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Articolo metodologico

Sviluppo e convalida di una metodologia per stabilire modelli di ratto obesi con pancreas grasso tipico

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DOI:

10.3791/69553

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11 novembre 2025

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1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio offre un metodo riproducibile e standardizzato al fine di stabilire modelli di ratto obesi che mostrano obesità semplice, comunemente caratterizzata da pancreas grasso. Include anche protocolli dettagliati per il campionamento del tessuto pancreatico e l'immunoistochimica.

Abstract

L'obesità è emersa come un'epidemia sanitaria globale predominante, con quasi la metà della popolazione mondiale ora classificata come sovrappeso o obesa. Una caratteristica patologica chiave negli individui obesi è la deposizione ectopica di lipidi nei tessuti non adiposi, inclusa la condizione pancreatica-a chiamata steatosi pancreatica o pancreas grasso. Nei modelli di roditori indotti da diete ricche di grassi (HFD), la steatosi pancreatica precede costantemente la steatosi epatica, sottolineando la particolare suscettibilità del pancreas all'accumulo di lipidi. Questo coinvolgimento precoce posiziona il pancreas come un organo critico per la comprensione della disregolazione metabolica nell'obesità. Sebbene i ratti obesi indotti dalla dieta (DIO) ricapitolino gli aspetti fondamentali della progressione della malattia umana, i modelli animali ben caratterizzati che mostrano in modo affidabile questo fenotipo pancreatico rimangono scarsi in letteratura.

Una considerazione metodologica significativa nella modellazione dell'obesità umana è la tempistica dell'introduzione dell'HFD. Molti modelli esistenti avviano l'HFD durante il periodo di svezzamento, il che può introdurre effetti confondenti della programmazione metabolica dello sviluppo che non riflettono pienamente l'obesità umana, che si sviluppa principalmente dopo lo sviluppo. Al contrario, il presente studio stabilisce un protocollo standardizzato in cui l'HFD viene introdotto dopo lo svezzamento. Questo approccio imita più accuratamente la traiettoria umana comune dell'insorgenza dell'obesità in età adulta, evita gli adattamenti metabolici precoci della vita e si traduce in una progressione fisiologicamente più rilevante verso la steatosi pancreatica.

Questa ricerca fornisce un quadro dettagliato e riproducibile per generare un modello di obesità nel ratto caratterizzato da una patologia prominente del pancreas grasso. La metodologia include una fase di acclimatazione di 1 settimana, un periodo di induzione HFD di 14 settimane a partire dallo svezzamento e il prelievo sistematico dei tessuti. Vengono descritte due vie di processamento tissutale: lo snap-freezing per analisi molecolari (ad esempio, Western blotting) e la fissazione della perfusione di paraformaldeide per valutazioni morfologiche (ad esempio, IHC, H&E). Questo modello offre una solida piattaforma per indagini meccanicistiche sulla disfunzione metabolica pancreatica associata all'obesità.

Introduzione

L'obesità semplice è definita come l'obesità che esiste in modo indipendente senza altre comorbidità, principalmente attribuita a uno squilibrio energetico derivante da stili di vita malsani, come modelli alimentari scorrettie attività fisica insufficiente1. L'obesità contribuisce in modo significativo all'aumento dell'incidenza di malattie non trasmissibili tra le popolazioni più giovani, caratterizzate da alti tassi di prevalenza, insorgenza precoce e complicanze multisistemiche, posizionandola come una sfida critica per la salute pubblica globale2. Il pancreas grasso è una condizione caratterizzata dalla deposizione ectopica di lipidi in questo organo non adiposo durante la disregolazione metabolica. Il pancreas grasso riflette un'interazione critica tra tessuto adiposo e fisiopatologia pancreatica. L'eccessivo accumulo di grasso pancreatico sposta i normali tessuti acinari e insulari, inducendo una doppia compromissione funzionale sia della capacità esocrina che di quella endocrina 3,4. Questo processo patologico interrompe i rapporti α/β cellule, promuove la dedifferenziazione delle cellule β con conseguente perdita della funzione secretoria dell'insulina5 e media il danno lipotossico diretto alle cellule β6. Allo stesso tempo, la proliferazione delle cellule α e il rilascio disregolato di insulina esacerbano l'instabilità glicemica, accelerando la progressione verso il diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e le complicanze associate7.

