Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Summary

Qui presentiamo un protocollo per automatizzare l'analisi post-traduzionale delle modifiche degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di marcatura isotopica a due plex e la digestione ArgC. Questo flusso di lavoro consente un profiling quantitativo, riproducibile e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina e delle risposte epigenetiche a risoluzione di singola cellula.

Abstract

Le modifiche post-traduzionali delle istone (hPTM) sono regolatori centrali dell'organizzazione della cromatina e dell'espressione genica. La loro disregolazione è implicata nello sviluppo, nel cancro e nell'invecchiamento. Sebbene la spettrometria di massa sia il metodo preferito per studiare gli hPTM, la maggior parte dei protocolli è progettata per campioni di massa e non può risolvere la variabilità cellula a cellula. Estendere l'analisi PTM degli istoni al livello di singola cellula è quindi essenziale ma tecnicamente impegnativo, poiché gli istoni sono in bassa abbondanza, ricchi di lisina e fortemente modificati.

Qui descriviamo un flusso di lavoro proteomico automatizzato a singola cellula per l'analisi PTM degli istoni utilizzando la gestione di nano liquidi. Il sistema consente l'elaborazione su scala nanolitrica di singole cellule con una gestione minima e un'elevata riproducibilità. Il flusso di lavoro include la digestione con ArgC Ultra proteasi, che taglia i residui di arginina ed evita la necessità di passaggi di derivatizzazione che bloccano la lisina tipicamente necessari nella proteomica degli istoni. Per consentire un confronto quantitativo tra le condizioni, applichiamo una strategia di marcatura a due plex con anidride propionica e il suo analogo deuterato, l'anidride propionica-d10. Questa combinazione di preparazione automatica del campione, multiplexazione isotopica e digestione ArgC Ultra porta a un protocollo semplificato e sensibile per l'analisi PTM degli istoni a singola cellula.

Il metodo consente di studiare l'eterogeneità della cromatina e gli effetti delle perturbazioni epigenetiche a risoluzione monocellulare. Per dimostrare il flusso di lavoro, abbiamo generato sferoidi dalle cellule epatocellulari del carcinoma HepG2/C3A e li abbiamo trattati con butirato di sodio, un inibitore dell'istoria deacetilasi che induce l'iperacetilazione.

Introduction

Gli istones sono i componenti proteici dei nucleosomi, le unità ripetute della cromatina. Le loro code N-terminali sono ricche di residui di lisina e arginina e sono fortemente regolate da modifiche post-traduzionali (PTM), come acetilazione, metilazione e fosforilazione. Queste modifiche influenzano l'accessibilità del DNA e quindi controllano processi come trascrizione, replicazione e riparazione. I modelli alterati di PTM degli istoni sono fortemente associati a stati patologici, dal cancro alla neurodegenerazione e all'invecchiamento ^1,2. Per questo motivo, l'analisi PTM degli istoni è diventata di grande interesse nella ricerca in epigenetica e proteomica. La spettrometria di massa (MS) fornisce analisi site-specific e quantitativa delle modifiche degli istoni, ma gli istoni presentano sfide analitiche uniche. La composizione degli amminoacidi, i molteplici siti di modifica e i complessi schemi combinatori li rendono più difficili da analizzare rispetto alle proteine tipiche. I protocolli consolidati si basano sulla derivatizzazione chimica per bloccare i residui di lisina prima della digestione, migliorando il recupero dei peptidi e le prestazioni^{cromatografiche 3}. Sebbene efficaci nelle analisi di massa, questi protocolli di derivatizzazione a più fasi possono introdurre perdite problematiche per gli input a singola cella. L'analisi a singola cellula è sempre più importante perché i sistemi biologici sono intrinsecamente eterogenei. Gli istoni di massa analizzano i segnali medi di molte cellule e quindi non riescono a catturare questa variabilità. Le sottopopolazioni cellulari possono differire nei loro stati di cromatina, e queste differenze possono guidare lo sviluppo, la riprogrammazione cellulare o le risposte ai farmaci ^4,5.

