi 150 mL di cocktail enzimatico per la digestione tessutale calda in una bottiglia di vetro da 300 mL, poi aggiungi 30 mL di membrana corionica alla bottiglia.
  3. Aggiungi 20 mL di DMEM/F20 caldo e 80 mL di cocktail enzimatico per digestione tessutale calda in due bottiglie di vetro da 300 mL e poi aggiungi 7,5 mL di Decidua Basalis in ogni bottiglia.
  4. Incubare la bottiglia con la membrana corionica nel bagno d'acqua a 39 °C e le due bottiglie con decidua basalis nel bagno d'acqua a 37 °C. Durante i 15 minuti di incubazione, agita tutte le bottiglie ogni 3-4 minuti (prima digestione).
  5. Dopo la digestione, filtrare il tessuto digerito attraverso setacci metallici (dimensione della griglia 40). Aggiungi il Wash Medium B ai tessuti per risciacquare e sciacquare la sostanza gelatinosa.
  6. Filtrare le sospensioni cellulari su un filtro da 100 μm in tubi da 50 mL etichettati con il tipo di tessuto e il numero di digestione.
  7. Prosegue con la seconda digestione riportando il tessuto non digerito nelle bottiglie medie da 300 mL, aggiungi il Tissue Didigestive Enzyme Cocktail come descritto nel passo 4.2 e ripeti i passaggi 4.2-4.6.
    NOTA: Tutti i tessuti di decidua basalis vengono trasferiti in un'unica bottiglia da 300 mL. Tieni separate le cellule ottenute dopo la prima digestione e la seconda.
  8. Fai girare la sospensione della cella a 650 × g per 8 minuti e scarta il sovrantante.
  9. Unisci i pellet (ma tieni separati la prima e la seconda digestione) dello stesso tipo di tessuto e numero di digestione in un unico tubo. Riempi con Wash Medium B fino a 25 mL.

5. Gradiente di densità di Ficoll (giorno 0)

  1. Prepara quattro tubi conici da 50 mL etichettati con il tipo di tessuto e il numero di digestione. Versa 12 mL di Ficoll nei tubi.
  2. Carica con attenzione le sospensioni delle celle sul Ficoll. Centrifuga i tubi a 800 × g per 20 minuti (temperatura ambiente) senza freno.
  3. Trasferire con cura lo strato cellulare all'interfaccia Ficoll-mezzo in tubi conici puliti da 50 mL, etichettati per tipo di tessuto e numero di digestione dopo la centrifugazione.
    NOTA: Raccogli con cura lo strato senza disturbare l'interfaccia usando una pipetta di trasferimento sterile.
  4. Riempi i tubi con il Wash Medium B e centrifuga a 650 × g per 8 minuti.
  5. Scartare il sovrandanante e risospendere i pellet cellulari con il mezzo rimanente (circa 0,5 mL). Se necessario, tieni separato circa il 10% della sospensione cellulare per il fenotipaggio e usa il 90% per la selezione cellulare. Contare le celle per determinare il numero e la vitalità.

6. Smistamento dell'EVT (giorno 0)

  1. Inserire i pellet cellulari risospesi in tubi FACS sterili etichettati con tipo di tessuto e numero di digestione. Aggiungere anti-CD45-BV785 (1:100), anti-HLA-G-APC (1:125) e anti-EGFR1-BV711(1:160) (Tabella 3). Incuba i tubi per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
  2. Aggiungi 1 mL di Wash Medium B e centrifugali a 650 × g per 8 minuti.
  3. Scartare il sovrantato e risospendere i pellet cellulari con il Wash Medium B per ottenere circa 1 × 106 celle / mL di sospensione.
  4. Filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 40 μm, direttamente prima della selezione cellulare, e selezionare CD45-HLA-G+EGFR+ EVT in tubi con 1 mL di Mezzo di Coltura EVT A secondo la strategia di gating descritta nella Figura 1A.
    NOTA: Per una vitalità ottimale del trofoblasto, si dovrebbe utilizzare un selezionatore a celle a getto nell'aria (ad esempio, Bigfoot o MoFlo) con un ugello da 100 μm. Gli smistatori basati su fluidica (ad esempio DB S6 o Sony Nano) possono ridurre la vitalità della trofoblasta, mentre le strategie di selezione delle celle magnetiche (ad esempio Easysep o MACS) possono preservare la vitalità ma avere una bassa purezza, causando un sovrasviluppo delle cellule stomali nelle colture.
  5. Centrifugare i tubi FACS con le celle selezionate, scartare il surnatante e risospendere i pellet cellulari con il Mezzo di Coltura EVT B.
    NOTA: Procedi nella sezione successiva per preparare le lastre di coltura durante la selezione delle cellule.

