Mappatura spaziale migliorata degli strati muscolari gastrici del topo utilizzando una tecnica modificata dello Swiss Roll

Summary

Questo protocollo delinea un metodo di immunocolorazione dell'intero stomaco modificato dalla tecnica "Swiss roll" originariamente sviluppata per l'intestino murino.

Abstract

Le tecnologie spaziali "omics" offrono opportunità senza precedenti per studiare la biologia e le interazioni delle singole cellule dell'apparato neuromuscolare gastrico nel loro ambiente tissutale nativo. Tuttavia, l'applicazione efficace di questi approcci e la valutazione delle differenze strutturali e molecolari tra il fondo di fondo, il corpus e l'antro richiedono campionamenti e orientamento dei tessuti coerenti. Qui riportiamo una tecnica modificata del "rotolo svizzero" adattata allo stomaco del topo, che permette di inserire e visualizzare tutte le principali regioni anatomiche in una singola criosezione. Questo approccio enfatizza la fissazione piatta e il posizionamento accurato per generare sezioni con orientamento e qualità riproducibili. Questo studio ha inoltre ottimizzato le condizioni di colorazione immunofluorescenza per garantire una visualizzazione di alta qualità dei marcatori cellulari. Questo protocollo consente confronti completi e affiancati delle regioni gastriche minimizzando la perdita tissutale e la variabilità sperimentale. Migliorando la conservazione dei tessuti e l'orientamento spaziale, questo metodo offre uno strumento pratico e scalabile per i ricercatori che studiano la biologia gastrica sia in contesti fisiologici che patologici.

Introduction

Lo stomaco è un complesso organo a forma di J che collega l'esofago al^{duodeno 1}. È suddiviso in tre principali regioni anatomiche: il fondo di fonto, il corpo e^{l'antro 1}. Ogni regione della tunica muscolare gastrica svolge un ruolo fisiologico distinto, contribuendo a funzioni gastriche chiave come l'accomodamento, la conformità, la triturazione alimentare e lo^{svuotamento 1,2}. Studiare i cambiamenti nella fisiologia e patologia gastrica richiede un'analisi dettagliata di queste regioni e della loro architettura cellulare.

Per visualizzare vaste aree di tessuto, i ricercatori spesso adottano la tecnica del "rotolo svizzero", originariamente sviluppata per l'intestino^murino 3,4,5,6. Questo studio ha modificato la tecnica dello Swiss roll per l'uso con lo stomaco murino per stabilire un nuovo protocollo. Lo stomaco viene prima separato nelle sue regioni anatomiche e fissato in un orientamento piatto. Il tessuto viene poi accuratamente arrotolato e processato per la criosezionazione. Un rotolo svizzero improprio può danneggiare strutture epiteliali fragili, in particolare nell'intestino, portando a una scarsa qualità dei tessuti per l'immunocolorazione. Preservare tessuti ben fissi e correttamente orientati con strutture cellulari intatte è essenziale per l'imaging ad alta risoluzione. Questo lavoro presenta un nuovo metodo per generare rotoli svizzeri che includono tutte le regioni gastriche all'interno di un singolo crioblocco. Inoltre, è stato descritto un protocollo ottimizzato di colorazione per immunofluorescenza per la tunica muscolare gastrica, consentendo una valutazione dettagliata della funzione gastrica. Questo protocollo fornisce una guida completa per ottenere immagini immunofluorescenze di alta qualità attraverso un'attenta preparazione del tessuto gastrico, la lavorazione dei rotoli svizzeri e la colorazione. Preservando la morfologia intricata, la tunica muscolare gastrica, questo metodo facilita una comprensione più profonda della sua struttura e funzione sia nella salute che nella malattia.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti seguendo le linee guida indicate nella Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute. I protocolli sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Mayo Clinic (A48315-15). I programmi e le strutture di cura e uso degli animali della Mayo Clinic sono stati esaminati e pienamente accreditati dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Tecnica del rotolo svizzero per criosezioni gastriche fissate con paraformaldeide (PFA)