Lo studio della patogenesi del pancreas grasso rivela nuovi meccanismi alla base della progressione della malattia metabolica8. Mentre la precedente ricerca sull'obesità enfatizzava la steatosi epatica, le prove emergenti identificano la deposizione di lipidi pancreatici come un evento precedente nella disregolazione metabolica9. Questo cambiamento di paradigma consente la costruzione di un modello di patologia a doppio organo per l'obesità semplice, integrando la steatosi pancreatica ed epatica10. Lo studio del loro cross-talk può chiarire percorsi critici attraverso lo spettro della malattia che abbracciano il disturbo del metabolismo lipidico, l'obesità, l'insulino-resistenza e il diabete, offrendo nuove intuizioni sui meccanismi della malattia11. Nel processo patologico del pancreas, la manifestazione iniziale è una significativa deposizione di grasso pancreatico, accompagnata da una sostanziale espansione degli adipociti pancreatici. Ciò si osserva prevalentemente nell'aspetto ventrale della testa, del collo e delle regioni del corpo del pancreas e si trova principalmente all'interno delle aree interstiziali tra le cellule acinose e le cellule insulari. Allo stesso tempo, è presente un'infiammazione cronica di basso grado del pancreas, mentre sia le funzioni endocrine che quelle esocrine rimangono in gran parte intatte in questa fase12,13. Un'estesa infiltrazione di grasso compromette ulteriormente la funzione delle cellule β pancreatiche attraverso la lipotossicità e sopprime l'attività dell'insulina. Durante questa fase, le cellule acinose vengono progressivamente sostituite dagli adipociti, contribuendo così allo sviluppo del T2DM14,15. Sebbene il diabete mellito non sia un fattore di rischio indipendente per il cancro del pancreas, i pazienti con una storia di pancreatite acuta e diabete mostrano un rischio significativamente elevato di sviluppare il cancro del pancreas16.

Le analisi anatomiche macroscopiche quantificano la gravità della steatosi pancreatica e i pattern di infiltrazione, mentre le valutazioni IHC a livello microscopico caratterizzano la morfologia delle cellule acinose, il posizionamento nucleare, la frequenza di vacuolizzazione e la dinamica della popolazione cellulare17. Questo approccio multimodale, che spazia dall'osservazione anatomica macroscopica all'IHC a risoluzione cellulare, consente una stadiazione completa della patologia pancreatica attraverso la progressione della malattia. Il presente studio descrive in dettaglio un protocollo standardizzato che comprende un'acclimatazione di 1 settimana, un'induzione dell'obesità di 14 settimane nei ratti adulti e l'elaborazione ottimizzata del tessuto pancreatico per l'analisi morfologica, stabilendo un solido quadro per lo studio degli squilibri metabolici associati alla steatosi.

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Protocollo

La procedura di trattamento degli animali è stata approvata dal Comitato etico animale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Nanchino (202006A016) ed è conforme alle linee guida ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments), alle linee guida etiche, alle linee guida sul funzionamento dell'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 e alle linee guida associate, Direttiva UE 2010/63 per la protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici. Tutti gli animali da esperimento sono stati anestetizzati in conformità con le procedure di anestesia dei roditori approvate prima della dissezione. La procedura è stata organizzata in tre componenti distinte.

