Articolo metodologico

Ovulazione massiccia nei mammiferi: tecniche per analizzare la poliovulazione spontanea naturale e la poliovulazione indotta in Lagostomus maximus

DOI:

10.3791/69653

⸱

6 febbraio 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive metodi per analizzare l'ovulazione naturale e indotta nel Lagostomus maximus, incluso il recupero degli ovociti dopo ovulazione spontanea, indotta ormonale o indotta dal plasma seminale. Fornisce un quadro completo per studiare la reattività ovarica e la fisiologia riproduttiva in un modello mammifero altamente poliovulatorio.

Abstract

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La vizcacha delle pianure sudamericane, Lagostomus maximus, è riconosciuta come la specie mammifera con il tasso di ovulazione più alto, che può raggiungere fino a 300 ovuli. Questo straordinario fenomeno di poliovulazione può essere esaminato attraverso diversi approcci metodologici che riflettono la sua fisiologia riproduttiva distintiva. L'ovulazione naturale viene valutata tramite il rilascio di ovociti durante la stagione riproduttiva, che fornisce informazioni sui meccanismi ovulatori spontanei della specie, con gli ovociti recuperati lavando l'ovidotto e le corna uterine. Inoltre, l'induzione sperimentale dell'ovulazione tramite ormoni esogeni, come le gonadotropine, consente una valutazione controllata della reattività ovarica e offre un modello prezioso per comprendere la regolazione endocrina nei roditori istricognati. Un terzo approccio prevede l'uso del plasma seminale autologo come scatenante fisiologico dell'ovulazione, evidenziando la coesistenza di meccanismi indotti e spontanei in questa specie. Insieme, queste tecniche non solo chiariscono la dinamica del reclutamento follicolare e del rilascio degli ovociti, ma consolidano anche L. maximus come modello comparativo per la biologia riproduttiva, con potenziali implicazioni traslazionali per la comprensione del controllo dell'ovulazione nei mammiferi.

Introduzione

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La vizcacha delle pianure sudamericane (Lagostomus maximus) è un roditore istricognato distinto per la sua eccezionale fisiologia riproduttiva, caratterizzata da un tasso di ovulazione straordinario che può superare i 300 ovociti per ciclo 1,2. Questa caratteristica distintiva ha posizionato L. maximus come modello naturale per lo studio della funzione ovarica e del controllo ovulatorio neimammiferi 3,4,5,6,7,8,9,10,11.

A differenza degli ovulatori spontanei tipici, L. maximus presenta sia meccanismi ovulatori spontanei cheindotti 2. Questa dualità, combinata con una massiccia crescita follicolare e ovulazione asincrona, sfida gli approcci convenzionali basati esclusivamente sugli endpoint endocrini oistologici 4,12,13,14. Di conseguenza, l'uso di tecniche dirette e quantitative è essenziale per determinare con precisione il momento e l'entità del rilascio degli ovociti.

Le femmine adulte di vizcacha sono state ottenute da una popolazione residente naturale mantenuta presso la Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS), Parque Pereyra Iraola, Berazategui, Provincia di Buenos Aires, Argentina (34°49′57" S, 58°06′12" W). Riconosciamo che i diritti sovrani sulle risorse naturali sono proprietà esclusiva della Provincia di Buenos Aires. Il numero di animali catturati fu autorizzato dal Ministero dell'Agricoltura della provincia di Buenos Aires. Le femmine venivano catturate utilizzando trappole vive posizionate agli ingressi delle tane in diversi momenti dell'anno.

I periodi di cattura sono stati selezionati in base al ciclo riproduttivo naturale della specie stabilito da Llanos &Crespo 15, e perfezionati sulla base della nostra esperienza sul campo 7,8,10,14. La specie presenta una stagione riproduttiva principale che va dalla fine dell'estate (marzo) fino all'inizio della primavera tra le16, 17 e 18 settembre, e un periodo di riproduzione secondario che avviene in ottobre, specialmente nelle femmine che hanno perso la prole15. Di conseguenza, sono stati determinati i seguenti gruppi di lavoro: a) Gruppo I (N= 27): fine febbraio-inizio aprile (non gravidanze, inizio della stagione riproduttiva principale); b) Gruppo II (N= 26): metà settembre-fine ottobre (estro non incinte, post-lattazione); Gruppo III (N= 35): dicembre-gennaio (ovulazione indotta da ormoni non incinta); Gruppo IV (N= 7): dicembre-gennaio (ovulazione indotta dal plasma seminale non incinta).