Qui presentiamo un metodo automatizzato di preparazione del campione per l'analisi multiplexata degli istoni a singola cellula (sc-hPTM2). Questo metodo si basa sul sistema CellenONE, che consente la dispensazione precisa di singole cellule e reagenti su scala nanolitrica in modo automatizzato. Questo metodo è una variante del metodo di preparazione nanoproteomica del campione (nPOP), che introdusse per la prima volta l'uso della preparazione delle gocce su un^{vetrino di vetro 6}. La piattaforma nPOP dispone di una proteomica avanzata e automatizzata a singola cellula, eppure il suo protocollo standard di digestione triptica è subottimale per le istones a causa dell'alto contenuto di lisina e dell'ampia densità di modifica. Qui, abbiamo adattato il sistema CellenONE per incorporare la derivatizzazione degli istoni di riferimento con anidride propionica e introdotto la marcatura isotopica, consentendo una quantificazione accurata e completa delle modifiche post-traduzionali degli istoni a risoluzione di una singola cellula. In particolare, semplifichiamo il protocollo utilizzando ArgC Ultra proteasi per la digestione delle proteine. A differenza della tripsina, l'ArgC si taglia solo nei residui di arginina e non necessita di bloccare la lisina. Questo elimina la necessità di una strategia di derivatizzazione in due fasi, semplificando il protocollo. Inoltre, il metodo incorpora uno schema di marcatura isotopica a due plex utilizzando anidride propionica e anidride propionica-d10, permettendo di analizzare simultaneamente 2^{cellule 7,3}. Dopo la digestione e la marcatura, i campioni monocellulari vengono recuperati e analizzati tramite cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS)/MS utilizzando acquisizione indipendente dai dati (DIA). Nelle nostre mani, questo metodo ha dimostrato un aumento sia della sensibilità che della riproducibilità per la quantificazione delle PTM degli istoni rispetto alla versione precedente⁸.

Per dimostrare il metodo, abbiamo profilato la dinamica PTM degli istoni monocellulari in sferoidi derivati da cellule epatocellulari di carcinoma HepG2/C3A. Abbiamo trattato questi sferoidi con butirato di sodio, un inibitore ben caratterizzato dell'istoria deacetilasi che aumenta l'acetilazione degli itoni, fungendo da punto di riferimento per la rilevazione della regolazione della^{cromatina 9,10}. Confrontando sferoidi di controllo e trattati con butirato a risoluzione monocellulare, dimostriamo una dimostrazione di principio di risultati rappresentativi, evidenziando il potenziale per applicazioni più ampie nella biologia della cromatina e nell'epigenetica del cancro. In particolare, per il protocollo, facciamo riferimento a una pubblicazione precedente che descriveva la crescita e il trattamento degli sferoidi^{3D 10}, l'acquisizione di peptidi istonici nella spettrometria^{di massa 11} e l'analisi dei dati tramite il software^{EpiProfile 12}.

Protocol

1. Buffer e reagenti

1. Mezzi di crescita cellulare per cellule HepG2/C3A: Preparare il Mezzo Eagle's Modified Dulbecco (DMEM, 4,5g/L di glucosio) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), amminoacidi non essenziali (1% v/v), L-glutamina (1% v/v) e penicillina/streptomicina (0,5% v/v). Il materiale di crescita è immagazzinato a 4 °C.
2. Master mix: Preparare ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in acqua di grado LC-MS.
3. Soluzione di HA: Prepara idrossilamina all'1% (v/v) in acqua di grado LC-MS.
4. Lavare la soluzione: Prepara 10 mL di una miscela 50:50 acetonitrile/acqua contenente acido formico allo 0,1% (p/w) (tutto di grado LC-MS).
5. Fase A Cellulare (MPA) - acido formico allo 0,1%: Aggiungere 1 mL di acido formico concentrato a 999 mL di acqua di grado HPLC e mescolare bene.
6. Fase B Mobile (MPB) - 80% acetonitrile HPLC + 0,1% acido formico: Aggiungere 800 mL di acetonitrile HPLC a 199 mL di acqua HPLC. Successivamente, aggiungi 1 mL di acido formico concentrato a questa soluzione e mescola.