1. Stabilire un modello di ratto obeso

  1. Animali da esperimento e gruppi
    1. Selezionare ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) di età compresa tra 4 settimane (80-120 g) provenienti da un ceppo sensibile alla dieta ricca di grassi (HFD).
    2. Acclimatare tutti i ratti a una dieta di mantenimento per una settimana, quindi dividerli casualmente in due gruppi: il gruppo di controllo e il gruppo modello.
    3. Sostituire la dieta di mantenimento con HFD per il gruppo modello dopo una settimana, mantenendo il gruppo di controllo sulla dieta originale. Mantieni entrambi i gruppi a dieta per 14 settimane. La composizione dell'HFD è descritta in dettaglio nella Tabella 1 e la formulazione standard del mangime di mantenimento è nella Tabella 2.
  2. Condizioni di alimentazione e parametri sperimentali
    1. Parametri ambientali: temperatura 22 ± 2 °C, umidità 50 ± 10%, ciclo luce/buio 12 ore e libero accesso all'acqua e al cibo.
  3. Indicatori di monitoraggio
    1. Registra il peso corporeo e l'assunzione di cibo settimanalmente a un'ora fissa.
      NOTA: farlo la sera può ridurre al minimo lo stress e allinearsi con i modelli di attività diurna/notturna18.
    2. Traccia una curva di crescita del peso corporeo utilizzando i dati registrati.
    3. Definire il modello di obesità di successo come quando il peso corporeo supera il 20% del gruppo di controllo della stessa età.
IngredienteContenuto (g/kg)Principali nutrienti forniti
Mangime in polvere ordinario365Apporto nutrizionale di base di carboidrati, proteine vegetali, grassi, complessi vitaminici, minerali, ecc
Strutto310Acidi grassi saturi, Acidi grassi insaturi
Caseina250Aminoacidi essenziali
Colesterolo10Colesterolo
Miscela di cellulosa e minerali60Fibra, calcio, fosforo, sodio, ecc
DL-Metionina Metionina/Aminoacidi metionina3Aminoacidi essenziali
Lievito1Vitamine del gruppo B, β-glucano, ecc
NaCl1NaCl

Tabella 1: Formulazione speciale di HFD per stabilire la DIO nei modelli di ratto. La tabella descrive in dettaglio la composizione specifica dell'HFD utilizzata in questo studio per il gruppo modello, che è stata somministrata dalla fine del periodo di acclimatazione fino alla raccolta dei tessuti.

IngredienteContenutoUnità
Umidità12.196%
Proteina grezza (CP%)18.272%
Energia digeribile (DE)3.186Mcal/kg
Energia Metabolizzabile (ME)2.939Mcal/kg
Energia netta (NE)2.228Mcal/kg
Estratto di etere (EE%)4.417%
Fibra grezza (CF%)3.677%
Calcio (Ca%)0.991%
Fosforo totale0.681%
(P% totale)
Fosforo non fitato0.19%
Sale0.407%
Lisina1.118%
Lisina Digeribile0.813%
Metionina0.53%
Treonina0.779%
Triptofano0.221%
Rame (Cu)22.06mg/kg
Ferro (Fe)173.69mg/kg
Manganese (Mn)102.1176mg/kg
Zinco (Zn)60.3687mg/kg

Tabella 2: Formula standard del mangime di mantenimento nei ratti. La tabella presenta la formulazione del mangime di mantenimento standard, che è stato fornito a tutti i ratti durante la fase di acclimatazione e al gruppo di controllo per tutta la durata dello studio.

