Preparazione automatica del campione per l'analisi multiplexata delle modifiche post-traduzionali delle istane a singola (sc-hPTM2)

Summary

Qui presentiamo un protocollo per automatizzare l'analisi post-traduzionale delle modifiche degli istoni a singola cellula utilizzando una strategia di marcatura isotopica a due plex e la digestione ArgC. Questo flusso di lavoro consente un profiling quantitativo, riproducibile e ad alta sensibilità dell'eterogeneità della cromatina e delle risposte epigenetiche a risoluzione di singola cellula.

Abstract

Le modifiche post-traduzionali delle istone (hPTM) sono regolatori centrali dell'organizzazione della cromatina e dell'espressione genica. La loro disregolazione è implicata nello sviluppo, nel cancro e nell'invecchiamento. Sebbene la spettrometria di massa sia il metodo preferito per studiare gli hPTM, la maggior parte dei protocolli è progettata per campioni di massa e non può risolvere la variabilità cellula a cellula. Estendere l'analisi PTM degli istoni al livello di singola cellula è quindi essenziale ma tecnicamente impegnativo, poiché gli istoni sono in bassa abbondanza, ricchi di lisina e fortemente modificati.

Qui descriviamo un flusso di lavoro proteomico automatizzato a singola cellula per l'analisi PTM degli istoni utilizzando la gestione di nano liquidi. Il sistema consente l'elaborazione su scala nanolitrica di singole cellule con una gestione minima e un'elevata riproducibilità. Il flusso di lavoro include la digestione con ArgC Ultra proteasi, che taglia i residui di arginina ed evita la necessità di passaggi di derivatizzazione che bloccano la lisina tipicamente necessari nella proteomica degli istoni. Per consentire un confronto quantitativo tra le condizioni, applichiamo una strategia di marcatura a due plex con anidride propionica e il suo analogo deuterato, l'anidride propionica-d10. Questa combinazione di preparazione automatica del campione, multiplexazione isotopica e digestione ArgC Ultra porta a un protocollo semplificato e sensibile per l'analisi PTM degli istoni a singola cellula.

Il metodo consente di studiare l'eterogeneità della cromatina e gli effetti delle perturbazioni epigenetiche a risoluzione monocellulare. Per dimostrare il flusso di lavoro, abbiamo generato sferoidi dalle cellule epatocellulari del carcinoma HepG2/C3A e li abbiamo trattati con butirato di sodio, un inibitore dell'istoria deacetilasi che induce l'iperacetilazione.

Introduction

Gli istones sono i componenti proteici dei nucleosomi, le unità ripetute della cromatina. Le loro code N-terminali sono ricche di residui di lisina e arginina e sono fortemente regolate da modifiche post-traduzionali (PTM), come acetilazione, metilazione e fosforilazione. Queste modifiche influenzano l'accessibilità del DNA e quindi controllano processi come trascrizione, replicazione e riparazione. I modelli alterati di PTM degli istoni sono fortemente associati a stati patologici, dal cancro alla neurodegenerazione e all'invecchiamento ^1,2. Per questo motivo, l'analisi PTM d....

Protocol

1. Buffer e reagenti

1. Mezzi di crescita cellulare per cellule HepG2/C3A: Preparare il Mezzo Eagle's Modified Dulbecco (DMEM, 4,5g/L di glucosio) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), amminoacidi non essenziali (1% v/v), L-glutamina (1% v/v) e penicillina/streptomicina (0,5% v/v). Il materiale di crescita è immagazzinato a 4 °C.
2. Master mix: Preparare ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in acqua di grado LC-MS.
3. Soluzione di HA: Prepara idrossilamina all'1% (v/v) in acqua di grado LC-MS.
4. Lavare la soluzione: Pr....

Results

Per dimostrare l'applicazione del nostro flusso di lavoro proteomico-istonico a singola cellula utilizzando il nostro sistema, abbiamo analizzato sferoidi di cellule HepG2/C3A trattate con 5 mM di butirato di sodio per 24 ore. Dopo l'acquisizione di LC-MS/MS, i dati grezzi sono stati processati con EpiProfile sia per la marcatura leggera (anidride propionica) sia per la marcatura pesante (anidride propionica-d10), ottenendo dati normalizzati che rappresentano le abbondanze dei peptidi e .......

Discussion

La capacità di misurare le modifiche post-traduzionali degli istoni a livello di singola cellula rappresenta un passo cruciale verso la comprensione della vera eterogeneità della regolazione della cromatina. I metodi tradizionali di blocco hanno fornito preziose informazioni sulla distribuzione media degli hPTM tra i tessuti, ma mascherano la variabilità cellula a cellula che è sempre più riconosciuta come biologicamente^{significativa 5}. Gli approcci proteomici a s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi microcentrifughe da 1,5 mL	Bio-Rad	2239480
1000 & micro; Punte a canna larga a L	Fisher Scientific	14222703
200 & micro; Punte a canna larga a L	Fisher Scientific	14222730
Placca PCR a 384 pozzi Lo Bind	Eppendorf	30129547
Collettore a vuoto a 96 pozzi	Millipore	MAVM0960R
Acetonitrile, grado Optima LC-MS/MS	Fisher Scientific	A955-1
Lamine adesive per piastre PCR	Thermo Fisher	AB0626
Acetonitrile anidro	Fisher Scientific	AA42311AK	Soluzione di stock per etichette e sfusi
Arg-C Ultra, grado Mass Spec	Promega	VA1831
Acqua di grado cellulare	Corning	25-055-CV
CellenVIALS	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
DMSO, Anidro	Thermo Fisher	D12345	Soluzione di stock per etichette
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco's Eagle's Medium Modificato (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Siero bovino fetale	Fisher Scientific	MT35010CV
Acido formico	Thermo	28905
Acido formico 98%– 100% per LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Puro)	Thermo Fisher	11344041
Acetonitrile di grado HPLC	Fisher Scientific	A955-4
Acqua di grado HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Soluzione di idrossilamina 50 t. % in H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamina	Fisher Scientific	MT25015CI
Detergente n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM)	Fisher Scientific	BN2005
Amminoacidi non essenziali	Fisher Scientific	MT25025CI
Spettrometro di massa Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldeide 16% Soluzione Acquosa di Grado EM	Scienze della microscopia elettronica	15710-S
PDC-CM (rivestimento di tipo 2)	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
Penicillina-Streptomicina	Fisher Scientific	MT3002CI
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, senza RNasi	Thermo Fisher	AM9625
Perforazione Dimetilsolfossido (DMSO), grado LC-MS	Thermo Fisher	85190
Pistola a pipetta	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Anidride propionica ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Anidride propionica-d10 & ge; 98 atomi % D, ≥ 99% (CP)	Sigma	615692-1G
Centrifuga refrigerata	Thermo	75-217-420
Vetri rivestiti SciCHIP H1	SCIENION	/	Il numero di catalogo è accompagnato da una citazione
Concentratore a vuoto SpeedVac (piastre a 96 pozzi)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Cappuccio sterile	Thermo	1375
Pipette sierologiche sterili	Fisher Scientific	1367549
Colorazione SYTOX Green Dead Cell, per citometria a flusso	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzyme (1X), senza fenolo rosso	Thermo Fisher	12604013
Vortice	Sigma	Z258415
Bagno d'acqua	Fisher Scientific	FSGPD10