Articolo metodologico

Campionamento in tempo reale del fluido interstiziale arteriovenoso venticiale del ratto femorale tramite posizionamento di una sonda per microdialisi

433 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 dicembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio introduce una tecnica di microdialisi che facilita il campionamento in tempo reale e anatomicamente preciso del liquido interstiziale avventiziale (AISF) nei ratti anestetizzati, rivelando variazioni metaboliche distinte e confermandone un'importanza fisiologica unica. Rispetto ai metodi esistenti di campionamento del fluido interstiziale (ISF), questo approccio offre una maggiore risoluzione molecolare e stabilità del campionamento.

Abstract

Il fluido interstiziale (ISF) è un elemento vitale del microambiente extracellulare, facilitando lo scambio metabolico e la comunicazione intercellulare. Tuttavia, la profondità anatomica e la vicinanza alle strutture vascolari rendono l'ISF avvenziale (AISF) particolarmente difficile da campionare senza introdurre contaminazione o causare disturbi tissutitori. In questo studio, introduciamo un metodo in tempo reale e minimamente invasivo per la raccolta dell'AISF attraverso l'uso della microdialisi nei ratti anestetizzati. Sono state impiantate chirurgicamente due sonde di taglio da 20 kDa nelle avventite arteriovenose femorali e nella vena giugulare per consentire un prelievo continuo rispettivamente di ISF e sangue. La perfusione con fluido extracellulare artificiale ha permesso la diffusione selettiva di metaboliti a basso peso molecolare. Attraverso l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi discriminante ortogonale dei minimi quadrati parziali (OPLS-DA), è stata osservata una distinta divergenza metabolica tra AISF e sangue, identificando 146 metaboliti significativamente differenziali. I modelli di arricchimento di lattato e serotonina hanno confermato la specificità anatomica e l'affidabilità funzionale del metodo. È importante sottolineare che AISF era arricchita con metaboliti sintetizzati localmente assenti nel plasma, evidenziandone il significato fisiologico unico. Rispetto alle attuali metodologie di campionamento del fluido interstiziale (ISF), come microaghi, vesciche di aspirazione e iontoforesi inversa, la microdialisi offre una risoluzione molecolare migliorata, maggiore stabilità del campionamento e una riduzione dell'invasività. Questa tecnica costituisce una piattaforma affidabile per l'analisi in vivo degli analiti nel liquido interstiziale (AISF) e mostra un potenziale significativo per far avanzare la scoperta di biomarcatori e la ricerca sulla fisiopatologia vascolare.

Introduzione

Il liquido tissutale, o fluido interstiziale (ISF), costituisce un elemento cruciale del microambiente cellulare, con indagini accademiche che risalgono alla fine del XIX secolo. Nel 1896, Starling introdusse la teoria della filtrazione-riassorbimento capillare, che per la prima volta caratterizzò l'ISF come un fluido omogeneo generato tramite ultrafiltrazione al plasma, svolgendo un ruolo vitale nel trasporto di nutrienti e nella rimozione dei rifiutimetabolici. Negli ultimi due decenni, i progressi nella tecnologia dell'imaging microscopico e nella biologia molecolare hanno migliorato la comprensione da parte dei ricercatori della notevole diversità nella distribuzione anatomica, composizione e funzione diISF 2.

La ricerca sul liquido interstiziale (ISF) in vari siti anatomici ha elucidato le sue funzioni distinte all'interno di diversi tessuti. Ad esempio, nel tessuto cerebrale, l'ISF facilita l'eliminazione di metaboliti neurotossici, come il β-amiloide, durante il sonno tramite il sistemaglymphatico 3. Al contrario, il liquido interstiziale tumorale (TIF) contribuisce all'invasione tumorale e all'evasione immunitaria promuovendo un microambiente acido attraverso l'accumulo di acidolattico 4. Questi risultati suggeriscono che l'ISF funzioni non solo come mediatore dello scambio metabolico, ma anche come regolatore attivo dei processi fisiopatologici specifici del tessuto. In questo contesto, il Fluido Interstiziale Adventiziale (AISF) rappresenta una sfida di ricerca unica a causa della sua specifica localizzazione anatomica e della complessità funzionale. L'AISF si trova all'interfaccia tra l'adventitia e i tessuticircostanti 5, svolgendo un ruolo cruciale nell'interazione tra la parete vascolare e i sistemi nervoso e immunitario. Tuttavia, la sua profonda posizione anatomica e la vicinanza al sangue e ai fluidi linfatici hanno posto notevoli sfide tecniche per il campionamento in situ e l'analisi composizionale.