2. Preparazione degli sferoidi

1. Per la preparazione degli sferoidi, si veda Stransky S et ^al.11.
2. Coltivare cellule di carcinoma epatocellulare di HepG2/C3A in un bioreattore tridimensionale rotante (3D) per 5-7 giorni per promuovere una formazione uniforme di sferoidi fino a raggiungere un diametro di ~400-600 μm. Usa DMEM integrato con FBS al 10%, amminoacidi non essenziali all'1%, 1% L-glutamine e 0,5% penicillina/estreptomicina. Mantenere gli sferoidi a 37 °C e il 5% di_CO2 fino al trattamento.
   NOTA: La Figura 1A rappresenta l'attrezzatura utilizzata per preparare gli sferoidi nel documento di riferimento.

3. Coltura cellulare e trattamento

1. Inserire ~10 sferoidi in una piastra a 6 pozzetti per coltura tissutale contenente 2 mL di mezzo di crescita.
2. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
3. Trattare gli sferoidi per 24 ore con 5 mM di butirato di sodio oppure aggiungere lo stesso volume d'acqua per il controllo (Figura 1B).

4. Isolamento delle celle e preparazione della sospensione a singola cella

1. Dopo 24 ore di trattamento, incubare le cellule con 1 mL di triple a 37 °C per 3-5 minuti.
2. Pipetta delicatamente su e giù finché lo sferoide non si rompe e si ottengono singole cellule.
3. Raccogliere le celle in un tubo da 15 mL e lavarle, diluendo fino a 10 mL con un PBS 1x gelato, centrifugare a 500 g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il soprantantante.
4. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo e 1x e aggiungere la colorazione verde Sytox per cellule morte con una concentrazione finale di 1 μM.
5. Incubare la cellula con Sytox green per 20 minuti su ghiaccio in un ambiente buio.
6. Lavare la cella con 10 mL di PBS 1x gelato, centrifugare a 500 g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il soprantantante.
7. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS freddo e aggiungere paraformaldeide (PFA) con una concentrazione finale dello 0,5%.
8. Incubare la cellula con PFA per 15 minuti su ghiaccio.
   NOTA: Sebbene Sytox green non sia tipicamente compatibile con la fissazione a causa della permeabilizzazione della membrana, per le cellule che abbiamo testato la proporzione di cellule Sytox green rimane invariata fino a 8 ore dopo la fissazione senza segni di perdita di proteine itonice.
9. Lavare la cella con 10 mL di PBS 1x gelato, centrifugare a 500 g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il soprantantante.
10. Ricostituire le cellule a una concentrazione finale di 200-500 cellule/μL.
    NOTA: Per le cellule piccole che non tendono a depositare, si raccomanda una concentrazione di 500 cellule/μL, mentre per le cellule grandi che tendono a depositarsi, si raccomanda una concentrazione di 200 cellule/μL. Se la sospensione della cella è soggetta all'aggregazione, passala attraverso un colino da 40 μm prima dell'aspirazione per evitare l'ostruzione dell'ugello. Se cellule maggiori di 40 μm sono di interesse e probabilmente presenti in un campione, si può utilizzare invece un colino da 70 μm per rimuovere aggregati molto grandi.
11. Conservare le celle sul ghiaccio fino a quando non vengono caricate nello strumento per lo smistamento.

5. Connessione software e inizializzazione del sistema

1. Accendi il sistema cellenONE (Figura 2A), avvia il computer di controllo, avvia il software e apri lo spazio di lavoro utente v2.0-nPOP2 ; tutti i file di campo e i template di esecuzione richiesti per nPOP sono pre-caricati lì.
2. Assicurati che il raffreddatore dello strumento sia acceso, poi imposta il valore del punto di rugiada in base alla temperatura interna attualmente indicata dallo strumento.
3. Prepara il sistema con ugelli di distribuzione PDC-70, tipo 2 rivestiti (Figura 2B) installati negli slot 1 e 3, seguendo le istruzioni a schermo.
4. Imposta la larghezza dell'impulso e la tensione di trasmissione di ogni ugello ai valori specificati sulla confezione del produttore.
   NOTA: L'uso di due ugelli separati mantiene la consistenza della dispensazione: uno fornisce la sospensione della cella, l'altro i reagenti, quindi eventuali detriti che aderiscono a un ugello non comprometteranno le gocce successive. L'utilizzo di entrambi gli ugelli durante la fase finale di raccolta accelera anche il recupero del campione.
   1. (PASSO CRITICO) Per una massima efficienza di pick-up, lo spostamento z tra i due ugelli dovrebbe differire di <50 μm. Determina questo definiendo la posizione ottimale di contatto per ciascun ugello e confrontando le letture dell'altezza Z nella scheda Setup Ugello.
5. Riempi il serbatoio dell'umidificatore con acqua deionizzata fino alla linea di riempimento indicata.