2. Prelievo di tessuti

  1. Preparazione preoperatoria
    1. Trattamento del digiuno: 12 ore di restrizione alimentare prima dell'eutanasia per ridurre al minimo l'interferenza del contenuto intestinale con le analisi biochimiche.
    2. Anestesia: somministrare isoflurano per inalazione per anestesia profonda (concentrazione di induzione 4%, concentrazione di mantenimento 1,5-2%). La macchina per anestesia era dotata di un vaporizzatore per isoflurano e la concentrazione di anestetico veniva mantenuta a 1,5-2. Come riferimento per la preparazione, il consumo fisico di isoflurano liquido è stato di circa 0,5 mL-0,8 mL per ratto per l'intera procedura.
    3. Monitora la profondità dell'anestesia: monitora continuamente la frequenza respiratoria e i riflessi corneali. Mantenere uno stato anestetico prolungato durante tutta la procedura per prevenire l'autolisi pancreatica post mortem.
    4. Gestire l'anestesia insufficiente: se la profondità dell'anestesia è inadeguata o la coscienza si ripresenta, somministrare immediatamente il 20% di uretano per via intraperitoneale per anestesia supplementare (50 mg/kg) e ricontrollare i segni vitali prima di continuare. Preparare una soluzione di uretano al 20% sciogliendo la polvere di uretano in soluzione fisiologica.
      NOTA: L'anestesia con isoflurano è il metodo conforme ai requisiti etici del Centro Sperimentale per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino. Per questa procedura terminale, l'iniezione intraperitoneale di uretano al 20% può essere utilizzata come alternativa accettabile. Tuttavia, le prove esistenti suggeriscono che l'isoflurano può offrire un profilo di sicurezza più elevato rispetto alla ketamina nei roditori19.
  2. Prelievo di tessuti freschi
    1. Disinfezione della pelle: spruzzare rapidamente etanolo al 75% su tutto il corpo (1-2 s) per prevenire la contaminazione dei peli degli organi addominali.
    2. Posizionamento del fissaggio: posizionare il ratto supino sul tavolo di dissezione e fissare saldamente tutti e quattro gli arti con perni a testa larga.
    3. Afferra la pelle addominale con una pinza nella mano sinistra e incidi la pelle lungo la linea mediana (dallo xifoide al pube) usando le forbici della mano destra. Sezionare senza mezzi termini la fascia sottocutanea per separare il tessuto connettivo e tagliare il muscolo retto dell'addome e il peritoneo lungo la stessa linea mediana.
    4. Identificazione del pancreas: spostare delicatamente l'intestino a sinistra per visualizzare lo stomaco, la milza e il duodeno. La milza è attaccata alla coda del pancreas e lo stomaco è vicino al pancreas.
    5. Dissezione rapida: sollevare delicatamente la milza con una pinza e isolare il pancreas tagliando progressivamente i suoi attacchi alla milza, allo stomaco e al mesentere duodenale. A causa della sua consistenza fragile, evita il clampaggio diretto del parenchima pancreatico e preserva i dotti/vasi sanguigni pancreatici per prevenire la lacerazione dei tessuti.
    6. Conservazione dei tessuti: Sciacquare rapidamente il pancreas sezionato con PBS ghiacciato (1× soluzione salina tamponata con fosfato, PH 7,4) o soluzione salina per rimuovere il sangue residuo. Trasferire immediatamente il pancreas in una provetta di congelamento da 2 mL, immergerlo in azoto liquido entro 30 s e conservare a lungo termine a -80 °C.