Le tecniche tradizionali per il campionamento ISF, inclusa la modalità dello stoppino e il drenaggio chirurgico, incontrano notevoli difficoltà nell'ottenere campioni di AISF ad alta purezza a causa del rischio di contaminazione del sangue e danni ai tessuti. Ad esempio, la rimozione chirurgica dell'epitelio vascolare può causare lesioni ai nervi periferici o ai vasi linfatici, con conseguente miscela di biomolecole nonbersaglio 6. Inoltre, questi metodi sono limitati da bassi tassi di campionamento, instabilità, suscettibilità alle interferenze e scarsa riproducibilità, spesso attribuibili all'infiammazione indotta dall'inserimento sottocutaneo dellostoppino 7 e a danni cellulari durante l'impianto muscolare. Lo sviluppo della microdialisi rappresenta un approccio più efficace per gli studi ISF. Questa tecnica consente la cattura in situ e dinamica di piccole molecole, come metaboliti e citochine, all'interno dell'ISF senza compromettere la struttura vascolare, utilizzando una sonda a membrana semipermeabile. La sonda può essere posizionata con precisione nello spazio epiteliale vascolare, riducendo così il rischio di contaminazione da sangue o fluidi linfatici. Inoltre, facilita il campionamento continuo, che consente il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti dinamici nel metabolismo dell'ISF in varie condizioni. Garantire un monitoraggio continuo e stabile di questi processi metabolici durante l'esperimento.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti dopo l'approvazione del Comitato di Etica Animale del Peking Union Medical College. Tutte le procedure sono state rigorosamente rispettate dai protocolli stabiliti. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione sperimentale

  1. Illustrare il sistema di campionamento per microdialisi e gli strumenti chirurgici associati come mostrato nella Figura 1.
  2. Prepara liquido extracellulare artificiale (aECF) contenente 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl e 1,25 mM di glucosio, e regolare il pH a 7,4.
  3. Prepara due sonde mD da 20 kDa e designale come Sonda 1 (sonda del liquido tissulare) e Sonda 2 (sonda del sangue). Posizionare la Sonda 1 in acqua deionizzata sterile filtrata (dH₂O) e la Sonda 2 in eparina sodica all'1%, assicurando che le punte della sonda rimangano continuamente umide.
  4. Stabilire due coppie di percorsi (Vie 1 e 2) per "affluente" e "uscita". Collega due segmenti di tubo FEP da 1 m utilizzando tubi PE50, minimizzando lo spazio morto. Collegare ogni tubo di ingresso a una siringa Exmire da 1 mL: riempire la siringa 1 con dH₂O e la siringa 2 con eparina sodica all'1%. Collega le microsiringhe alle sonde e prepara l'infusione di aECF dopo aver posizionato le sonde nella vena giugulare.
  5. Attiva la pompa mD e imposta la portata a 1,5 μL/min finché il fluido non esce dal tubo di uscita. Collega il tubo di uscita alla linea di raccolta del campione.
  6. Riempire due microsiringhe con aECF filtrata e avviare il pompaggio a 1 μL/min.

2. Preparazione degli animali

  1. Alcuni ratti Sprague-Dawley adulti selezionati che pesano 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Indurre l'anestesia usando isoflurano al 3% e mantenerla con 1,8%-2,2% di isoflurano in una miscela aria/ossigeno mentre monitora l'attività cardiaca (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Confermare l'anestesia profonda valutando l'assenza di risposta al dolore e osservando una frequenza cardiaca ridotta (340-390 bpm). Metti il ratto su una coperta termostatica e immobilizza gli arti.
  3. Applicare la crema depilatoria sul collo e sull'arto posteriore sinistro, estendendosi fino alla parte inferiore dell'addome sinistro. Disinfetta le aree depilate due volte con iodoforo e rimuovi lo iodio residuo usando alcol medico al 75%.