6. Configurazione pre-esecuzione sul maneggiatore di liquidi

1. Seleziona la quantità di vetrini di vetro (Figura 2C) da preparare. Questa scelta definisce direttamente il numero totale di celle pianificate da analizzare.
2. Per uno schema di multiplexing a 2-plex (Figura 3A), caricare una singola slide con 320 celle.

7. Distribuzione di un "fossato" di dimetilsolfoso (DMSO) attorno ai bordi del slide

NOTA: La Figura 3B rappresenta i passaggi per preparare i campioni nel cellenONE a partire dal fossato di DMSO. Come ulteriore prevenzione contro l'evaporazione delle goccioline, il DMSO viene somministrato lungo i bordi delle vetrine.

1. Nella scheda Main, seleziona la corsa per 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Vai nella scheda Configurazione Target , carica il file DMSO_Moat.fld dalla cartella schema appropriata e imposta il numero di campi su Y, corrispondendo al numero di slide previste da elaborare.
3. Aliquota 150 μL di DMSO di grado LC-MS in un nuovo tubo PCR e posizionalo nella posizione 2 della stazione CellenWASH con il tappo del tubo rivolto verso la porta dello strumento.
4. Apri la scheda Run e clicca su Avvia Run. Il sistema aspirerà 10 μL di DMSO e si fermerà per la conferma da parte dell'utente della stabilità delle gocce. Spara tre gocce di prova autodrop (Figura 4A); se tutti e tre sono perfettamente formati, clicca su Continua Run.
5. Dopo la dispensazione, gli ugelli si scaricano automaticamente e lo strumento cattura immagini su tutte le diapositive per il controllo qualità. Esaminare le immagini per verificare una goccia DMSO uniforme su ogni vetrata e per verificare la presenza di gocce mancanti o fuori bersaglio (Figura 4B).

8. Distribuzione DMSO

1. Nella scheda Main , seleziona la corsa per 1_Dispense_DMSO.
2. Apri la scheda Configurazione Target , importi il file di campo DMSO.fld (Figura 4C) dalla directory dello schema appropriato e imposta Number of Fields su Y, corrispondendo al conteggio delle slide che intendi elaborare.
3. Aliquota 150 μL di DMSO di grado LC-MS in un nuovo tubo PCR e posizionalo nella posizione 2 della stazione CellenWASH con il tappo del tubo rivolto verso la porta dello strumento.
4. Apri la scheda Run e clicca su Avvia Run. Il sistema aspirerà 10 μL di DMSO e si fermerà per la conferma da parte dell'utente della stabilità delle gocce. Spara tre gocce di prova autodrop; se tutti e tre sono perfettamente formati, clicca su Continua Run.
5. Quando la distribuzione termina, il software risciacqua automaticamente gli ugelli e cattura immagini su ogni vetrina per garantire la qualità. Esaminare le immagini per verificare una goccia DMSO uniforme su ogni vetrata e per verificare la presenza di gocce mancanti o fuori bersaglio.