    7. Eutanasia ed eliminazione della carcassa Dopo la raccolta dei tessuti, sopprimere tutti i ratti sperimentali mediante lussazione cervicale. Secondo le normative del Centro Sperimentale per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino, le carcasse di animali sono classificate come rifiuti biomedici patologici (Codice dei rifiuti: 831-003-01). Sigillare tutte le carcasse di animali in sacchetti ermetici secondo le normative e conservarle uniformemente negli appositi congelatori. Lo smaltimento centralizzato e rispettoso dell'ambiente sarà condotto dall'università. In nessun caso le carcasse devono essere scartate arbitrariamente.
      NOTA: Evitare l'esposizione a temperatura ambiente per prevenire la degradazione enzimatica delle biomolecole20,21.
  3. Prelievo di tessuto di perfusione (le fasi rimanenti sono le stesse)
    1. Esporre il cuore: sollevare il tessuto cutaneo del ratto con la mano sinistra e aprire la cavità toracica con la mano destra per esporre completamente il cuore.
    2. Preparare il ventricolo sinistro per la perfusione: praticare una piccola incisione sul ventricolo sinistro (dimensioni corrispondenti al diametro dell'ago di perfusione) e incidere il padiglione auricolare destro per consentire il deflusso del sangue.
    3. Soluzione fisiologica: inserire delicatamente l'ago da perfusione nel ventricolo sinistro e perfondere lentamente 100 ml di soluzione fisiologica a una velocità di flusso di 10 ml/min fino a quando il deflusso atriale destro diventa chiaro.
    4. Fissativo perfusi: Passare a 200 mL di fissativo paraformaldeide al 4%, portata: 5 mL/min. Perfondere ogni ratto con 100 mL di soluzione fisiologica, seguiti da 200 mL di paraformaldeide al 4%. Questo studio ha utilizzato una soluzione di PFA preparata commercialmente. A causa dell'instabilità del PFA in soluzione, con un notevole potenziale di variabilità a seconda della preparazione e della freschezza, la soluzione liquida deve essere protetta dalla luce e conservata a 4 °C. Utilizzare prontamente un'aliquota aperta per garantirne l'efficacia. Se preparata in polvere, la soluzione deve essere preparata al momento immediatamente prima dell'uso.
      NOTA: Indossare guanti, occhiali protettivi e un camice da laboratorio; Eseguire in una cappa aspirante perché la paraformaldeide è tossica. Secondo le normative del Centro Sperimentale per gli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino, i rifiuti di paraformaldeide sono classificati come rifiuti chimici biomedici (Codice dei rifiuti: 831-004-01). Dopo l'uso, deve essere conservato in un apposito contenitore per rifiuti etichettato con il simbolo di rischio biologico. Lo smaltimento centralizzato è effettuato dall'università. In nessun caso può essere gettato in modo improprio.
    5. Confermare il successo della perfusione: verificare la rigidità degli arti indicando una fissazione efficace.
    6. Mettere il pancreas in una provetta da centrifuga da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di paraformaldeide al 4%. Fissare il tessuto conservando la provetta ferma al buio per 2-4 ore.
    7. Trasferire il pancreas in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di etanolo al 70%. Tenere il tubo fermo e al riparo dalla luce per circa 20-24 h22.
    8. Inclusione in paraffina: Incorporare i tessuti nella cera di paraffina. Conservare i fazzoletti incorporati a 4 °C o -20 °C.
      NOTA: Questo studio ha utilizzato sezioni di paraffina. Le sezioni congelate sono una valida alternativa, ma le prestazioni degli anticorpi devono essere verificate in anticipo per il tipo di sezione specifico per garantire risultati ottimali.