1. Anestesiare un topo C57BL/6J (8-10 settimane) tramite inalazione di anidride carbonica (CO₂) per almeno 3 minuti, seguita da una lussazione cervicale per garantire l'eutanasia (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
2. Taglia l'esofago, il duodeno e la mesogastria ventrale e dorsale per rimuovere lo stomaco.
3. Posiziona lo stomaco in un piatto rivestito di silicone contenente soluzione salina fredda e tamponata con fosfato (PBS). Fissare l'esofago, il fondo di lavoro, il corpo e il duodeno per fungere da riferimenti di orientamento (Figura 1A). La direzione di taglio è indicata da una linea tratteggiata rossa nella Figura 1A.
4. Rimuovi con attenzione il grasso attaccato usando forbici a bastoncini e pinzep.
5. Taglia lungo il mesentere ventrale del duodeno e lo stomaco fino al perno al corpus, poi appiattisci delicatamente il tessuto (Figura 1B).
6. Usa una pipetta di trasferimento riempita di PBS per eliminare eventuali residui di cibo dal lumen gastrico.
7. Allunga delicatamente la pancia aperta per ottenere un'orientazione piatta (Figura 1C).
   ATTENZIONE: Evitare di sovrastendere (cioè più del 110% delle dimensioni originali) per preservare l'architettura tissutale.
8. Immergi lo stomaco in PFA freddo al 4% per 2 minuti per sistemare leggermente il tessuto e facilitare il rotolamento.
9. Fissa di nuovo il fazzoletto con i perni piatti dopo la breve fissazione.
10. Ritaglia la pancia lungo il contorno tratteggiato per creare una forma uniforme adatta all'arrotolamento (Figura 1C).
11. Posizionare il tessuto gastrico tagliato su carta filtrante inumidita con PBS (Figura 1D).
12. Arrotola il fazzoletto in una configurazione Swiss Roll e fissalo inserendo uno stuzzicadenti al centro.
    ATTENZIONE: Assicurati che il lato mucoso sia rivolto verso l'alto durante il processo di arrotolatura. Tieni l'estremità duodenale con una pinza in una mano mentre con l'altra guidi lo stuzzicadente, seguendo le piccole modifiche ai metodi pubblicati.
13. Una volta arrotolato, inserire un ago da 30 G per fissarne la forma e piegarlo a un angolo di 90° per stabilizzare lo stomaco arrotolato (Figura 1E).
14. Fissare il tessuto arrotolato al 4% di PFA a 4 °C per 6 ore.
15. Trasferire il tessuto fisso al 30% di saccarosio in PBS e incubare a 4 °C per 12-16 ore per la crioprotezione e la prevenzione della formazione di cristalli di ghiaccio.
16. Rimuovi delicatamente l'ago stabilizzante.
17. Immergere il tessuto in un composto a temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) utilizzando stampi di base usa e getta, poi congelare su ghiaccio secco (Figura 1F).
18. Una volta completamente congelato, conserva lo stampo a -80 °C.
    ATTENZIONE: Evita le bolle d'aria nell'O.C.T., soprattutto intorno al tessuto, poiché interferiscono con la sezione. I blocchi tissulari possono essere conservati a -80 °C per almeno un anno.
19. Prima di sezionare, bilanciare il blocco a -20 °C per almeno 1 ora.
20. Sezione del tessuto a uno spessore di 5 μm utilizzando un criostato.
    ATTENZIONE: Uno spessore di 5-12 μm è generalmente adatto per le sezioni gastriche^{murine 7,8} e può essere regolato in base alle esigenze sperimentali. Le sezioni possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 3 mesi.