3. Posizionamento della sonda a doppio sito (adventitia femorale e vena giugulare)

  1. Utilizzare una sonda con finestra di dialisi attiva da 10 mm (CMA-20, taglio di 20 kDa, diametro dell'albero di 0,5 mm) come mostrato nella Figura 2A.
  2. Prepara l'ago guida e il tubo strappabile (Figura 2B).
  3. Estendi l'arto posteriore del ratto in modo che la linea che collega l'articolazione del ginocchio al punto medio della piega inguinale sia perpendicolare all'asse longitudinale del corpo. Misurare un segmento di 2 cm lungo la pelle della regione inguinale in direzione dell'arto posteriore per definire l'area chirurgica simbolo (Figura 2C). Identifica il punto medio di questa regione inguinale come il punto di posizionamento della microfinestra. Segna il sito della puntura 2 cm lateralmente a questo punto di posizionamento (Figura 2D).
  4. Metti l'animale sotto uno stereomicroscopio.
  5. Effettuare un'incisione di 0,5-0,8 cm a metà della piega inguinale per facilitare la visualizzazione e garantire una posizione accurata della sonda all'interno della membrana perivascolare. Dissezionare in modo diretto il tessuto sottocutaneo per esporre l'arteria e la vena femorale, la vena safena e la vena superficiale della parete addominale (Figura 2E).
  6. Racchiudi lo strato esterno dell'ago per la puntura in un tubo strappabile per creare un ago guida.
  7. Conferma che non ci siano vasi sanguigni sotto la pelle nel punto della puntura. Inserisci l'ago verticalmente attraverso la pelle, poi regola l'angolo a 45° per entrare nello spazio tissutale che circonda la vena safena.
  8. Muovi l'ago nella direzione del flusso sanguigno nella grande vena safena, mantenendo il contatto stretto con la parete del vaso durante tutta la procedura. Utilizzare uno stereomicroscopio per monitorare la posizione dell'ago in tempo reale e prevenire lesioni vascolari o contaminazioni ematiche. Successivamente, guida l'ago nell'avventizia della vena femorale (Figura 2F).
  9. Ritira l'ago per la puntura lasciando il tubo strappabile in posizione all'interno del tessuto (Figura 2G).
  10. Inserire la sonda di liquido tissutale nel catetere strappabile e aprirlo con cura per esporre il sito di prelievo e prelevare il campione di tessuto (Figura 2H). Assicurarsi che la sonda sia posizionata con precisione all'interno dell'avventizia dell'arteria e della vena femorale (Figura 2I). Fissa la sonda alla pelle prima di suturare (Figura 2J). Eseguire tutte le procedure in condizioni asettiche rigorose, facendo attenzione a evitare disturbi dell'avvertizia vascolare e a prevenire l'infiammazione dei tessuti o reazioni di corpi estranei che potrebbero compromettere la raccolta del liquido tissutale.
  11. Verifica la posizione della sonda fotografando un righello chirurgico insieme alla sonda fissa per documentare la lunghezza esposta e presenta questa immagine come mostrato nella Figura 2I.
  12. Eseguire un'incisione cutanea di 2 cm di circa 0,5 cm laterale alla linea mediana del collo, iniziando 1 cm sopra la tacca sternale.
  13. Si seziona in modo diretto attraverso il muscolo sternocleidomastoideo per esporre la vena giugulare, che si trova lateralmente rispetto all'arteria carotide ed è identificata dalla sua colorazione blu scuro. Usa un cotton fioc umido per separare delicatamente la fascia, facendo attenzione a evitare il contatto con il nervo vago.
  14. Utilizzando una pinza microscopica, sollevare delicatamente la membrana esterna della vena giugulare e rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante per ottenere almeno 1 cm di lunghezza del vaso libero. Posizionare una sutura di seta 4-0 prossimalmente per fungere da legatura di riserva (Figura 2K).
  15. Per la puntura venosa, si effettua un'incisione obliqua con un angolo di 45°, circa un terzo del diametro del vaso. Usa microforceps per aprire delicatamente l'incisione e creare un ingresso per l'inserimento della sonda.
  16. Inserire con attenzione la punta della sonda nella vena e avanzare lentamente fino a una profondità di 3,5-4,0 cm, assicurandosi che la punta raggiunga l'ingresso dell'atrio destro (Figura 2L).
  17. Fissare la sonda stringendo la legatura prossimale di seta con un doppio nodo. Chiudi lo strato muscolare usando punti di sutura 4-0 Vicryl, poi sutura la pelle con punti interrotti. Fissa la parte esterna della sonda alla superficie della pelle per evitare lo spostamento.

