Una formula di clistere erboristico che combina Sanguisorba officinalis, Bletilla striata e Acacia catechu è stata valutata utilizzando profilazione LC-MS/MS, docking S100β, un modello di colite DSS e glia enterica attivata da LPS/IFN-γ. La formula ha attivato S100β, soppresso l'attivazione gliale e ridotto l'espressione di p-NF-κB/iNOS, indicando un miglioramento tramite l'asse S100β-RAGE-NF-κB.
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Articolo di ricerca
Una formula per clistere erboristico allevia la colite ulcerosa inibendo l'attivazione gliale enterica tramite la via S100β/RAGE/NF-κB
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'attivazione delle cellule gliali enteiche (EGC) contribuisce alla patogenesi della colite ulcerosa (UC). Questo studio ha esaminato se Dibai Enema Liquid (DBE) - un clistere erbatico che combina Sanguisorba officinalis, Bletilla striata e Acacia catechu - moduli l'infiammazione guidata da EGC. I profili LC-MS/MS dei componenti DBE e dei composti prioritizzati sono stati abbinati a S100β. L'efficacia è stata valutata nella colite murina indotta da dextrano solfato di sodio (DSS) utilizzando peso corporeo, lunghezza del colon, istopatologia e livelli di citochine (ELISA). I marcatori di attivazione gliale sono stati misurati tramite immunoistochimica, colocalizzazione da immunofluorescenza, PCR quantitativa (qPCR) e immunoblotting. Un modello in vitro ha utilizzato CRL-2690 cerebrale enterica gliale attivata con lipopolisaccaride più interferone-γ, con il siero di ratto contenente DBE (15%) come intervento. L'attracco suggeriva un forte legame previsto di diversi componenti DBE a S100β. DSS ha aumentato TNF-α e IL-1β, disturbato giunzioni strette e elevato S100β/GFAP sia a livello di mRNA che di proteina, compatibile con iperattivazione gliale; Il DBE ha invertito significativamente questi cambiamenti. In vitro, DBE ha ridotto S100β, RAGE, iNOS (NOS2) e fosforilato NF-κB p65. Collettivamente, la DBE sembra alleviare la colite ulcerata inibindo l'attivazione dell'EGC e regolando alla ribasso l'asse S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, preservando così l'integrità mucosa.
Introduzione
La colite ulcerosa (UC) è un sottotipo importante di malattia infiammatoria intestinale (IBD) caratterizzata da infiammazione mucosa cronica del colon, con un carico globale crescente dal 1990, e la CU rappresenta una quota significativa dei casi incidenti diIBD 1,2. Le manifestazioni tipiche includono dolore addominale e diarrea sanguinolenta, che portano a notevoli disagi fisici e psicologici e a costi di trattamentosostanziosi 3. Sebbene le opzioni di trattamento si siano ampliate, l'esposizione a lungo termine a immunomodulatori e biologici che sopprimono l'immunità sistemica è associata a un aumento del rischio di linfoma e infezioni opportuniste, e una parte dei pazienti rimane refrattaria ointollerante 4. La cucc è ampiamente considerata una condizione immunomediata in cui la perturbazione dell'omeostasi immunitaria mucosa è centrale per lafisiopatologia 5. Tuttavia, le evidenze accumulate indicano che i meccanismi immunitari mucosali da soli non sono sufficienti a spiegare tutte le caratteristiche della MII; il sistema nervoso enterico (ENS) contribuisce all'infiammazione intestinale, estendendo il concetto di malattia alla neuroinfiammazione all'interno dellaIBD 6.
Le cellule gliali enteriche (EGC), che superano in numero i neuroni enteici nei mammiferi adulti, sono ora riconosciute come regolatori chiave dell'omeostasi intestinale edell'infiammazione 7,8. Gli EGC modulano la funzione della barriera epiteliale rilasciando mediatori come GDNF, TGF-β1, S100β e 15d-PGJ2, influenzando così la permeabilità e l'integrità mucosa9. Tra questi mediatori, S100β può attivare cascate a valle - inclusa la via RAGE/NF-κB - portando a danni alla barriera e amplificazioneinfiammatoria 10,11. Gli EGC modellano anche le risposte immunitarie regolando il fenotipo dei macrofagi e la sensibilità viscerale tramite connexin-43 e M-CSF, e esercitando effetti soppressivi sulle cellule T in vitro, evidenziando l'attivazione dell'EGC come bersaglio terapeutico trattabile nell'UC12,13.