9. Distribuzione cellulare

1. Nella scheda Principale , seleziona la corsa per 2_Dispense_Cells.
2. Nella scheda Configurazione Target , apri la sottocartella Files di campo delle celle della directory dello schema multiplexing scelta.
3. Poiché l'esperimento prevede due condizioni, scegli il file di campo che corrisponde al campione che sta per essere ordinato: o CellType_A.fld o CellType_B.fld.
4. Dopo il caricamento del file, imposta Number of Fields a Y, così che sia uguale al numero totale di slide per questa esecuzione.
5. Sgas la sospensione della cella dal passo 4.11 con una pompa a vuoto per 10 minuti sul ghiaccio.
6. Trasferire 150 μL della sospensione della cella preparata in un CellenVIAL pulito, poi posizionare la fiala nello slot 1 della giostra CellenWASH con il tappo rivolto verso la porta dello strumento.
7. Vai nella scheda Setup Nozzle > Esegui Task ed esegui Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 per aspirare il campione dalla fiala.
8. Rimanendo nella scheda Configurazione Ugello , avvia il visualizzatore di distribuzione delle celle (Figura 5A) ed esegui la routine di mappatura per definire la zona di espulsione e gli oggetti del gate in base alla dimensione e all'allungamento. I parametri di isolamento della singola cellula mostrati nella Figura 5A corrispondono alle impostazioni esatte utilizzate per la dispensazione delle cellule HepG2/C3A dissociate dagli sferoidi.
9. Poi attiva la modalità fluorescenza selezionando T > F. Imposta la modalità di selezione su negativa. Aumentare l'intervallo di parametri di isolamento per dimensioni e intensità dal minimo al massimo per assicurarsi che non vengano isolate cellule morte.
10. Verifica con i parametri di mappatura, apri la scheda Esegui , clicca su Avvia Esegui, poi segui le istruzioni del software. Quando la dispensazione termina, lo strumento risciacquo automaticamente gli ugelli e cattura immagini delle vetrine per la revisione della posizione e dell'uniformità delle gocce.
    NOTA: Durante l'ordinamento delle celle, vengono scattate immagini di ogni singola cella isolata durante l'esecuzione (Figura 5B).
11. Dopo che la selezione delle celle è terminata, chiudi la finestra di dispensazione.
12. Tieni in sospensione residua la cella sul ghiaccio fino alla fine della sezione 9; Il surplus può essere utilizzato successivamente per campioni in massa, costruzione di librerie empiriche o ulteriori studi di validazione.

10. Distribuzione del master mix per la digestione

1. Nella scheda Principale , seleziona la corsa per 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Apri la scheda Configurazione Target , carichi Digest.fld dalla cartella appropriata dello schema multiplexing e imposta Number of Fields su Y in modo che sia uguale al conteggio delle diapositive per questa esecuzione.
3. Prepara un master mix fresco di digestione e degas la soluzione con una pompa a vuoto per 10 minuti su ghiaccio (Master mix: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM in acqua di grado LC-MS).
4. Pipettare 20 μL del master mix in una piastra da 384 pozzi e posizionare la piastra all'interno del sistema X1.
5. Nella scheda Esegui, clicca su Avvia Corri e segui le indicazioni. Dopo che il sistema aspira il reatto, conferma la stabilità delle gocce quando richiesto.
6. Quando la dispensazione termina, lo strumento risciacquo automaticamente gli ugelli e fotografa ogni vetrina; Esaminare le immagini per verificare che ogni goccia abbia ricevuto la miscela digestionale in modo uniforme.
7. Incubare le vetrine durante la notte per la digestione, mantenendo le impostazioni specificate di umidità e punto di rugiada. Ogni goccia contiene ~13,5 nL di miscela digeritiva. Effettuare la digestione durante la notte a ~75% di umidità relativa, mantenendo il punto di rugiada mantenuto 1-2 °C sotto la temperatura della camera per prevenire l'evaporazione delle gocce.

11. Incubazione durante la notte

1. Nella scheda Principale , scegli la corsa da 4_Incubation_16h.
2. Passa alla scheda Esegui , clicca su Avvia Esegui.
   NOTA: Gli strumenti scatteranno foto delle vetrine ogni 30 minuti per monitorare le condizioni delle gocce. Se si seccano o si gonfiano durante l'incubazione, regola la posizione del punto di rugiada secondo necessità.
3. Quando l'incubazione è completata, apparirà un messaggio che indica che l'incubazione è completata.
   NOTA: Digestioni rapide (≤4 ore) possono essere realizzabili con condizioni più elevate di efficacia tra enzima e substrato; Questo non è stato valutato qui, quindi la condizione validata rimane a 16 ore.

12. Evaporazione

NOTA: Prima di passare alla fase di etichettatura, si consiglia di controllare lo stato delle gocce per assicurarsi che non siano troppo gonfie d'acqua, poiché l'acqua potrebbe interferire con l'efficienza dell'etichettatura. A tal fine, si raccomanda la fase di evaporazione.