4. Raccolta del campione e recupero della sonda

  1. Raccolta del campione: Valutare la relazione tra dialisi tissutale e trasferimento del campione nel tubo di raccolta. Mantenere un volume totale di 20 μL tra la sonda e il collettore.
    1. Lascia un periodo di 20 minuti affinché il campione attraversi la sonda e il tubo e raggiunga la fine del tubo per la raccolta a una portata di 1 μL/min. Raccogliere un volume adeguato per raggiungere la concentrazione richiesta per il saggio. Raccogliere 30 μL di dialisato per ogni tubo di raccolta.
  2. Conservazione del campione: Pre-raffreddare i tubi di raccolta polipropilene da 0,5 mL a 4 °C. Subito dopo la raccolta, chiudi i tubi, congelali rapidamente in azoto liquido per 30 secondi e trasferili in un congelatore a -80 °C entro 2 minuti.
  3. Campione di base: bilanciamento completo del campione prima di iniziare la raccolta del campione. Raccogliere tre campioni per ratto sotto anestesia per stabilire una base di misura stabile.
  4. Rimozione della sonda: Rimuovere la sonda dalla testa dell'animale al termine della raccolta del campione e inserirla in una fiala contenente l'1% di eparina sodio. Eutanasia l'animale inalando un eccesso di isoflurano.
  5. Conservazione della sonda: Risciacqua accuratamente la sonda con soluzione salina e conservala in una fiala contenente soluzione salina. Risciacquo i tubi con soluzione salina usando una siringa per prevenire la crescita microbica. Riutilizzare la sonda solo se mantiene un flusso sufficiente e la membrana rimane intatta.

5. Analisi dei dati

  1. Eseguire analisi delle componenti principali (PCA), analisi discriminante ortogonale parziale dei minimi quadrati (OPLS-DA) e ulteriori analisi statistiche utilizzando MetaboAnalyst 6.0. Usa OPLS-DA specificamente per determinare l'Importanza Variabile nella Proiezione (VIP).
  2. Applicare test non parametrici, inclusi valutazioni dei valori P e analisi del cambiamento di pieghe, per esaminare i metaboliti differenziali. Stabilire soglie critiche per lo screening dei metaboliti differenziali come VIP > 1, FC ≥ 2 o FC ≤ 0,5, e P < 0,05.
  3. Annota i metaboliti identificati utilizzando il database dei composti KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. Eseguire la quantificazione dei metaboliti utilizzando uno spettrometro di massa quadrupolo triplo AB Sciex 6500+ dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) operata in modalità ionica positiva.
  2. Imposta i parametri dello strumento come segue: gas a cortina, 40 psi; gas di collisione, 10 psi; gas sorgente ionica 1 (GS1), 50 psi; gas sorgente ionica 2 (GS2), 55 psi; tensione di spruzzatura ionica, 4500 V; e la temperatura della sorgente, 550 °C.
  3. Fai funzionare il sistema in modalità di monitoraggio a reazione multipla (MRM). Ottimizzare le transizioni MRM, i potenziali di declustering e le energie di collisione individualmente per ogni metabolita. Effettuare acquisizione dati utilizzando il software Analyst 1.7.1 e analisi quantitativa usando MultiQuant 3.0.3.
  4. Per la separazione cromatica, si utilizza una colonna C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) mantenuta a 45 °C. Preparare le fasi mobili come (A) acido formico allo 0,1% in acqua e (B) acido formico allo 0,1% nell'acetonitrile. Imposta la portata a 0,35 mL/min e il volume di iniezione a 6 μL. Mantieni la temperatura dell'autocampionatore a 4 °C prima dell'analisi.
    NOTA: Per questo studio, ogni corsa è durata circa 25 minuti in totale.