La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata sempre più studiata nell'UC e ha mostrato promettenti benefici in contesti clinici esperimentali 14,15. L'accoppiamento classico di Sanguisorba officinalis (Diyu) e Bletilla striata (Baiji), insieme ad Acacia catechu (Ercha), è da tempo documentato per i disturbi disenterici nelle fonti di materia medica ed è elencato nella Farmacopea cinese per indicazioni emostatiche, analgesiche e di guarigione delle ferite. Studi contemporanei riportano attività antibatteriche, antinfiammatorie, antiossidative e anti-ulceranti per queste botaniche, mentre A. catechu dimostra anche proprietà neuroprotettive con la catechina come costituenteprominente 16,17. Rispetto all'immunosoppressione sistemica convenzionale, una formulazione che coinvolga vie neuroimmunitarie centrate sull'EGC potrebbe offrire un'efficacia complementare con un meccanismo distinto e potenzialmente rischi sistemici correlatial sistema 18,19.
Questo studio valuta se la preparazione combinata di Diyu, Baiji ed Ercha (DBE) mitighi la UC sopprimendo l'attivazione dell'EGC. Si utilizza un approccio integrato: profilazione LC-MS/MS non mirata per dare priorità ai costituenti, docking molecolare con S100β, validazione in un modello di colite indotta da solfato di sodio da destrano e sage meccanicistici negli EGC. Il lavoro enfatizza un meccanismo neuroimmunitario - S100β/RAGE/NF-κB/iNOS - esplorato nelle precedenti terapie per la colite ulcerosa, e delinea implicazioni pratiche per la selezione della dose, l'ottimizzazione della formulazione e i successivi studi traslazionali.
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Protocollo
Tutte le procedure animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino [BUCM-2023-0912] e sono state condotte in conformità con le linee guida istituzionali e nazionali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Non sono stati coinvolti soggetti umani.
I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Reagenti e materiali
Sono stati utilizzati solventi di grado analitico e reagenti di grado biologico molecolare. Tutte le informazioni commerciali, inclusi i produttori, i numeri di catalogo e i dettagli delle licenze software, sono fornite nella Tabella dei Materiali (xlsx). L'acqua per tutte le preparazioni veniva deionizzata e filtrata. Tutti i tamponi venivano preparati freschi o conservati secondo le condizioni specificate di seguito.
2. Configurazione di attrezzature e software
Un sistema UPLC-MS/MS accoppiato a uno spettrometro di massa quadrupolo a tempo di volo; una centrifuga refrigerata con rotore a secchio oscillante; un incubatore di CO₂ mantenuto a 37 °C, 5% CO₂ e umidità relativa ≥95%; un lettore a micropiastre (450 nm); un termociclatore PCR in tempo reale; elettroforesi e apparati di assorbimento; e un microscopio a fluorescenza con filtri fissi di eccitazione/emissione. Il controllo degli strumenti e l'analisi dei dati venivano eseguiti in MassLynx v4.2 per i dati cromatografici e spettrometrici di massa e in AutoDock 4.2 con AutoDockTools 1.5.7 per l'aggancio. L'analisi delle immagini è stata effettuata in ImageJ/Fiji v1.53.
3. Preparazione del Liquido Dibai Enema (DBE)
La miscela di erbe composta da Diyu (50 g), Baiji (50 g) ed Ercha (20 g) è stata schiacciata grossolanamente e immersa in 1.200 mL di acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti per garantire una completa idratazione. La miscela ammollata è stata decoctata a bollitura vigorosa per 30 minuti con qualche mescolata occasionale per evitare l'adesione. La decoction calda veniva filtrata attraverso una garza medica sterile a più strati in oggetti di vetro sterili per rimuovere materiale insolubile. Il filtrato veniva concentrato nel vuoto in un bagno d'acqua non superiore a 45 °C fino a quando non si otteneva un concentrato corrispondente a una concentrazione finale di 1,98 g/mL (stock ad alta dose). Soluzioni di lavoro a dosaggio medio e basso a 0,99 g/mL e 0,50 g/mL sono state preparate per diluizione con acqua deionizzata sterile fino a volumi finali di 100 mL ciascuna. Ogni soluzione veniva fatta passare attraverso una membrana da 0,22 μm in condizioni sterili, dispensata in contenitori sterili etichettati e conservata a 4 °C per un massimo di sette giorni. Prima dell'uso, le soluzioni venivano delicatamente miscelate; un aspetto accettabile era chiaro o leggermente opalescente senza particelle visibili.