Questo studio presenta e convalida diversi approcci metodologici per l'analisi dell'ovulazione in L. maximus: (1) valutazione dell'ovulazione naturale attraverso il recupero diretto degli ovociti; (2) induzione dell'ovulazione tramite gonadotropine esogene; e (3) induzione dell'ovulazione con plasma seminale autologo. Ogni tecnica fornisce approfondimenti complementari sulla dinamica follicolare, sulla maturazione degli ovociti e sui meccanismi regolatori che regolano l'ovulazione.

Il lavaggio degli ovidotti e delle corna uterine consente il recupero diretto degli ovociti e una quantificazione accurata dell'ovulazione, consentendo una correlazione con lo sviluppo follicolare e la morfologia degliovociti 19,20,21. La stimolazione ormonale con gonadotropine esogene, adattata dai protocolli utilizzati nei roditoridi laboratorio 22, consente una valutazione controllata della reattività ovarica e del momento del rilascio degli ovociti. Nel frattempo, l'uso del plasma seminale autologo come fattore fisiologico scatenante dell'ovulazione - precedentemente descritto in ovulatori indotti come conigli e camelidi 23,24,25 – offre un modo innovativo per esplorare i fattori endocrini e paracrini coinvolti nell'ovulazione.

Integrando queste metodologie complementari, il presente lavoro fornisce un quadro riproducibile per indagare i meccanismi ovulatori in L. maximus. La combinazione di modelli naturali e indotti permette di differenziare tra reclutamento follicolare spontaneo, efficienza ovulatoria e risposte mediate dal plasma seminale. Inoltre, questi approcci rivelano fenomeni come l'attivazione spontanea degli oociti partenogenetici e la coesistenza di ovociti "difettosi" ed "euovulatori", contribuendo alla comprensione della selezione follicolare e della competenzadegli ovociti 2.

Oltre alle sue implicazioni specifiche per specie, il modello vizcacha offre una rilevanza più ampia per la biologia riproduttiva comparata. La sua strategia ovulatoria mista collega le caratteristiche degli ovulatori indotti e spontanei, fornendo preziosi parallelismi con i processi riproduttivi di altri mammiferi, incluse specie domestiche eumani 7,14,26,27.

I protocolli metodologici qui descritti sono progettati per garantire la riproducibilità e facilitarne l'adattamento a diversi contesti sperimentali che coinvolgono dinamiche follicolare, regolazione ovulatoria e manipolazione ormonale.

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Protocollo

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I protocolli sperimentali descritti in questo documento sono stati esaminati e approvati dal Comitato Istituzionale per l'Uso e la Cura degli Animali Sperimentali (CICUAE, Universidad Maimónides, numero di protocollo #6184). La cattura, la maneggiatura e l'eutanasia venivano eseguite da personale tecnico formato in conformità con tutte le normative locali, statali e federali che regolano la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'allevamento ha seguito le linee guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio28 e le linee guida dell'American Society of Mammalogists (ASM) per l'uso dei mammiferi selvatici nellaricerca 29. Tutti gli esperimenti rispettavano le linee guida ARRIVE 2.030. Furono fatti ogni sforzo per minimizzare il numero di animali utilizzati. La vizcacha delle pianure sudamericane (Lagostomus maximus) non è considerata una specie invia di estinzione 31.

1. Induzione ormonale dell'ovulazione

NOTA: Questa sezione presenta l'induzione ormonale dell'ovulazione nelle femmine non gravide di vizcacha catturate. Vengono discusse tre diverse opzioni di protocollo.