7. Coltura primaria HLA-G+ EVT per il secondo saggio (giorni 0 - 1)

  1. Ricoprire i pozzi delle piastre di coltura cellulare a fondo piatto a 96 pozzi con 50 μL di fibronectina da 20 μg/mL (Tabella 2) a temperatura ambiente per 45 minuti.
  2. Rimuovere la fibronectina e aggiungere la sospensione cellulare con EVT Culture Medium B ai pozzi. Punta a 0,5 × 10 celluleEVT a 5 basali/200 μL di medio/pozzo e 1,0 × 10 celleEVT a 5 corioni/200 μL di mezzo/pozzo. Incubare le piastre di coltura cellulare per 12-18 ore nell'incubatore diCO2 umidificato a 37 °C (incubazione giorno 0).
  3. Il giorno 1, rimuovere il mezzo B, lavare delicatamente le cellule con 1x PBS e aggiungere il Medium C per coltura EVT con o senza cellule T per ulteriori (co)colture (vedi sezione 8).

8. Co-coltura di EVT primaria HLA-G+ con cellule T attivate (giorni 0 - 4)

  1. Stimolazione delle cellule CD8+T da un donatore di3 parti ( giorni 0-1)
    1. Durante l'ordinamento dell'EVT HLA-G+ (giorno 0), isolare popolazioni di cellule immunitarie del sangue periferico provenienti sia da donatori materni abbinati a campioni sia da donatori non imparentati, utilizzando il cocktail di arricchimento delle cellule T CD8+ umane citato (vedi la Tabella dei Materiali) seguito da centrifugazione a gradiente di densità di Ficoll o ordinamento FACS.
    2. Prestimolare le cellule T o NK con perle o citochine anti-CD3/28 (ad esempio IL2, IL15, IL12 o IL18) nel Mezzo di Coltura Linfocitaria, a desiderazione.
  2. Co-coltura EVT con cellule T attivate (giorni 1-4)
    1. Contare il numero di linfociti e realizzare sospensioni cellulari con mezzo di coltura linfocitaria a una concentrazione di 0,5 × 106 /mL. Aggiungere 1 × 1010 5 linfociti ai pozzi primari di EVT (il volume di Mezzo di Cultura EVT C : Mezzo di Cultura Cellulare di Linfociti = 1:1). Incubare le piastre per 24-72 ore in un incubatore umidificato diCO2 a 37 °C.
    2. Prelevare linfociti per l'analisi della citometria di flusso e raccogliere i soprantativi per l'analisi delle citochine.
    3. Prelevare EVT tramite tripsinizzazione e raccogliere EVT nei tubi FACS per l'analisi della citometria di flusso al giorno 4 (vedi sezione 9).

9. Fenotipizzazione dell'EVT primario HLA-G+

NOTA: Procedere immediatamente con la colorazione citometrica a flusso e mantenere l'EVT e tutte le soluzioni necessarie a temperatura ambiente in ogni momento.

  1. Centrifugare i tubi FACS con EVT primario a 650 × g per 7 minuti e eliminare il soprandante.
  2. Aggiungi la soluzione di colorazione per caspasi 3/7 (Tabella 3) ai pellet cellulari e mescolali delicatamente.
  3. Tingi le cellule con anticorpi (Tabella 3), mescolale delicatamente e incubale per altri 20 minuti (incubazione totale di 30 minuti).
  4. Aggiungi 1 mL di EVT Culture Medium C, centrifuga i tubi a 650 × g per 7 minuti e scarta il sovrantante.
  5. Risospendere il pellet cellulare con 0,4 mL di Mezzo di Coltura EVT Cel·l� C. Aggiungere la soluzione di colorazione 7-AAD (5 μL/sospensione cellulare) nei tubi e analizzare immediatamente su un citometro di flusso.

Risultati

Rendimenti attesi delle celle

Da 15 mL di decidua basalis, l'EVT atteso HLA-G+ produce 0,1-0,3 × 106 cellule dalla prima digestione e 0,1-0,6 × 106 cellule dalla seconda digestione (totale 0,2-0,8 × 106 cellule). Da 30 mL di membrana corionica, le rese attese di HLA-G+ EVT sono 0,4-1,0 × 106 cellule dalla prima digestione e 0,4-1,5 × 106 cellule dalla seconda digestione (totale 0,8-2,5 × 106 cellule). La proporzione di caspase 3/7-7-AAD-EVT vivente negli isolati è prevista per il 90-95%.