4. UPLC - Analisi MS/MS del DBE
La polvere di ciascun componente medicinale è stata pesata con precisione a 50 mg ed estratta con 1,0 mL di metanolo all'80% (v/v) per agitazione ultrasonica per 30 minuti a temperatura ambiente. Gli estratti venivano riportati alla temperatura ambiente dopo la sonicazione, centrifugati a 15.000 × g per 10 minuti a 4 °C, e i soprannatanti venivano filtrati attraverso membrane da 0,22 μm in fiale autocampionatori. La separazione cromatografica fu effettuata su una colonna a fase inversa (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; tipo C18 con capo polare) mantenuta a 35 °C; colonna marchia/modello e numero di catalogo sono forniti nella Tabella dei Materiali. Fase mobile A: 0,1% di acido formico in acqua; fase mobile B: acetonitrile. Portata: 0,30 mL/min; volume di iniezione: 10 μL. Gradiente: 5% B per 0-2 minuti; 5→95% B da 2 a 20 minuti; 95% B per 20-23 minuti; 95→5% B da 23,0 a 23,1 min; riequilibrarsi al 5% B fino a 26 minuti (la tabella del gradiente completo è fornita nella Tabella 1).
La spettrometria di massa utilizzava ionizzazione elettrospray con commutazione positiva/negativa e acquisizione indipendente dai dati con scansioni a bassa e alta energia (MSE). Intervallo di massa: m/z 100-1.500; Tensione capillare: 2,0 kV; cono di campionamento: 20 V; temperatura di sorgente: 120 °C; temperatura di desolvazione: 360 °C; gas a cono: 50 L/h; gas di desolvazione: 600 L/h. La funzione ad alta energia impiegava un'energia di collisione a gradini di 20-50 eV. I dati venivano elaborati in MassLynx v4.2 con correzione di massa di blocco e parametri standard di rilevamento dei picchi. Un elenco completo di 105 componenti identificati (formule molecolari, m/z osservati, tempi di ritenzione e punteggi di confidenza) è fornito nella Tabella Supplementare 1.
5. Attracco molecolare
L'attracco è stato effettuato in AutoDock 4.2 secondo un protocollo di adattamento indotto. La struttura tridimensionale di S100β (PDB 3HCM) è stata preparata rimuovendo molecole d'acqua cristallografiche, aggiungendo idrogeni polari e assegnando cariche di Kollman. Sono state costruite strutture di liganti che rappresentano costituenti caratteristici della DBE, protone al pH fisiologico e minimizzate con energia. Il sito di legame era definito dalle coordinate del ligando nativo; i residui di amminoacidi entro 6 Å dal ligando nativo sono stati trattati come flessibili durante l'attracco. Le scatole a griglia coprivano l'intera tasca con una distanza di 0,375 Å. I parametri dell'algoritmo genetico lamarckiano erano: dimensione della popolazione 150; fino a 2,5 × 10⁶ valutazioni energetiche; 100 corse indipendenti per ligando. Le pose finali sono state classificate in base all'energia libera di legame prevista e raggruppate tramite RMSD; Sono stati visualizzati modelli di interazione (legami idrofobi, contatti idrofobici, interazioni π-π) per la coerenza con i complessi S100β noti.
6. Modello animale di colite indotta da DSS e trattamento DBE
I maschi di topi C57BL/6J (8 settimane, 20-22 g) sono stati acclimatati per almeno 7 giorni a 22 ± 2 °C, 50%-60% di umidità relativa, ciclo chiaro-buio di 12 ore, con cibo e acqua ad libitum. Gli animali sono stati assegnati casualmente in sei gruppi (n = 10/gruppo): controllo, modello di dextrano solfato di sodio (DSS), controllo positivo per sulfasalazina (SASP) e trattamenti DBE a dosi basse, medie e alte. Il personale responsabile della valutazione istologica e della quantificazione delle immagini è stato accecato all'allocazione dei gruppi.