3. Colorazione immunoistochimica (IHC) del pancreas

  1. Protocollo di sezionamento e montaggio
    1. Sezioni di paraffina: Tagliare sezioni di tessuto a uno spessore di 6 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetrini.
    2. Metodo di galleggiamento: Far galleggiare le sezioni su un bagno di flottazione in tessuto a 40 °C per levigare le rughe.
    3. Raccolta dei tessuti: Montare le sezioni su vetrini rivestiti di adesivo (2-3 per vetrino) e asciugare su uno scaldavetrini a 80 °C.
    4. Essiccazione dei vetrini: trasferire i vetrini con le sezioni montate in un forno a 60 °C per una notte dopo il sezionamento.
  2. Protocollo di deparaffinazione e reidratazione
    1. Posizionare i vetrini in un rack per vetrini e immergerli in sequenza come segue: xilene I, 7 min; xilene II, 7 min; etanolo anidro, 5 min; 90% etanolo, 5 min; 85% etanolo, 5 min; etanolo al 75%, 5 min; acqua distillata, 5 min; PBS, 5 minuti (tre volte).
      NOTA: Eseguire i passaggi di xilene in una cappa aspirante con guanti e occhiali. Smaltire i rifiuti di xilene seguendo lo stesso protocollo specificato per la paraformaldeide al punto 2.3.4.
  3. Protocollo di recupero dell'antigene
    1. Preparazione della soluzione di citrato di sodio: Preparare il tampone citrato di sodio (pH 6,0). Abbiamo usato una soluzione tampone di citrato di sodio auto-preparata sciogliendo una bustina di polvere in 1 litro d'acqua.
    2. Microonde in sequenza: Posizionare i vetrini in un barattolo di vetro riempito con una soluzione tampone di citrato di sodio per coprire i vetrini, quindi posizionare il barattolo nel microonde. I campioni sono stati sottoposti a trattamento a microonde secondo la seguente sequenza: calore medio (600 W) per 8 minuti, seguito da riposo senza riscaldamento per 8 minuti e infine fuoco basso (300 W) per 7 minuti.
    3. Raffreddare naturalmente a temperatura ambiente: Lasciare raffreddare il contenitore naturalmente a temperatura ambiente.
    4. PBS: Sciacquare i vetrini in PBS per 5 minuti per due volte.
  4. Incubazione in forno
    1. H2O2: Applicare il 3% di H2O2 sulle sezioni di tessuto per 10 minuti per bloccare l'attività endogena della perossidasi. Applicare circa 50 - 80 μl di H2O2 su ciascun vetrino.
    2. PBS: Lavare le diapositive in PBS per 5 minuti tre volte.
    3. Complesso Strept-Avidin-Biotina-Perossidasi (SABC): Applicare SABC goccia a goccia sul tessuto e colorare per 30 minuti in un'incubatrice a 37 °C. Applicare circa 50 - 80 μl di SABC su ciascun vetrino.
    4. PBS: Lavare le diapositive in PBS per 5 minuti tre volte.
  5. Resa cromatica
    1. 3,3'-diaminobenzidina (DAB): applicare la soluzione cromogenica DAB sulle sezioni di tessuto e monitorare fino a quando non si sviluppa una colorazione giallo-brunastra. Colorare le sezioni per circa 1-5 minuti. Regolare la durata della colorazione in base alla specificità del tessuto e alla temperatura ambiente. Per il tessuto pancreatico, si raccomanda un tempo di colorazione di 2 minuti a 22 °C.
    2. Risciacquo: Sciacquare immediatamente i vetrini sotto un leggero getto di acqua distillata per fermare la reazione.
    3. Immergere: immergere i vetrini in acqua distillata per 5 minuti per rimuovere i reagenti residui.
  6. Colorazione con ematossilina
    1. Ematossilina: Immergere i vetrini nell'ematossilina per 1 minuto. La soluzione di ematossilina viene preparata utilizzando acqua pura in un rapporto di 56 mg/mL.
    2. Risciacquo: Sciacquare due volte i vetrini in acqua distillata (5 s per risciacquo).
    3. Differenziazione acido cloridrico-alcol: Differenziare i vetrini nella soluzione di differenziazione acido cloridrico-alcol per 1 s.
    4. Immergere: immergere i vetrini in acqua di rubinetto per 10 minuti per sviluppare una colorazione nucleare blu stabile.
  7. Disidratazione: disidratare i vetrini in sequenza attraverso le seguenti soluzioni: etanolo al 70%, etanolo all'80%, etanolo al 90%, etanolo anidro, xilene I e xilene II, per 3 minuti in ciascuna soluzione, rispettivamente.
    NOTA: Eseguire i passaggi di xilene in una cappa aspirante con guanti e occhiali.
  8. Sigillatura
    1. Montare le sezioni con balsamo neutro: applicare il balsamo neutro sul vetrino utilizzando un contagocce a bulbo di gomma. Coprire con un vetrino coprioggetti. Evitare di comprimere con forza il bulbo per evitare la formazione di bolle. Applicare circa 50 μl di balsamo neutro su ogni vetrino.
    2. Asciugatura all'aria: Posizionare i vetrini in una cappa aspirante durante la notte per consentire alla resina neutra di asciugarsi completamente.