  1. Protocollo A:
    1. Somministrare 200 UI di gonadotropina corionica equina (eCG) intramuscolare a 0 e 24 ore, seguite da 500 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) a 48 ore.
    2. Riposare le femmine fino all'eutanasia.
    3. Eutanasiare le femmine 60-132 ore dopo la somministrazione dell'hCG (vedi sezione 3).
  2. Protocollo B:
    1. Somministrare 200 UI di eCG intramuscolare a 0 ore e 24 ore, seguite da 1.000 UI di hCG a 72 ore.
    2. Riposare le femmine fino all'eutanasia.
    3. Eutanasiare le femmine 60-132 ore dopo la somministrazione dell'hCG (vedi sezione 3).
  3. Protocollo C:
    1. Somministrare 250 UI di eCG per via intramuscolare a 0 ore, 24 ore e 48 ore, seguite da 2 mg di ormone luteinizzante suino (pLH) a 72 ore.
    2. Riposare le femmine fino all'eutanasia.
    3. Eutanasiare le donne 60-132 ore dopo la somministrazione della pLH (vedi sezione 3 e Tabella 1).
      NOTA: Gli animali di ciascun gruppo sono stati soppressi in momenti diversi (da 60 ore a 132 ore dopo la somministrazione dell'hCG). Questa distribuzione temporale era essenziale per confermare la natura prolungata del periodo di ovulazione in questa specie. In particolare, per esperimenti volti alla raccolta esclusiva di ovociti maturi, l'eutanasia è stata eseguita costantemente a 120 ore dopo l'hCG.

2. Induzione dell'ovulazione da plasma seminale

NOTA: Testare la capacità del plasma seminale di indurre l'ovulazione tramite somministrazione intramuscolare nelle donne con pre-sveglianza ormonale.

  1. Raccolta e preparazione del seme
    1. Raccogliere lo sperma di maschi riproduttivamente attivi tramite elettroeiaculazione, come descritto da Giacchino32.
    2. Centrifugare lo sperma a 200 × g per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare spermatozoi e detriti cellulari.
    3. Integrare i soprantativi (plasma seminale) con penicillina e streptomicina e conservare a -20 °C fino all'uso.
  2. Induzione dell'ovulazione nelle femmine non gravide tramite plasma seminale
    1. Somministrare 200 UI di eCG intramuscolare a 0 ore e 24 ore per ciascuna femmina.
    2. Iniettare plasma seminale intramuscolare 48 ore dopo la dose finale di eCG.
    3. Riposare le femmine fino all'eutanasia.
    4. Eutanasiare gli animali 72 ore dopo l'iniezione seminale di plasma (vedi sezione 3).
      NOTA: Includere le femmine di controllo iniettate con soluzione salina invece del plasma seminale.

3. Anestesia, eutanasia e raccolta dell'apparato riproduttivo

NOTA: Utilizzare metodi di anestesia e eutanasia umana per ottenere tratti riproduttivi intatti per analisi di ovociti e istologiche.

  1. Indurre l'eutanasia tramite un'unica iniezione intramuscolare calcolata di 13,5 mg/kg di cloridrato di ketamina e 0,6 mg/kg cloridrato di xilazina somministrati secondo le raccomandazioni del produttore e i protocolli istituzionali stabiliti.
  2. Confermare l'anestesia profonda con l'assenza di risposta al dolore (riflessi pedali).
  3. Posiziona l'animale in posizione supina e sterilizza l'addome.
  4. Aprire chirurgicamente la cavità addominale per esporre completamente tutti gli organi addominali.
  5. Eseguire un'ispezione generale per determinare le condizioni generali dell'animale e confermare l'ovulazione naturale o indotta dagli ormoni con la presenza di stigmati ovulatori.
  6. Prelevare un campione di sangue tramite puntura diretta della vena cava superiore per l'analisi sierologica.
  7. Eseguire l'eutanasia sull'animale somministrando intracardico 0,5 mL/kg di pentobarbital sodico.
  8. Dissezionare e rimuovere con cura ovaie, ovidotti e corna uterine, facendo attenzione a non danneggiare le loro strutture.
  9. Conserva i tessuti in soluzione salina fosfatata (PBS) fredda fino alla lavorazione (≤15 min).

4. Recupero degli ovociti

NOTA: Recuperare gli ovociti dagli ovidotti e dalle corna uterine tramite un delicato lavaggio per garantire la completa raccolta dei gameti rilasciati minimizzando i danni ai tessuti.