Cultura primaria HLA-G+ EVT

L'analisi della citometria di flusso dei marcatori di linea (HLA-G, HLA-C, EGFR) e dei marcatori di morte cellulare ha mostrato che questo protocollo fornisce una coltura primaria di EVT vitale fino al quarto giorno (96 ore dopo la placcatura dell'EVT ordinato) (Figura 1B-D). Immagini rappresentative di microscopia ottica dell'HLA-G+ EVT corionico primario e d.basalis sono mostrate dopo 24, 48 e 72 ore di coltura (Figura 2A-F).

Co-coltura di EVT primaria HLA-G+ con cellule T

Questo protocollo ha migliorato la vitalità dell'EVT primaria 96 ore dopo l'isolamento dalla placenta, un miglioramento rispetto al nostro precedente rapporto1, 2 e 10. Pertanto, consente l'analisi delle risposte EVT dopo la co-coltura con linfociti pre-stimolati, che imita l'infiammazione acuta all'interfaccia materno-fetale. EVT esprime HLA-C polimorfo così come molecole immunosoppressive co-inibitorie, come PD-L1, PD-L2, PVR (nota anche come CD155), B7H3 e HLA-E, come determinato dalla colorazione della citometria a flusso extracellulare (Figura 3A,B). L'EVT ha aumentato l'espressione di HLA-C, così come di PD-L1, PD-L2 e HLA-E, ma non ha aumentato l'espressione di PVR e B7H3 quando co-coltura con linfociti attivati per 72 ore secondo la sezione 8 del protocollo (Figura 4A,B). Inoltre, non è stato osservato alcun aumento della morte per EVT come mostrato dalla colorazione con 7AAD e caspasi 3/7 (Figura 4C,D).

Figura 1
Figura 1. La strategia di gating per la classificazione delle cellule EVT e la citometria a flusso si sviluppa dopo la coltivazione dell'EVT ordinata. (A) La strategia rappresentativa di gating per la selezione dell'EVT della decidua basalis e dell'EVT corionica. R1 è il portale della cella viva nel grafico a scatter lato anteriore. R2 è la porta per l'esclusione dei leucociti CD45+. R3 è la porta HLA-G+EGFR+EVT. R4 è il 7-AAD-caspase3/7- EVT vivo. Sebbene la porta R4 non sia necessariamente necessaria per l'ordinamento, qui viene mostrata per dimostrare la validità dell'EVT primario. (B) Grafici rappresentativi di citometria a flusso di HLA-G+EGFR+EVT ordinati, dopo 96 ore di coltura in vitro. (C,D) Frequenze della caspasi 3/7-7-AAD - EVT vivente durante la selezione (giorno 0) e 96 ore di coltivazione (giorno 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. La morfologia dell'EVT durante la coltura in vitro . Immagini rappresentative della microscopia chimica della EVT corionica dopo (A) 24 ore, (B) 48 ore e (C) 72 ore di coltura e decidua basalis EVT dopo (D) 24 ore, (E) 48 ore e (F) 72 ore di coltura. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Fenotipi immunologici della EVT primaria. (A) I grafici di flusso rappresentativi degli HLA e delle molecole coinibitorie su EVT primaria determinati dalla colorazione della citometria a flusso extracellulare (giorno 0). (B) I diagrammi di linee accoppiati mostrano MFI grezzo del controllo IgG e la colorazione completa di ciascun marcatore da d. basalis EVT (blu) e corionic EVT (verde) al giorno 0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Fenotipi immunologici dell'EVT primario con o senza linfociti attivati (giorno 4). (A) Diagrammi di flusso rappresentativi dell'EVT dopo la coltura a 72 ore (giorno 4) con o senza linfociti di terze parti attivati. (B) I diagrammi lineari accoppiati mostrano l'IMF di EVT con o senza linfociti di terze parti attivati. I grafici blu rappresentano l'EVT della decidua basalis, mentre i grafici verdi rappresentano l'EVT corionica. (C) Grafici rappresentativi della citometria a flusso per caspasi 3/7-7-AAD- EVT vivo con o senza linfociti di terze parti attivati al giorno 4. (D) I diagrammi lineari accoppiati mostrano le frequenze della caspasi 3/7-7-AAD-EVT vivente con o senza linfociti di terze parti attivati. I grafici blu rappresentano l'EVT della decidua basalis, mentre i grafici verdi rappresentano l'EVT corionica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Reagenti chiave per la dissezione e la digestione dei tessuti. Vedianche 1,2,24. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2. Reagenti chiave per la coltura EVT e la co-coltura con le cellule T. Vedianche 1,2,24. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3. Anticorpi e reagenti chiave per l'analisi della sordinazione e della citometria a flusso. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Fasi critiche nel protocollo