4. Analisi del Western blotting (WB)

  1. Decomposizione dei tessuti
    1. Assumere 200 mg di tessuto pancreatico di ratto, metterlo in una provetta da 2 mL contenente 1 mL di tampone di lisi e 3 piccole sfere d'acciaio. Il tampone di lisi è composto da un cocktail completo di inibitori della proteasi e da un tampone di lisi RIPA. Il rapporto di miscelazione è di 1 compressa di inibitore della proteasi: 50 ml di tampone di lisi RIPA.
    2. La macinazione è stata eseguita utilizzando un mulino a sfere con i seguenti parametri: frequenza: 30/s; tempo: 30 s; 10-15 volte. Fino a quando non sono visibili particelle bianche ad occhio nudo.
    3. Trasferire il surnatante proteico superiore in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL, senza assumere schiuma. Centrifugare con 16900 x g 30min, 4 °C.
      NOTA: Gli omogeneizzati per l'analisi del Western blotting sono stati preparati dall'intero pancreas.
  2. Quantificazione delle proteine: Quantificare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA secondo le istruzioni del produttore. Il rapporto di miscelazione per la soluzione di lavoro BCA è la soluzione A: soluzione B = 50:1.
  3. Elettroforesi delle proteine:
    1. Aggiungere i campioni di proteine pancreatiche preparati (un volume di 6 μl è stato caricato in ciascuna corsia) al gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide-Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, per l'elettroforesi.
    2. Funzionamento a 70 V per 0,5 ore, quindi funzionamento a 110 V per 1 ora utilizzando il sistema Tetra Mini-PROTEAN. Diluire il liquido tampone per elettroforesi MOPS 20× con acqua pura alla concentrazione di 1×.
  4. Trasferimento a membrana
    1. Diluire il concentrato di trasferimento eBlot L2 da 5× a 1× concentrazione di lavoro utilizzando acqua pura. Questo buffer di trasferimento da 1× può essere riutilizzato fino a 3 volte. Diluire il concentrato di equilibrio eBlot L2 da 5× a 1× concentrazione di lavoro utilizzando acqua pura.
    2. Tagliare una membrana in PVDF (Immobilon-P Transfer Membrane) della dimensione appropriata (ad esempio, 7,5 cm × 5,5 cm). La dimensione dei pori è di 0,45 um.
    3. Versare circa 30 ml di metanolo in una scatola di incubazione con 90 × 60 × 32 mm. Immergere la membrana PVDF nel metanolo per 5 s per attivarla.
    4. Versare circa 30 mL della soluzione 1x balance preparata in un'altra scatola di incubazione pulita. Rimuovere con cautela il gel dalle piastre per elettroforesi e inserirlo nella soluzione di bilanciamento.
    5. Trasferire la membrana in PVDF attivata dal metanolo e inserirla anche nella scatola di incubazione contenente la soluzione bilanciata. Assicurarsi che la membrana sia posizionata sotto il gel per un contatto corretto. Lascia che entrambi si equilibrino.
    6. Seguendo le istruzioni del produttore dell'apparecchio di tamponamento, posizionare il "sandwich" di trasferimento in questo ordine dall'alto verso il basso: spugna, gel, membrana PVDF, spugna. Assicurarsi che non rimangano intrappolate bolle d'aria tra gli strati. Posizionare correttamente la pila di trasferimento assemblata nella camera dell'apparecchio di blotting. Collegare l'alimentatore ed eseguire il trasferimento in modalità standard per 15 minuti.
  5. Blocco
    1. Preparare due scatole di incubazione, una contenente circa 15 mL di TBST (soluzione salina tamponata con Tris-Tween20) e l'altra con circa 15 mL di soluzione bloccante BSA al 5%.
    2. Preparazione della soluzione TBST: Sciogliere una busta di Tris Buffered Saline Powder in 2 L di acqua pura, quindi aggiungere 2 mL di Tween 20.
    3. Posizionare la membrana PVDF nella soluzione TBST, assicurandosi che il lato a contatto con il gel sia rivolto verso l'alto.
    4. Lavare la membrana in PVDF su uno shaker a 40 giri/min a temperatura ambiente per 3-5 minuti.
    5. Trasferire la membrana in PVDF nel tampone di bloccaggio. Bloccarlo su uno shaker a 20 giri/min, a temperatura ambiente per 1 h.
  6. Incubazione degli anticorpi primari
    1. Lavare la membrana in PVDF in una scatola di incubazione contenente TBST, lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna su un agitatore a 40 giri/min a temperatura ambiente.
    2. Incubare con l'anticorpo primario per una notte (14-18 ore) a 4 °C (1:40000, anticorpo policlonale vinculina) in un'altra scatola di incubazione degli anticorpi su un agitatore a 20 giri/min.
    3. Assicurarsi che l'anticorpo sia diluito con una soluzione bloccante BSA al 5%, preparata secondo il rapporto specificato nella sezione.
  7. Incubazione secondaria degli anticorpi
    1. Mettere la membrana in PVDF in una scatola di incubazione contenente 15 mL di soluzione TBST. Lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuna su uno shaker a temperatura ambiente, agitando a 40 giri/min.
    2. Preparare l'anticorpo secondario diluendo l'anticorpo anti-coniglio IgG, legato a HRP a 1:2000 in tampone bloccante BSA al 5%.
    3. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore a 20 giri/min23.
    4. Lavare la membrana in PVDF tre volte con la soluzione TBST per 5 minuti ciascuna, seguendo il metodo sopra descritto.
  8. Scoperta
    1. Preparare la soluzione del substrato di lavoro miscelando AccuWest ECL Plus, Raegent A e AccuWest ECL Plus, Raegent B con un rapporto di volume 1:1 direttamente in una scatola di incubazione. Eseguire tutti i passaggi successivi al riparo dalla luce.
    2. Incubare la membrana in PVDF nella soluzione per 5-10 s, quindi rilevare immediatamente le bande immunoreattive utilizzando i reagenti a chemiluminescenza potenziata (ECL) - Vilber Fusion FX6 MINI. Il tempo di esposizione tipico varia da 5 a 10 s.

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Risultati

Descriviamo un protocollo riproducibile per stabilire un semplice modello di obesità che mostri in modo affidabile il pancreas grasso (Figura 1). L'intero processo, dall'alimentazione animale e dalla raccolta dei tessuti alla successiva validazione molecolare, è schematicamente riassunto nella Figura 1. Sono state registrate le variazioni di peso settimanali del gruppo modello (n = 5) e del gruppo di controllo (n = 5) e non vi è...