Risultati

Il dataset è stato normalizzato applicando sommazione e trasformazioni logaritmiche, per poi essere sottoposto a un insieme completo di analisi statistiche. È stata condotta un'Analisi dei Componenti Principali (PCA) (Figura 3A), che ha rivelato separazioni distinte e evidenziato differenze metaboliche. Successivamente, è stato sviluppato un modello di Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA), con i punteggi risultanti rappresentati nella Figura 3B, che dimostrano l'efficacia discriminatoria del modello. Nella valutazione di 618 metaboliti, i grafici vulcanici che confrontano AISF e campioni di sangue hanno identificato 146 metaboliti differenziali, con liquidi tissutali che metaboliti sia sotto-regolati che rialzati (Figura 3C). Inoltre, è stata creata una mappa termica per fornire una panoramica comparativa dei 50 principali metaboliti differenziali (Figura 3D).

Per valutare l'affidabilità del metodo di campionamento, sono stati utilizzati serotonina e acido lattico come controlli positivi che rappresentano rispettivamente componenti del liquido tissutale e il sangue. I risultati si sono allineati con i modelli di distribuzione stabiliti di questi componenti tra vari fluidi corporei, come illustrato nella Figura 4. La Figura Supplementare 1 mostra la stabilità del lattato e della serotonina nelle aliquote di microdialisi conservate a -80 °C.

I 146 metaboliti differenziali furono sistematicamente classificati in diverse categorie: nucleosidi, nucleotidi e i loro analoghi; acidi grassi e i loro derivati; amminoacidi, peptidi e i loro analoghi; carboidrati e coniugati di carboidrati; acidi organici e i loro derivati; ammini biogeniche; purine e pirimidine; vitamine e steroidi; così come altri composti (Figura 5A). La Tabella Supplementare 1 mostra i metaboliti differenziali rilevati nel sangue. Le analisi delle mappe termiche chiariscono ulteriormente i modelli di arricchimento di amine biogeniche e amminoacidi, peptidi e i loro analoghi in vari fluidi corporei (Figura 5B,C). L'analisi differenziale dell'arricchimento metabolitico è presentata nella Figura 6. La Tabella Supplementare 2 elenca il coefficiente di variazione (CV) per quindici metaboliti selezionati casualmente in tre campioni consecutivi di tessuto perivascolare-fluido.