La colite sperimentale è stata indotta con DSS al 2,0% (w/v) nell'acqua potabile per 7 giorni, seguita da DSS all'1,0% per 3 giorni, poi acqua normale per 4 giorni prima dell'eutanasia. La DBE veniva somministrata una volta al giorno tramite clistere a 10 mL/kg utilizzando un catetere flessibile inserito per 2,5 cm nel retto; Gli animali sono stati tenuti in posizione verticale per 30 minuti per minimizzare le perdite. Le dosi giornaliere di DBE erano rispettivamente 12,35, 27,4 e 49,4 g/kg/giorno per i gruppi basso, medio e alto; Il SASP è stato somministrato a 0,5 g/kg/giorno come controllo positivo. Peso corporeo, consistenza delle feci e sangue occulto fecale venivano registrati quotidianamente per calcolare l'indice di attività della malattia. Al punto finale, i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodio 50 mg/kg i.p.; il sangue veniva raccolto dal seno retro-orbitale utilizzando capillari eparinizzati; Gli animali venivano soppressi per lussazione cervicale. Il colon fu espulso dalla giunzione ileocecale al retto, esteso delicatamente e la lunghezza misurata con una tensione minima. I segmenti rappresentativi erano fissati con il 4% di paraformaldeide; il tessuto residuo veniva congelato di scatto in azoto liquido e conservato a −80 °C.
7. Preparazione di siero contenente farmaci
I maschi di ratti Sprague-Dawley sono stati randomizzati nei gruppi di controllo e DBE (n = 6/gruppo). Il gruppo DBE riceveva 12,34 g/kg/giorno tramite gavage orale una volta al giorno per 7 giorni; i controlli ricevevano acqua purificata a volume uguale. Ventiquattro ore dopo l'ultima dose, gli animali sono stati anestetizzati e il sangue totale è stato prelevato dall'aorta addominale. Il siero veniva separato dopo coagulazione per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da centrifugazione a 1.500 × g per 10 minuti a 4 °C. I sieri venivano inattivati al calore a 56 °C per 30 minuti e filtrati attraverso membrane da 0,22 μm in condizioni sterili prima della conservazione. Il siero veniva allicitamente inserito in tubi sterili e conservato a −80 °C. I campioni emolizzati, identificati da un'assorbenza elevata intorno a 414 nm, sono stati esclusi.
8. Esame istologico (H&E)
Il tessuto del colon fissato al 4% di paraformaldeide per 24 ore è stato disidratato tramite etanoli gradati, eliminato nello xilene e incorporato nella paraffina. Le sezioni (5 μm) sono state tagliate, deparafinizzate, reidratate e colorate con ematossilina per 5 minuti, bluate in acqua corrente per 5 minuti e controcolorate con eosina per 2 minuti. I vetrini venivano montati con resina e esaminati per l'architettura delle cripte, la densità delle cellule del calice, la continuità epiteliale e l'infiltrazione infiammatoria. Le modifiche rappresentative saranno indicate con frecce/punte di freccia e definite nelle legende delle figure; Le barre di scala (ad esempio, 200 μm) e le soglie visive predefinite saranno specificate nelle legende.
9. Immunoistochimica (IHC)
Le sezioni di paraffina sono state sottoposte al prelievo antigenico in tampone di citrato (pH 6,0) per 15-20 minuti a 95-98 °C, temprare la perossidasi endogena con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti e bloccare con siero normale al 5% per 1 ora a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari venivano incubati durante la notte a 4 °C in una camera umidificata. Dopo il lavaggio, le sezioni sono state processate utilizzando un sistema di rilevamento di streptavidina-perossidasi, sviluppato con DAB per 2 minuti (monitoraggio microscopico), controcolorato con ematossilina, disidratato e montato. Sono stati inclusi controlli negativi privi dell'anticorpo primario in ogni lotto.