1. Nella scheda Principale , scegli la corsa da 5_Evaporation.
2. Vai su File, Controllo Unità di Raffreddamento, e sotto Controllo Punto di Rugiada imposta Temperatura di Controllo Fissa a 23 °C.
3. Passa alla scheda Esegui , clicca su Avvia Esegui. L'asciugatura durerà 5 minuti e gli strumenti cattureranno automaticamente le foto delle diapositive dopo l'asciugatura.
4. Ispeziona le foto; Se le gocce sono sufficientemente secche, ferma la corsa. Se no, clicca su continua e asciuga per altri 5 minuti (Figura 6A).
5. Alla fine della corsa, torna al precedente Controllo del Punto di Rugiada.

13. Etichette che dispensano

1. Nella scheda Principale , scegli la corsa da 6_Dispense_PA_Labels.
2. Vai nella scheda Configurazione Target , carica il file Labels.fld dalla cartella schema appropriata e imposta il numero di campi su Y, corrispondendo al numero di slide previste da elaborare.
3. Aliquota 150 μL di DMSO di grado LC-MS nello slot 2 della stazione CellenWASH.
4. Prepara una soluzione stock delle due scorte di marcatura per la derivatizzazione multiplexata degli istoni: anidride propionica al 25% (v/v) in DMSO e anidride propionica al 25% (v/v) in DMSO.
   NOTA: Degas entrambe le soluzioni prima di trasferirle sulla lastra per minimizzare la formazione delle bolle.
5. Dispensare 20 μL di ciascun reagente di marcatura nei pozzi designati di una piastra da 384 pozzi e posizionare la piastra all'interno del sistema X1. Ogni goccia riceve ~10 nL di reagente di marcatura (25% anidride propionica o 25% anidride propionica-d₁₀ in DMSO).
6. Passa alla scheda Esegui , clicca su Avvia Esecuzione e segui le indicazioni.
7. Lascia che le etichette reagiscano in modo scorrevole per 1 ora.
8. Dopo la dispensazione, lo strumento risciacquo automaticamente gli ugelli e fotografa ogni vetrina. Esamina le immagini per confermare una distribuzione uniforme e la corretta posizione delle gocce su tutte le vetrine.

14. Distribuzione di HA

1. Prepara la soluzione HA e degassalla prima dell'uso.
2. Carica la fiala. Pipettare 150 μL della soluzione HA in un tubo PCR pulito, posizionarlo nello slot 2 di CellenWASH e orientare il tappo verso la porta dello strumento.
3. Seleziona il profilo run. Nella scheda Principale , scegli 7_Dispense_Quench.
4. Configura il file di campo. Apri la scheda Configurazione Obiettivo , carichi HA.fld dalla cartella dello schema multiplexing appropriata e imposta Numero di campi a Y in modo che sia uguale al conteggio totale delle slide.
5. Inizia la corsa. Naviga su Esegui, clicca su Avvia Esegui e segui le istruzioni a schermo.
6. Incubare. Lascia che l'HA reagisca sui diapositive per 30 minuti.
7. Verifica la dispensazione. Dopo il completamento, il sistema risciacqua gli ugelli e cattura immagini di ogni diapositiva - revisiona queste immagini per confermare una posizione uniforme delle gocce e il volume.

15. Pickup campione

1. Prepara la soluzione di lavaggio nel WashTray XL.
2. Prepara il piatto di raccolta. Erogare 2 μL di DDM allo 0,01% (p/w) in acqua di grado LC-MS in ogni pozzo di una piastra fresca a 384 pozzi e posizionare la piastra all'interno del trattamento liquido.
3. Scegli il percorso di ritiro. Nella scheda Main , seleziona il profilo 8_Pickup_2plex.
4. Carica il file di campo. Apri la scheda Configurazione Target , importa Pick-up.fld dalla directory corretta dello schema multiplexing e imposta Number of Fields a Y in modo che corrisponda al conteggio delle diapositive.
5. Esegui la run. Passa alla scheda Esegui , clicca su Avvia Esecuzione e segui le indicazioni. Lo strumento raccoglierà ogni goccia, risciacquarà gli ugelli e immagini delle vetrine per la revisione per confermare che ogni campione sia stato prelevato.