Figura 1
Figura 1: Immagini dell'apparecchio sperimentale. (A) Collettore di frazioni refrigerato. (B) Pompa per siringa. (C) Microsiringhe. (D) Strumenti chirurgici, inclusi forbici vascolari e pinzette, ecc. (E) Macchina per anestesia. (F) Sonde per microdialisi. (G) Sonde per microdialisi, ago guida tissutale e un tubo strappabile. (H) Assemblaggi di ago guida per tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: I passaggi chiave dello studio. (A) Una rappresentazione schematica che raffigura un diagramma che illustra la posizione del sito chirurgico e l'orientamento della sonda. (B) Identificazione delle giunzioni vascolari critiche per garantire un'osservazione precisa dei siti di posizionamento della sonda. (C) Inserimento dell'ago guida che penetra la pelle e avanza nello spazio tissutale. (D) La ritrazione degli aghi guida viene ritirata, lasciando il tubo strappabile all'interno del tessuto. (E) La sonda di microdialisi viene introdotta nel tessuto tramite il canale stabilito. (F) Delicata ritrazione del tubo strappabile. Il tubo strappabile viene delicatamente ritirato dopo aver fissato la sonda in posizione. (G) Visualizzazione delle sonde posizionate nell'epitelio dei vasi arteriosi e venosi femori. (H) Separazione del tessuto dalla vena giugulare. (I) Posizionamento della sonda nella vena giugulare. (J) La sonda di microdialisi è fissata sulla superficie della pelle. (K) isolamento della vena giugulare. (L) Inserimento della sonda nella vena giugulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Analisi statistica multivariata del fluido interstiziale (ISF) e del sangue. (A) I dati sono stati ridimensionati per enfatizzare separazioni significative, mostrando differenze nette tra ISF e componenti sanguigni. (B) I punteggi ortogonali dell'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali (OPLS-DA) indicano valori R2Y e Q2 rispettivamente di 0,925 e 0,811. (C) Il grafico vulcanico mostra 146 metaboliti differenziali, con 85 metaboliti sottoregolati e 61 regolati al rialzo nell'ISF. (D) Di conseguenza, le mappe termiche che contrappongono i primi 30 metaboliti in ISF e sangue rivelano una chiara distinzione tra i due gruppi di componenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: La presentazione di una serie di box plot ha chiarito i livelli di arricchimento di lattato e serotonina nell'ISF e nel sangue. Tutti i punti dati rappresentano la media ± SEM; Le barre di errore sono mostrate per tutti i pannelli quantitativi. Il pannello (A) illustra che i campioni ISF mostrano un arricchimento significativamente maggiore del lattato rispetto ai campioni di sangue. Al contrario, il pannello (B) dimostra che la serotonina è più arricchita nei campioni di sangue, che contemporaneamente mostrano livelli di lattato più bassi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Sono raffigurati la tabella dell'anello di classificazione dei metaboliti differenziali e la mappa termica di amminoacidi, peptidi e analoghi, così come ammine biogeniche. (A) Ogni blocco di colore corrisponde a una classe distinta di metaboliti. Amminoacidi, peptidi e analoghi rappresentano la categoria più ampia, comprendendo il 19,29% del totale, seguiti da nucleosidi, nucleotidi e analoghi (15%), acidi grassi e derivati (12,86%), carboidrati e coniugati di carboidrati (7,86%), acidi organici e derivati (10%), amine biogeniche (7,14%), purine/pirimidine (5,71%), vitamine e steroidi (8,57%) e altri composti, tra cui indoli, azepine, piridine e benzene, con il 13,57%. (B) Nel liquido interstiziale (ISF), i livelli di arricchimento di composti come Deossicarnitina e Spermidina nella categoria delle ammine biogeniche sono significativamente elevati rispetto a quelli nel sangue, mentre i livelli di Serotonina (D4), Serotonina, Triptamina e composti correlati sono significativamente ridotti. (C) Nell'ISF, la maggior parte dei metaboliti associati ad amminoacidi, peptidi e analoghi è nettamente inferiore a quella osservata nel sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: L'analisi dell'arricchimento degli insiemi metabolitici (MSEA) del fluido interstiziale normale ha rivelato che l'attività metabolica è prevalentemente distribuita su vie relative alla produzione di energia, all'omeostasi redox e al ricambio degli amminoacidi. Le vie più arricchite includono il metabolismo del butanoato, il metabolismo delle purine e il metabolismo del glutatione, che riflettono il mantenimento dell'apporto energetico mitocondriale e la capacità antiossidante in condizioni fisiologiche. Inoltre, sono rappresentate diverse vie correlate agli amminoacidi, come il metabolismo dell'arginina e della prolina, il metabolismo del triptofano e il metabolismo della cisteina e della metionina, che indicano l'interconversione attiva degli amminoacidi e la regolazione dell'equilibrio dell'azoto nel microambiente extracellulare. Questi risultati suggeriscono che il metaboloma interstiziale normale mantiene un equilibrio dinamico tra processi bioenergetici, difesa ossidativa e metabolismo degli amminoacidi, supportando l'omeostasi tissutale e la stabilità microcircolatoria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Stabilità del lattato e della serotonina nelle aliquote di microdialisi conservate a -80 °C. I dati sono media ± SEM (n = 6 repliche per punto temporale). Nessun analita si è discostato del >5% dalla base per oltre 72 ore. Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 1: Metaboliti differenziali rilevati nel sangue e nel microdialisato del liquido interstiziale avventiziale. Questo include il nome del metabolito, il cambiamento di piega (FC), il valore P del test t di Student e VIP (OPLS-DA). Clicca qui per scaricare questo File.

Tabella supplementare 2: Coefficiente di variazione (CV) per quindici metaboliti selezionati casualmente in tre campioni consecutivi di tessuto perivascolare-fluido. Tutti i CV sono <20%. Clicca qui per scaricare questo File.