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Discussione

Come fattore primario della sindrome metabolica, l'obesità non complicata rappresenta la manifestazione iniziale della disregolazione sistemica del metabolismo lipidico. Senza intervento, può progredire verso il diabete di tipo 2 e gravi complicanze diabetiche, sottolineando la necessità di una correzione metabolica precoce30. La steatosi pancreatica (pancreas grasso), un marcatore precoce della deposizione ectopica di lipidi nell'obesità, ridefinisce il pancreas ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto degli Eredi e degli Istruttori per l'Eredità dell'Esperienza Accademica del Settimo Gruppo di Esperti di Medicina Tradizionale Cinese di Fama Nazionale; La Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina, Progetto del Fondo per i Giovani Scienziati [numero di sovvenzione 82305376]; Progetto di sostegno ai giovani talenti della scienza e della tecnologia nella provincia di Jiangsu nel 2024 [numero di sovvenzione JSTJ-2024-380].

I diagrammi di flusso sono stati prodotti utilizzando FigDraw, Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale
Tubo microcentrifuga da 1,5 mLBiosharp Bioengineering Co. Ltd.BS-15-MWB
Tubo di congelamento da 2 mlLABSELECTCV-002-200-EXWB
Tubo di macinazione da 2 mlWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3% di H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4% di paraformaldeideBiosharp Bioengineering Co. Ltd.BL539AOperazione di dissezione del pancreas per perfusione
Soluzione BSA al 5%Biofroxx4240GR100IHC
Tubo centrifuga da 50 mL  Biosharp Bioengineering Co. Ltd.BS-500-MConservazione dei tessuti
AccuWest ECL Plus, Raegent ANanchino Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNanchino Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
etanolo anidroShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Anti-coniglio IgG, anticorpo legato alla HRPTecnologia di Segnalazione Cellulare.Inc,7074WB
Cocktail di inibitori della proteasi cOmpleteHoffmann-La Roche Ltd 82256300WB
coperturaCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
Soluzione cromogenica DABBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
PinzeShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-Mdissezione del ratto SD
vetri & nbsp;CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
barattolo di vetro per le tinteShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
EmatossilinaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Dieta ricca di grassiSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabella1alimentazione su animali sperimentali
Acido cloridrico alcolShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
isofluranoShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Ratti anestetizzati
metanolo Biofroxx67-56-1WB
MOPS Liquido tampone in corso 20 volte e pochi;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
Balsamo neutroBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Resina neutraShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
Soluzione PBSJiangsu Keygen Biotech Corp., LtdKGL2206-500Conservazione dei tessuti
Kit per il saggio proteico Pierce BCA & nbsp;Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.ZB382867
Kit per il saggio proteico Pierce BCA & nbsp;hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USAZB382867WB
Cocktail di inibitori della proteasiHoffmann-La Roche Ltd 82256300
Membrana PVDF (Membrana di trasferimento Immobilon-P, Millipore, 0000380346) Merck Millipore0000380346WB
Buffer di lisi RIPABiosharp Bioengineering Co. Ltd.BL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
SalinaSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. 270071460Conservazione dei tessuti
Maschi di ratti SDJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. D000017ratti
Citrato di sodioMerck Life ScienceS1804IHC
Alimentazione per manutenzione standardSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabella2alimentazione su animali sperimentali
il concentrato di equilibrio eBlot L2 5 volte;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
il trasferimento concentra eBlot L2 5 volte;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
Tris Soluzione Salina Tamponata, Polvere & nbsp;Biosharp Bioengineering Co. Ltd.BL602AWB
Preadolescenti 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UretanoSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GRatti anestetizzati
Anticorpo policlonale di vinculinaProteintech Group, Inc,26520-1-APWB
xileneNanchino Reagent CorporationC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10 e volte; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
Equipaggiamento
Macchina per anestesiaShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Modello R5805Ratti anestetizzati
mulino a sfera Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
CentrifugheEppendorf SE5418RWB
Asciugatore di tessuti biologici computerizzatiZhejiang Jinhua Kedi Instrument Co.SC2013-G-KITIHC
reagenti a chemiluminescenza avanzata (ECL)  BIOIMAGING DI VILBER00170961WB
microtomo Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, USA.HM325IHC
MicroondeShanghai Boxun Industry Co., Ltd. 97000IHC
Sistema Mini-PROTEAN TetraBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
FornoShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
Acqua puraSichuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

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