  1. Prepara l'apparecchiatura di lavaggio attaccando un ago smussato da 26-G a una siringa da 1 mL riempita con NaCl allo 0,9% integrato con 4 mg/mL di BSA, 100 μg/mL di penicillina G e 100 IU/mL di estreptomicina.
  2. Inserisci delicatamente l'ago nell'infundibolo di ogni ovidotto e inietta lentamente la soluzione di lavaggio.
  3. Raccogliere l'effluente dall'ovidotto distale e dal corno uterino in piastre di Petri sterili.
  4. Ripeti il lavaggio finché il liquido recuperato non appare limpido e privo di ovociti visibili o detriti cellulari.
  5. Trasferire ovociti in gocce da 100 μL di mezzo M2 contenente 4 mg/mL di BSA e antibiotici sotto olio minerale.
  6. Confermare il recupero riuscito ispezionando le gocce al microscopio stereoscopico; Aspettati di osservare ovociti liberi privi di cellule cumulus dispersi all'interno del fluido.
  7. Continuare a lavare finché lo effluente non appare limpido e non si osservano ulteriori ovociti al microscopio stereoscopico (tipicamente 3-5 lavaggi per ovotto).
    NOTA: Gli ovociti recuperati dovrebbero apparire sferici e traslucidi a basso ingrandimento.
  8. Classificare gli ovociti in base all'integrità morfologica descritta nella sezione 6.

5. Valutazione morfologica degli oociti

NOTA: Valutare la qualità degli ovociti recuperati in base all'aspetto citoplasmatico, all'uniformità della zona pellucida e allo stadio di maturazione nucleare.

  1. Identificare gli ovociti come normali se presentano una forma sferica, una zona pellucida uniforme, un citoplasma traslucido omogeneo e una vescicola germinale visibile o un primo corpo polare.
  2. Identificare gli ovociti come anomali se il citoplasma appare scuro, granulare o frammentato, oppure se la zona pellucida è irregolare.
  3. Registra la fase di maturazione nucleare come vescicola germinale (GV), degradazione della vescicola germinale (GVBD) o metafase II (MII).

6. Valutazione della maturazione nucleare degli oociti e dell'integrità del fuso meiotico

NOTA: Valutare la maturazione nucleare e la morfologia del fuso tramite colorazione immunofluorescenza della α-tubulina e controcolorazione della cromatina.

  1. Fissare gli ovociti con paraformaldeide (PFA) al 2% per 20 minuti.
  2. Permeabilizza in Triton X-100 allo 0,2% in PBS per 40 minuti.
  3. Post-fissazione con PFA al 2% per 20 minuti e lava tre volte in PBS (30 min ciascuno).
  4. Bloccare con 2% di siero di capra, 2% BSA, 2% latte in polvere, 0,1 M glicina e 0,01% Triton X-100 in PBS per ≥ 1 ora.
  5. Incubare gli ovociti durante la notte a 4 °C con anticorpo anti-α-tubulina del topo (1:200).
  6. Lavare in PBS per 30 minuti e incubare per 1 ora al buio con IgG anti-topo coniugato con fluoresceina isotiocianato (FITC) (1/1000).
  7. Controcolorare con 10 μg/mL Hoechst 33324 per 10 minuti e lavare in PBS contenente il 2% di BSA.
  8. Montare ovociti in mezzo antifade e immagini utilizzando un microscopio confocale.
  9. Acquisizione e elaborazione delle immagini utilizzando il software EZ-C1 (EZ-C1 versione 3.90); Regolare contrasto e luminosità nei software di elaborazione immagini secondo necessità.
    NOTA: La colorazione riuscita è indicata da un chiaro schema di fluorescenza verde del fuso meiotico (FITC) e da controcolorazione nucleare blu con Hoechst 33324.

7. Analisi statistica

NOTA: Analizzare i dati quantitativi per confrontare le risposte ovulatorie e la qualità degli ovociti tra i gruppi sperimentali.

  1. Esprimi i dati come media ± SD.
  2. Usa il test t di Student per confronti tra due gruppi.
  3. Applica ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Bonferroni per confronti multipli.
  4. Consideriamo p < 0,05 statisticamente significativo.

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Risultati

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Ovulazione naturale

Dodici femmine su 27 (gruppo I) catturate tra fine febbraio e metà aprile, in coincidenza con la stagione primaria di accoppiamento, sono state osservate ovulanti, mentre durante la stagione secondaria (settembre/ottobre) (gruppo II), 10 femmine su 26 catturate hanno mostrato ovulazione. È stato osservato un tasso di successo comparabile di circa il 40% delle femmine ovulanti durante entrambi i periodi di cattura. Non è stato osservato alcun gonfiore della ...