Discussione

Il liquido interstiziale (ISF) è il microambiente acquoso che avvolge ogni cellula tissutale e costituisce circa il 75% del compartimento del liquidoextracellulare 8,9. Generata dalla filtrazione capillare del plasma, l'ISF non ha il contenuto cellulare e ad alto contenuto proteico del sangue ma trattiene elettroliti, piccoli soluti eacqua 9. Questa composizione posiziona l'ISF come interfaccia centrale tra il mondo vascolare e quello cellulare. Dal punto di vista funzionale, l'ISF è un mezzo di trasporto dinamico. Trasporta ossigeno, glucosio, amminoacidi e micronutrienti dal flusso sanguigno alle cellule, raccogliendo contemporaneamente anidride carbonica, urea e altri rifiuti metabolici per il ritorno allacircolazione. Il fluido funge anche da lubrificante e tampone, stabilizzando la pressione osmotica interstiziale, il pH e l'equilibrioionico 11. Oltre al metabolismo, l'ISF supporta la sorveglianza immunitaria trasportando leucociti, anticorpi e citochine attraverso gli spazi tissutali e agisce come autostrada di comunicazione per ormoni e segnaliparacrini 12,13. Rispetto al sangue, l'ISF è essenzialmente un filtrato14 privo di cellule e a basso contenuto proteico. Il sangue, confinato all'albero vascolare, contiene globuli rossi e bianchi, piastrine e alte concentrazioni di albumina e fattori di coagulazione. I livelli di ossigeno e nutrienti sono più alti nel sangue e progressivamente più bassi nell'ISF a causa dell'assorbimento cellulare, mentre i prodotti di scarto si accumulano nell'ISF prima di entrare nel ritorno linfaticoo venoso 10. L'assenza di proteine e cellule grandi nella normale ISF minimizza la pressione oncotica e permette una diffusione rapida, ma gli stati infiammatori possono alterare temporaneamente questoprofilo 15.

Tuttavia, lo studio dell'ISF rimane limitato a causa dell'assenza di metodologie di campionamento semplici, rapide e affidabili. I metodi attuali includono cerotti a microago (MN), vesciche di aspirazione, iontoforesi inversa, ablazione termica e microdialisi. Le patch MN creano microcanali per l'estrazione dell'ISF attraverso la pelle, con varianti a guscio centrale che estraggono ISF in meno di 30 secondi e MNs idrogel osmotici in circa 3 minuti. Questi possono essere combinati con sensori per l'analisi on-patch, ma sono limitati dal volume e richiedono un equilibrio tra resistenza e gonfiore. Le vesciche di aspirazione forniscono ISF puro con una contaminazione sanguigna minima ma sono invasive, dolorose elente 16,17,18. L'iontoforesi inversa (RI) utilizza basse correnti elettriche per trasportare analiti carichi, come glucosio e ioni di litio, sulla superficie cutanea per un monitoraggio non invasivo. Tuttavia, affronta sfide come basso rendimento, variabilità tra individui e potenziale irritazionecutanea 19,20. La somministrazione transdermica (TA) interrompe lo strato corneo con un riscaldamento localizzato, permettendo agli ISF di entrare passivamente nei microcanali idrofili. Sebbene il design del dispositivo sia più semplice, raccoglie meno di 5 μL di fluido, richiedendo una rilevazione altamente sensibile e una gestione termica attenta per evitareustioni 21,22. Al contrario, la microdialisi (MD), che si basa sulla diffusione tra sonde semipermeabili impiantate, offre una selettività molecolare unica tramite membrane a taglio del peso molecolare regolabile (MWCO), come 10 kDa per il glucosio e 100 kDa per proteine ecitochine 23,24. Questa tecnica supporta un campionamento continuo e minimamente invasivo. Tuttavia, la MD è operativamente complessa, richiede una calibrazione in vivo e mostra tassi di recupero variabili per le specie idrofobe. In particolare, la MD è l'unica tecnica in grado di isolare selettivamente la dimensione di grandibiomolecole 25. Studi comparativi su dialisi raccolti adiacenti all'avventità vascolare rispetto al sangue mostrano profili distinti di lattato e serotonina, convalidando così la stabilità e la specificità dell'approccio MD.