Per ottenere EVT vitale, è fondamentale iniziare l'isolamento cellulare dalla placenta immediatamente dopo il parto e eseguire tutte le procedure, dall'isolamento alla selezione a temperatura ambiente. Poiché gli EVT sono più grandi e più adesivi rispetto ai linfociti, si devono adottare le seguenti precauzioni per la selezione per evitare l'intasamento: i) passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm prima della separazione, ii) utilizzare un mezzo contenente DNasi per la sospensione cellulare, iii) evitare di sovraconcentrarsi le sospensioni cellulari (idealmente ~1 × 10⁶ cellule/mL), e iv) utilizzare un ugello di almeno 100 μm. Un selezionatore Jet-in-Air (ad esempio, Bigfoot, MoFlo) ottiene una resa EVT più elevata rispetto ai selezionatori di celle basati su fluidica (ad esempio, BD ordinatori, Sony Nano).

Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo

Sovradigerito o sottodigerito dopo la prima digestione di Decidua basalis EVT

L'efficienza digerente del tessuto decidua basale varia tra le placente. I tessuti sovradigeriti formano grandi aggregati appiccicosi che sono difficili da far passare attraverso il crivello metallico. Tipicamente, aggiungere 10-30 mL di Wash Medium B aiuta a disperdere questi aggregati durante la filtrazione. Se questo non risolve il problema, aggiungere 1-2 mL di DNasi direttamente ai tessuti. Se la prima digestione porta a una sovradigestione, riduci la concentrazione del Cocktail di Enzimi per la Digestione Tissutale dall'80% al 70% per la seconda digestione. Dopo la filtrazione della prima digestione, il volume residuo del tessuto dovrebbe essere ridotto a circa meno della metà. Se il volume residuo del tessuto rimane invariato, aumentare la concentrazione del Cocktail Enzimatico di Digestione Tissutale dall'80% al 90-100% per la seconda digestione. I tessuti della membrana corionica vengono costantemente digeriti attraverso le placente. Pertanto, regolare la concentrazione del cocktail enzimatico di digestione tissutale è generalmente non necessario.

Per la digestione di volumi tissutali maggiori rispetto a quelli descritti nel protocollo sopra

Per digestione di più di 30 mL di membrana corionica o più di 15 mL di tessuto decidue basali, utilizzare bottiglie aggiuntive con il Tissue Digestion Enzyme Cocktail. Aumentare il volume tissutale in una singola bottiglia tende a causare una sottodigestione.

Limitazioni del metodo

Si prevedono minori rendimenti EVT dalle placente somministrate vaginalmente. L'EVT non può essere crioppreservato né prima né dopo la smistamento, poiché sono sensibili allo stress da congelamento-disgelo, che ne limita significativamente la vitalità e la funzione. Pertanto, questo protocollo non include alcun punto di arresto.

L'importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti

In precedenza abbiamo riportato il protocollo per stabilire linee cellulari simili a HLA-G+ EVT da placente a termine utilizzando il Tissue Culture Medium B e piastre rivestite di collagene. Tuttavia, diversi inibitori nel mezzo e nel collagene possono influenzare la funzione delle cellule T nel sistema dico-coltura 2. Altri rapporti precedenti che non utilizzavano il Mezzo di Coltura Tissutale B permettevano la valutazione delle cellule T in co-coltura, ma non dell'EVT a causa della variabilitàcellulare 1,10. Il vantaggio dell'attuale protocollo è che minimizza l'influenza del mezzo di coltura consentendo al contempo la coltura di EVT primario vitale. Questo protocollo fornisce una piattaforma sperimentale per indagare la funzione immunologica dell'EVT e i loro cambiamenti funzionali in risposta alle cellule immunitarie circostanti, un'area che è stata poco studiata.

Dichiarazioni

Non vi è alcun conflitto di interessi legato a questo studio.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Sherry Thornton e il Research Flow Cytometry Core della Divisione di Reumatologia del Cincinnati Children's Hospital Medical Center per tutto il loro aiuto nella citometria del flusso e nella selezione cellulare; Tutti gli infermieri e i medici degli ospedali partecipanti per i loro sforzi nella raccolta di materiali placentari; Tutti i membri del laboratorio di Tilburgs e i docenti di immunologia della CCHMC per le loro discussioni utili; Questo lavoro fu sostenuto dal NIH R01HD116852 (T.T.); Fondazione per la Ricerca per l'Infanzia di Cincinnati (T.T.); Premio Burroughs Wellcome Fund per la Prossima Generazione #NGP10115 (T.T.); e la sovvenzione collaborativa March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. è supportata dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 22KK0287 e 25K12697.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Riferimenti

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