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Discussione

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Il protocollo presentato qui per lo studio dell'ovulazione nelle pianure vizcacha fornisce un quadro riproducibile per valutare sia eventi ovulatori naturali che sperimentalmente indotti da nessuno. Un grande vantaggio di questo protocollo risiede nella sua capacità di quantificare e caratterizzare direttamente l'eccezionale numero di ovociti rilasciati dai vizracha delle pianure, una caratteristica senza eguali in altri modelli mammiferi. A differenza dei metodi indiretti basati su prof...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi che possa essere percepito come un pregiudizio sull'imparzialità della ricerca riportata.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dall'aiuto finanziario intramurale dell'Universidad Maimónides, Argentina, e dall'agenzia FONCYT-AMPCYT, Argentina (PICT-2018-04619, concesso a NPL). Gli autori sono particolarmente grati all'Autorità del Ministero dell'Agricoltura del Governo della Provincia di Buenos Aires, Argentina, per aver autorizzato la cattura degli animali; al personale della Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS, Provincia di Buenos Aires, Argentina) per il loro prezioso aiuto nella cattura e nella gestione degli animali; e al DVM Sergio Ferraris e al DVM Fernando Lange del CCV-Universidad Maimónides per il loro supporto durante l'anestesia e le procedure chirurgiche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adobe PhotoshopAdobe Systems Inc., USAN/AElaborazione immagini
Albumina Sirica Bovina (BSA)Sigma-Aldrich, USAA9647Utilizzato nel mezzo di scarico e nel tampone di blocco
Centrifuga (per la lavorazione dello sperma)Eppendorf, Germania5417RPreparazione seminale al plasma
Microscopio confocale (C1 Eclipse E800)Nikon Ltd., GiapponeN/AImaging degli ovociti
Elettro-eiaculatoreProgettato in laboratorio; adattato da mammiferi domestici per l'uso nei roditori caviomorfiN/ACollezione di sperma
Eutanilo (pentobarbital sodico, difenilidantoina sodica)Brouwer S.A., ArgentinaN/AEutanasia
IgG anti-topo con FITC coniugato (AP124F)Chemicon, USAAP124FAnticorpo secondario
Kit per la colorazione dell'ematossilina-eosinaSigma-Aldrich, USAVariIstologia
Hoechst 33324Thermo Fisher Scientific, USAH3570Colorazione nucleare
Cloridrato di ketaminaHolliday Scott S.A., ArgentinaN/AAnestesia
Cappa a flusso laminareThermo Scientific, USAN/AGestione asettica
Microscopio otticoOlympus, GiapponeBX51Istologia
Lutropina-V (pLH)Bioniche Animal Health Care, CanadaN/AInduzione ormonale
M2 mediaSigma-Aldrich, USAM7167Recupero degli ovociti
Olio mineraleSigma-Aldrich, USAM8410Coltura degli ovociti
Novormon 5000 (eCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AInduzione ormonale
Ovusyn (hCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AInduzione ormonale
Paraformaldeide (PFA, 2% e 4%)Sigma-Aldrich, USA158127Fissazione
Penicillina GSigma-Aldrich, USAP3032Antibiotici per i substrati
StereomicroscopioLeica Microsystems, GermaniaM80Identificazione degli ovociti
StreptomicinaGibco, Thermo Fisher Scientific, USA11860038Antibiotici per i substrati
Siringa con ago smussato (1 mL)BD in Scienze Biologiche, USA305219Lavaggio degli ovidotti/utero
Triton X-100Sigma-Aldrich, USAT8787Permeabilizzazione
Mezzo di montaggio VectaShieldVector Laboratories, USAH-1000Montaggio per fluorescenza
Cloridrato di xilazinaRichmond Laboratories, ArgentinaN/AAnestesia
XyleneSigma-Aldrich, USA534056Dewaxing delle sezioni di paraffina
Anticorpo monoclonale α-tubulina (anti-α-tubulina del muro, SC-5286 B7)Santa Cruz Biotechnology, USASC-5286 B7Per l'immunocolorazione del fuso meiotico

Riferimenti

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