16. Elaborazione post-ritiro

1. Sigilla la piastra da 384 pozzi con un foglio adesivo e centrifuga brevemente per portare le gocce sul fondo dei pozzi.
2. Rimuovi la carta di alluminio e asciuga i campioni a bassa temperatura in un concentratore a vuoto.
3. Sigilla la piastra con una lamina adesiva e conserva la piastra secca a -80 °C fino a quando non è pronta per l'analisi LC-MS/MS.

17. Preparazione dei campioni in blocco

1. Utilizzando la sospensione residua dalla sezione 9, spina le cellule e risospendi in 1x PBS per ottenere una concentrazione di 2.000 cellule/μL. Ciò dovrebbe essere eseguito dopo il completamento della sezione 10.
2. Lisi termica: congelare bruscamente la sospensione rimanente a -80 °C per 10 minuti, poi shock termico a 90 °C per 10 minuti.
3. Lascia raffreddare il tubo fino a temperatura ambiente.
4. Trasferire 25 μL del lisato in un tubo PCR e aggiungere 5 μL della miscela digeritiva precedentemente preparata.
5. Incubare durante la notte (≈ 16 ore) a 37 °C in un termociclatore.
6. Derivatizzazione con marcatore luminoso: aggiungere 5 μL di una nuova etichetta leggera al 25% (v/v) in acetonitrile e incubare per 1 ora.
7. Tempra a reazione: aggiungere 5 μL di soluzione di idrossilamina (HA) al 1% (w/w) e incubare per 30 minuti.
8. Asciugare il campione in un concentratore a vuoto impostato a bassa temperatura, poi conservare a -80 °C fino a quando non è pronto per LC-MS/MS.

18. Configurazione LC/MS e acquisizione dati

NOTA: Per raccogliere i dati per questo manoscritto, è stato installato un sistema LC-MS\MS con una colonna analitica Ion Optics 75 μm diametro diametrale x 25 cm x 1,7 μm.

1. Preparare le fasi mobili per funzionare sull'HPLC:
   Fase A Mobile (MPA): acido formico allo 0,1% in acqua di grado HPLC
   Fase B Cellulare (MPB): acido formico allo 0,1% nell'acetonitrile di grado HPLC
2. Programmare il metodo HPLC per un gradiente attivo di 30 minuti: 5-23% MPB in 25,7 min, 23-35% MPB in 2,6 min e 35-45% MPB in 1,7 min, a una portata di 200 nL/min. Programma l'autocampionatore per risospendere il campione in 0,1% FA + 0,01% DDM per il raccolto 'secco'.
3. Configurare il metodo di acquisizione MS per eseguire acquisizione indipendente dai dati (DIA):
   NOTA: Queste impostazioni sono specifiche per un Thermo Exploris 480 equipaggiato con FAIMS Pro Duo e possono variare a seconda del tuo strumento. Si raccomanda di utilizzare quelli comuni per la proteomica DIA a singola cellula con intervalli m/z simili come descritto di seguito.
   1. Imposta la MS come una scansione completa da 300 a 1100 m/z con una risoluzione di 120.000, un obiettivo AGC del 300%, un tempo massimo di iniezione di 246 ms e un CV FAIMS di -50 V.
   2. Imposta la MS/MS come una scansione DIA da 300 a 1100 m/z con una risoluzione di 60.000, finestra di isolamento di 50 m/z, energia di collisione HCD del 27%, prima massa di 120 m/z, obiettivo AGC del 1000%, tempo massimo di iniezione di 118 ms e CV FAIMS di -50 V.
4. Rimuovere la tenuta in alluminio dalla piastra a 384 pozzi contenente le singole celle. Si ricostituisce il campione di massa a 100 celle/μL con 0,1% FA + 0,01% DDM e si trasferisce 10 μL in un pozzo vuoto, come P24. Poi, sigilla la piastra con un tappetino di gomma perforabile e caricala nell'autocampionatore.
5. Eseguire le esecuzioni in coda: eseguire prima i campioni di massa e poi i set di singole celle.