Studi su animali hanno dimostrato che, regolata sinergicamente da cuore e polmoni, l'ISF può fluire nell'avventizia associata a grandi arterie, vene e nerviperiferici 5,9. Di solito, l'ISF contiene metaboliti derivati direttamente dal plasma e sintetizzati localmente neitessuti 26,27,28. È quindi plausibile che le sovrapposizioni e le differenze identificate tra i metaboliti in AISF e plasma rappresentino il coinvolgimento del sistema circolatorio ISF nel trasporto e nella liberazione di nutrienti e metaboliti nei tessuti lungo la vascolatura. La tecnica basata sulla microdialisi introdotta qui per il campionamento dell'AISF migliorerà significativamente gli studi sulla circolazione sistemica dell'ISF nella regolazione del metabolismo in molteplici organi e tessuti in tutto il corpo.

La membrana a 20 kDa con soglia molecolare (MWCO) utilizzata in questo studio è progettata in modo ottimale per il recupero quantitativo di piccoli metaboliti, inclusi glucosio, lattato, piruvato e amminoacidi. Tuttavia, esso campiona costantemente o esclude completamente numerose macromolecole biologicamente significative, come citochine, chemicine, fattori di crescita ed enzimi extracellulari. Revisioni cliniche e metodologiche hanno evidenziato che i cateteri standard da 20 kDa sono efficaci nel raccogliere piccoli metaboliti idrofili, eppure mostrano bassi tassi di recupero per proteine e mediatori infiammatori29. Di conseguenza, sono necessarie membrane con MWCO più elevati (ad esempio, 100 kDa) o strategie di campionamento alternative per una quantificazione accuratadelle citochine 30,31. Pertanto, le future ricerche condotte dal nostro gruppo utilizzeranno membrane con MWCO più grandi per caratterizzare la composizione macromolecolare del fluido interstiziale periferico. In questo studio, i dialisi sono stati raccolti sotto anestesia generale. La microdialisi è stata precedentemente validata in animali svegli e in movimento libero, e diverse tecniche di microperfusione a flusso aperto sono state adattate per l'uso nei modellicoscienti 32. Tuttavia, adattare il nostro protocollo di progettazione e impianto della sonda per l'uso negli animali svegli richiederà di affrontare sfide legate al tanchoring, allo stress animale, alla stabilità della sonda, agli artefatti di movimento e alla permeabilità a lungo termine. Attualmente siamo in fase di sviluppo di un sistema leggero di collegamento e girezione e prevediamo di effettuare un campionamento cosciente nel nostro prossimo studio.

Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse finanziari da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Programma Nazionale Chiave di Ricerca e Sviluppo della Cina (2025YFC3507601) e dai Fondi di Ricerca Fondamentale per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ-YC2023007).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema di monitoraggio ECGAD Instruments, AustraliaPowerLabAttrezzatura
PinzaF.S.T. (Fine Science Tools) Germania11252-00Strumenti chirurgici
Eparina sodicaSigma-Aldrich, USA9041-08-1Materiale
Cromatografia liquida ad alte prestazioni spettrometro di massa tandem (HPLC-MS/MS)SCIEX, USAExionLC-20ACAttrezzatura
Forbici standard IRISF.S.T. (Fine Science Tools) Germania14060-09Strumenti chirurgici
IsofluranoScienze della Vita RWD, RPCR510-22-10Materiale
Sistema di anestesia a basso flussoKent Scientific, USASomnoSuiteAttrezzatura
Fluido di perfusione per microdialisi T1Microdialisi CMA, SveziaP000034Materiale
Sonda per microdialisi, 20 EliteMicrodialisi CMA, Svezia8010436Materiale
Siringhe per microdialisi 1 mL GastightMicrodialisi CMA, Svezia8309020Materiale
Collettore di frazioni refrigeratoMicrodialisi CMA, Svezia470Attrezzatura
Tubo diviso per sonde CMA 20Microdialisi CMA, Svezia8309019Materiale
Microscopio stereoscopicoOlympus, GiapponeSZ61Attrezzatura
Pompa a siringaCMA MD AB, Svezia800310Attrezzatura

Riferimenti

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

Ristampe e permessi

Tag

ISF avventizialearteria femorale di rattoprofilazione metabolicaanalisi delle componenti principalimetaboliti a basso peso molecolarescoperta di biomarcatoripatofisiologia vascolare
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.