10. Analisi dell'immunofluorescenza (IF)
Le sezioni immerse in paraffina sono state deparaffinizzate e sottoposte al recupero di antigeni in un tampone EDTA (pH 8,0). Dopo il raffreddamento, il legame aspecifico è stato bloccato con albumina sieroica bovina al 3% per 1 ora a temperatura ambiente. Le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro GFAP (1:500) e S100β (1:200), seguite da anticorpi secondari coniugati con fluorofori (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. I nuclei venivano contrastati con DAPI e le vedute montate su un mezzo anti-fade. Le immagini sono state catturate utilizzando obiettivi identici, un tempo di esposizione fisso di 100 ms e un guadagno del rivelatore di 1,0 tra i gruppi. L'intensità media di fluorescenza è stata quantificata in ImageJ/Fiji v1.53 dopo la calibrazione della dimensione dei pixel, la sottrazione dello sfondo (raggio della palla rotolante 50 pixel) e la normalizzazione all'area DAPI-positiva. Sono stati analizzati almeno cinque repliche biologiche per gruppo e tre campi non sovrapposti per replica.
11. Coltura cellulare e trattamenti
Le cellule gliali enteriche di ratto (designazione CRL-2690) sono state coltivate in DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. L'identità cellulare è stata confermata da brevi ripetizioni tandem e le colture sono state prive di micoplasma. Sono stati effettuati esperimenti nei passaggi 5-15. Le cellule sono state seminate in piastre a 6 pozzi a 2,0 × 10⁵ cellule/pozzo in un mezzo di 2,0 mL/pozzo e lasciate ad attaccarsi per 24 ore. I gruppi sperimentali erano: controllo non trattato, controllo veicolo, modello, siero DBE e inibitore.
Per l'induzione del modello, le cellule sono state esposte a lipopolisaccaridi (LPS, 1 μg/mL) più IFN-γ (20 ng/mL) per 24 ore in mezzo intero; il corrispondente valore U/mL per IFN-γ è riportato nella Tabella dei Materiali secondo la potenza specifica del lotto. Per il trattamento con siero DBE, le cellule hanno ricevuto siero di ratto inattivo termicamente al 15% (v/v), 0,22 μm filtrato con DBE in mezzo completo per 24 ore (intervallo di dosaggio 5%-20% utilizzato nell'ottimizzazione della vitalità come specificato nella sezione CCK-8). Per il trattamento con inibitore, è stato applicato per 24 ore l'inibitore selettivo S100β SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM per le letture chiave). I controlli del veicolo hanno abbinato il contenuto di solventi (0,1% DMSO (v/v)) con un mezzo altrimenti identico. Salvo diversa indicazione, i trattamenti sono stati preparati in mezzo preriscaldato (37 °C) e le cellule sono state risciacquate 2× con PBS prima della sostituzione del trattamento. Dopo il trattamento, le cellule venivano raccolte per l'estrazione di RNA, l'analisi delle proteine e l'immunofluorescenza come dettagliato nelle sezioni successive. La replicazione biologica era di n ≥ 5 colture indipendenti per condizione.
12. Saggio di vitalità delle celle CCK-8
Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzi a 5 × 10³ cellule/pozzo in un mezzo da 100 μL e lasciate aderire durante la notte. Il mezzo è stato sostituito con siero trattato con DBE contenente mezzo al 5%, 10%, 15% o 20% (v/v) per 24 ore. È stato aggiunto il reagente CCK-8 (10 μL/pozzo) e le piastre sono state incubate per 1 ora a 37 °C. L'assorbanza è stata rilevata a 450 nm con sottrazione a vuoto (mezzo + reagente, nessuna cellula). La fattibilità è stata espressa come percentuale del controllo del veicolo. Ogni condizione utilizzava n ≥ 5 repliche biologiche (colture indipendenti) con tre repliche tecniche per ogni coltura.
13. ELISA per citochine tissutali
Il tessuto del colon è stato omogeneizzato su ghiaccio in PBS (1:9, p/v) contenenti inibitori della proteasi. Gli omogeneati sono stati chiariti di 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C; i supernatanti sono stati analizzati per IL-1β e TNF-α secondo i protocolli del kit. Standard e campioni venivano eseguiti in duplicato, e le curve erano equipaggiate con un modello logistico a quattro parametri (4PL) con R² ≥ 0,99; standard retrocalcolati sono stati accettati entro l'85%-115% del valore nominale. L'assorbanza veniva rilevata a 450 nm con un riferimento di 620-650 nm quando disponibile. Le concentrazioni di citochine sono state normalizzate al peso del tessuto (tessuto pg/mg). Ogni gruppo includeva n ≥ 5 repliche biologiche.
14. PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)
L'RNA totale proveniente dal tessuto del colon (o dalle cellule, a seconda dei casi) veniva isolato con un kit spin-column a membrana di silice. L'integrità dell'RNA è stata verificata tramite l'ispezione A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1 e l'ispezione del gel di agarosio. Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato da 1 μg di RNA con rimozione genomica del DNA. qPCR utilizzava il master mix SYBR Green su un termociclatore calibrato con il programma: 95 °C 30 s; 40 cicli a 95 °C 5 s, 60 °C 30 s; curva di fusione 65-95 °C in passi di 0,5 °C/5 s. Il GAPDH fungeva da controllo endogeno. L'espressione relativa è stata calcolata da 2⁻ΔΔCt dopo aver verificato le efficienze dei primer (90%-110%, da pendenze a curva standard). Erano inclusi i controlli senza RT e senza template. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella 2. Ogni gruppo aveva n ≥ 5 repliche biologiche e due ripetizioni tecniche per campione.
15. Analisi del western blot
Le proteine dal tessuto (o dalle cellule) del colon sono state estratte in tampone RIPA con inibitori di proteasi/fosfatasi e quantificate tramite analisi BCA. La proteina uguale (30 μg/corsia) è stata denaturata, risolta su SDS-PAGE a gradiente del 4-20% e trasferita in PVDF (0,45 μm; 0,2 μm per ≤ bersagli da 20 kDa). Le membrane sono state bloccate nel latte scremato al 5% per 2 ore a temperatura ambiente e incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), fosfo-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Occludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con HRP (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali furono sviluppati con ECL; I tempi di esposizione erano limitati alla gamma dinamica lineare (10-90 s). I trasferimenti sono stati verificati tramite colorazione reversibile della membrana prima del blocco. Le intensità delle bande sono state quantificate in ImageJ/Fiji v1.53 dopo sottrazione di fondo e normalizzate a GAPDH. Pesi molecolari attesi: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Ogni analisi includeva n ≥ 5 repliche biologiche.
16. Analisi statistica
I dati sono stati analizzati in GraphPad Prism 8.0 e sono presentati come media ± SEM. Per i confronti tra gruppi multipli è stato utilizzato ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey; per confronti a coppie, sono stati applicati i test t di Student a due code non accoppiati quando appropriato. Per i disegni a tempo o a due fattori (ad esempio, trattamento × dose o trattamento × tempo), veniva utilizzato ANOVA bidirezionale (misure ripetute quando applicabile) con correzione di Tukey o Dunnett come specificato nelle legende delle figure. I test di Shapiro-Wilk e Levene sono stati utilizzati per esaminare normalità e omoscedasticità prima dei test parametrici; quando le assunzioni venivano violate, i dati venivano trasformati log-transformati o analizzati con test non parametrici appropriati (Kruskal-Wallis con il post hoc di Dunn; Mann-Whitney U per coppie). I valori esatti p e le misure di dimensione dell'effetto (η² per ANOVA, d di Cohen per i t-test) sono riportati nelle legende delle figure dove applicabile. Un p < a due facce di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le legende delle figure utilizzano la seguente notazione per il significato: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Controllo; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS; NS, non significativi.
17. Risultati attesi e controllo qualità
Si prevede che il DSS accorci la lunghezza del colon, aumenti l'indice di attività della malattia e induca danni istologici (distorsione architettonica della cripta, esaurimento delle cellule calici, erosione epiteliale). Il trattamento DBE dovrebbe migliorare questi indici in modo dipendente dal dosaggio e ridurre i marcatori di attivazione entero-gliale. Le Western blot dovrebbero mostrare bande ai pesi molecolari sopra elencati, con segnali aumentati nel DSS e attenuazione con DBE o SBI-4211; Le esposizioni dovrebbero rimanere all'interno dell'intervallo dinamico lineare. L'immunofluorescenza per GFAP e S100β dovrebbe mostrare intensità medie elevate nel DSS e una riduzione dopo il trattamento DBE. I cromatogrammi LC-MS/MS dovrebbero mostrare tempi di ritenzione stabili (deriva ≤ 0,2 min) e accuratezze di massa entro ± 5 ppm per gli ioni di riferimento, con ioni frammenti caratteristici per i componenti chiave. I controlli negativi (ad esempio, omissione di anticorpi primari) non dovrebbero fornire alcun segnale specifico. I parametri di acquisizione dell'imaging (oggettivo, esposizione, guadagno, gamma) devono rimanere fissi tra i gruppi per consentire confronti quantitativi validi.