19. Analisi dei dati

1. Esegui i dati grezzi con EpiProfile2.1 per ottenere l'output con le abbondanze dei peptidoformi per le cellule marcate con anidride propionica.
   NOTA: I campioni devono essere acquisiti su uno strumento Thermo per poter utilizzare EpiProfile 2.1 per l'elaborazione dei dati. Questo software estrae circa 250 peptidoformi con la sua versione canonica, ma è modificabile a seconda dell'organismo, modifiche aggiuntive di interesse, mutazioni, ^ecc.12.
2. Esegui i dati grezzi con EpiProfile2.1_D5 per ottenere l'output con le abbondanze peptidoforme per le cellule marcate con anidride propionica-d10.
3. Esegui la mappatura collegando i metadati con gli output Epiprofile tramite il programma quantQC.
4. Filtra i campioni falliti confrontandolo con quelli a vuoto.
5. Filtra peptidoformi che non si trovano in almeno il 50% dei campioni.
6. Filtrare peptidoformi il cui segnale di intensità della singola cellula non è superiore al 150% nel blocco vuoto.
7. Ottieni la tabella dei risultati (Figura 7A) e elabora ulteriormente i dati secondo necessità.

Results

Per dimostrare l'applicazione del nostro flusso di lavoro proteomico-istonico a singola cellula utilizzando il nostro sistema, abbiamo analizzato sferoidi di cellule HepG2/C3A trattate con 5 mM di butirato di sodio per 24 ore. Dopo l'acquisizione di LC-MS/MS, i dati grezzi sono stati processati con EpiProfile sia per la marcatura leggera (anidride propionica) sia per la marcatura pesante (anidride propionica-d10), ottenendo dati normalizzati che rappresentano le abbondanze dei peptidi e dei segni degli istoni. Il pacchet...

Discussion

La capacità di misurare le modifiche post-traduzionali degli istoni a livello di singola cellula rappresenta un passo cruciale verso la comprensione della vera eterogeneità della regolazione della cromatina. I metodi tradizionali di blocco hanno fornito preziose informazioni sulla distribuzione media degli hPTM tra i tessuti, ma mascherano la variabilità cellula a cellula che è sempre più riconosciuta come biologicamente^{significativa 5}. Gli approcci proteomici a s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi microcentrifughe da 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 & micro; Punte a canna larga a L	Fisher Scientific	14222703
200 & micro; Punte a canna larga a L	Fisher Scientific	14222730
Placca PCR a 384 pozzi Lo Bind	Eppendorf	30129547
Collettore a vuoto a 96 pozzi	Millipore	MAVM0960R
Acetonitrile, grado Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Lamine adesive per piastre PCR	Thermo Fisher	AB0626
Acetonitrile anidro	Fisher Scientific	AA42311AK	Soluzione di stock per etichette e sfusi
Arg-C Ultra, grado Mass Spec	Promega	VA1831
Acqua di grado cellulare	Corning	25-055-CV
CellenVIALS	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
DMSO, Anidro	Thermo Fisher	D12345	Soluzione di stock per etichette
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco's Eagle's Medium Modificato (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Siero bovino fetale	Fisher Scientific	MT35010CV
Acido formico	Thermo	28905
Acido formico 98%– 100% per LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Puro)	Thermo Fisher	11344041
Acetonitrile di grado HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Acqua di grado HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Soluzione di idrossilamina 50 t. % in H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamina	Fisher Scientific	MT25015CI
Detergente n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Amminoacidi non essenziali	Fisher Scientific	MT25025CI
Spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldeide 16% Soluzione Acquosa di Grado EM	Scienze della microscopia elettronica	15710-S
PDC-CM (rivestimento di tipo 2)	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
Penicillina-Streptomicina	Fisher Scientific	MT3002CI
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, senza RNasi	Thermo Fisher	AM9625
Perforazione Dimetilsolfossido (DMSO), grado LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistola a pipetta	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Anidride propionica ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Anidride propionica-d10 & ge; 98 atomi % D, ≥ 99% (CP)	Sigma	615692-1G
Centrifuga refrigerata	Thermo	75-217-420
Vetri rivestiti SciCHIP H1	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
Concentratore a vuoto SpeedVac (piastre a 96 pozzi)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Cappuccio sterile	Thermo	1375
Pipette sierologiche sterili	Fisher Scientific	1367549
Colorazione SYTOX Green Dead Cell, per citometria a flusso	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzyme (1X), senza fenolo rosso	Thermo Fisher	12604013
Vortice	Sigma	Z258415
Bagno d'acqua	Fisher Scientific	FSGPD10