18. Note sulla risoluzione dei problemi
La torbidità o le particelle nelle soluzioni DBE indicano una filtrazione o precipitazione inadeguate; ripetere la filtrazione di 0,22 μm e confermare il pH 6,5-7,5. Una mortalità eccessiva o una grave perdita di peso durante l'esposizione al DSS suggeriscono una sovraindotta indotta sopra; ridurre la concentrazione di DSS, verificare il peso molecolare dei lotti e sostituire quotidianamente le soluzioni DSS. Una quantificazione immunofluorescenza incoerente riflette tipicamente l'esposizione variabile; Fissare tempi di esposizione e guadagno, e includere una slide di riferimento per la calibrazione batch. Bande occidentali deboli possono riflettere sottocarico o inefficienza nel trasferimento; Verifica la quantificazione delle proteine, seleziona la percentuale o gradiente del gel appropriato e conferma il trasferimento tramite colorazione reversibile della membrana. Un cattivo adattamento ELISA (R² < 0,99 o un calcolo retro standard al di fuori dell'85-115%) giustifica la ripetizione della curva standard e la rivalutazione dei campioni diluiti. Per le operazioni qPCR con un'efficienza di primer superiore al 90-110%, riottimizza la temperatura di ricottura o la concentrazione di primer prima dell'analisi.
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Risultati
Identificazione dei componenti DBE e del siero contenente farmaci
LC-MS/MS ha identificato 105 costituenti chimici unici nella DBE, con errore di massa < 10 ppm. L'identificazione è stata confermata tramite formula molecolare, pattern isotopico e abbinamento di frammenti. Le principali classi includevano triterpeni, flavonoidi, bifenantrini e acidi organici. Il siero contenente farmaci ha mostrato 59 componen...
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Discussione
La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria intestinale cronica con patogenesi multifattoriale. Oltre alle risposte immunitarie disregolate, la disfunzione della barriera epiteliale intestinale e la disbiosi del microbiota intestinale sono contributori ben riconosciuti, mentre le anomalie del sistema nervoso enterico (ENS) sono sempre più identificate come fattore chiave nella progressione dellaCU 23. In particolare, sia la disregolazione strutturale che ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal Progetto di Costruzione delle Discipline Mediche Chiave di Alto Livello dell'Amministrazione Nazionale della Medicina Tradizionale Cinese (ZYYSZX-2023256).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2 | Software di docking molecolare | - | L'Istituto di Ricerca Scripps |
| Dextrano Solfato di Sodio (DSS) | Sostanza chimica per l'induzione della colite nei topi | 9011-18-1 | Sigma-Aldrich |
| Dibai Clisma Liquido (DBE) | Miscela erboristica per il trattamento della colite ulcerosa | - | Università di Medicina Cinese di Pechino |
| DMEM (Eagle Medium Modificato di Dulbecco) | Mezzo di coltura cellulare | 11965-092 | Thermo Fisher |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Supplemento per la coltura cellulare | 16000-044 | Thermo Fisher |
| Microscopio a fluorescenza | Strumento per l'imaging a immunofluorescenza | - | Olympus |
| Sistema LC-MS/MS | Spettrometro di massa per l'analisi LC-MS | - | Waters Corporation |
| Lipopolisaccaride (LPS) | Induttore di infiammazione in coltura cellulare | L2630 | Sigma-Aldrich |
| Ciclatore termico PCR | Apparecchiature per qPCR | T100 | Bio-Rad |
| Anticorpo primario (S100) | Anticorpo per la rilevazione della proteina S100 | ABC1234 | Abcam |
| Kit per il Saggio Proteico (BCA) | Kit di quantificazione delle proteine | 23225 | Thermo Fisher |
| Interferone ricombinante (IFN) | Citochine per l'attivazione dell'EGC in coltura cellulare | - | Sigma-Aldrich |
| Anticorpi secondari (coniugati con HRP) | Anticorpo secondario per l'immunoistochimica | XYZ5678 | Thermo Fisher |
| Solfazazazina (SASP) | Controllo positivo per la colite ulcerosa | - | Sigma-Aldrich |
| Equipaggiamento Western blot | Sistema di elettroforesi per l'analisi proteica | - | Bio-Rad |
Riferimenti
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