2. Colorazione immunofluorescente del tessuto muscolare gastrico

1. Utilizzando una penna barriera idrofobica, disegna una barriera idrorepellente attorno a ogni sezione di tessuto sul vetrino del microscopio.
2. Lava le sezioni con PBS freddo per 5 minuti per sciogliere il residuo di composto O.C.T.
3. Bloccare il legame non specifico incubando le sezioni con albumina sierica bovina (BSA) al 1% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente (RT; 21-23 °C).
4. Rimuovere l'1% di BSA usando la suzione, poi lavare le sezioni tre volte con PBS freddo per 10 minuti ciascuna a RT (21-23 °C).
5. Blocca ulteriormente il legame aspecifico incubando le sezioni con una soluzione bloccante IgG topo su topo in PBS per 1 ora a RT (21-23 °C), riducendo così il legame dell'IgG endogena e migliorando la specificità nell'uso dell'anticorpi IgG del muro.
6. Rimuovere la soluzione bloccante usando aspirazione, poi lavare le sezioni tre volte con PBS freddo per 10 minuti ciascuna a RT (21-23 °C).
7. Ripeti il blocco BSA per 1 ora a RT (21-23 °C).
8. Incubare le sezioni con anticorpi primari. Annoctamina-1 (ANO1), KIT, beta-tubulina classe III (TUBB3) diluita in BSA freddo all'1% con 0,3% di Triton X-100. In un esperimento separato, utilizzare catena pesante di miosina 11 (MYH11), E-cadherin e KIT. Incubare durante la notte (12-16 ore) a 4 °C.
9. Rimuovi la soluzione primaria di anticorpi usando una dolce aspirazione. Lava le sezioni con PBS freddo tre volte per 10 minuti ciascuna a RT (21-23 °C).
10. Incubare le sezioni con anticorpi secondari. Alexa Fluor (AF) 488 anti-coniglio IgG, AF555 anti-topo IgG e AF647 anti-capra IgG (tutte a 5 μg/mL; 1:400) in 1% di BSA per 1 ora a RT (21-23 °C).
11. Rimuovere la soluzione secondaria di anticorpi tramite aspirazione, poi lavare le sezioni tre volte con PBS freddo per 10 minuti ciascuna a RT (21-23 °C).
12. Tingere le sezioni con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, a diluizione 1:300) per 1 ora a RT (21°-23 °C).
    ATTENZIONE: I nuclei neuronali mostrano tipicamente segnali DAPI più deboli rispetto ad altri tipi di cellule gastrointestinali; Si raccomanda un'incubazione minima di 1 ora per una visualizzazione ottimale.
13. Risciacquo le sezioni una volta con acqua ultrapura per rimuovere i sali residui.
14. Monta le slitte usando il montante Antifade.
15. Sigilla gli angoli della copertura con smalto per unghie non fluorescente. Rimuovi eventuali mezzi di montaggio in eccesso usando una dolce aspirazione. Poi, sigilla l'intero perimetro della copertura.

3. Imaging a immunofluorescenza utilizzando un microscopio confocale

1. Configurare l'acquisizione dello stack Z multicanale nel software di imaging confocale configurando laser e rivelatori per DAPI, AF488, AF555 e AF647, garantendo la separazione spettrale ed evitando la saturazione del segnale.
   ATTENZIONE: Regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione individualmente per ogni fluoroforio per prevenire la diafonia e mantenere il segnale all'interno della gamma dinamica su tutti i canali (Figura 2A).
2. Imposta i parametri di esposizione nel software di imaging confocale per evitare la saturazione dei pixel e preservare il dettaglio del segnale nelle regioni ad alta intensità (Figura 2B).
   ATTENZIONE: Assicurarsi che i segnali in tutti i canali rimangano all'interno della gamma dinamica e non raggiungano la saturazione.
3. Per catturare l'intero rotolo svizzero gastrico, si utilizza una grande impostazione di acquisizione dell'immagine (ad esempio, 6 × 6 campi) (Figura 2C); tuttavia, questa impostazione dovrebbe essere regolata in base alla dimensione complessiva e alla rigidità del tessuto arrotolato.
4. Acquisire immagini 3D utilizzando l'acquisizione della serie Z nel software di imaging confocale. Il flusso di lavoro dettagliato per l'acquisizione N-dimensionale (ND) è illustrato nella Figura 2D.
5. Seleziona l'opzione Z-stack per abilitare l'imaging Z-series.
6. Definisci l'intervallo Z impostando le posizioni focali superiore e inferiore che comprendono tutto lo spessore dell'intero stomaco.
7. Metti a fuoco la parte superiore dello stomaco e clicca sul pulsante Alto per impostare il limite superiore Z.
8. Regola la messa a fuoco verso la parte inferiore del muscolo gastrico e clicca sul pulsante Bottom per impostare il limite Z inferiore.
9. Imposta il numero di passi del Z-stack a 8 per coprire tutta la profondità del muscolo gastrico.
10. Clicca su Esegui ora per avviare l'acquisizione dell'immagine Z-stack.
11. Genera proiezioni di massima intensità per canali di fluorescenza individuali e fusi per visualizzare dati tridimensionali in un'immagine bidimensionale.

Results

Utilizzando il nuovo metodo, i rotoli svizzeri gastrici murini includevano tutte e tre le principali regioni dello stomaco: fundus, corpus e antro, insieme a una piccola porzione dell'esofago e del duodeno in un'unica sezione. Includere l'intero stomaco in un'unica sezione consente un'analisi regionale completa (Figura 1). La colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) di immagini intere dei rotoli svizzeri dello stomaco ha dimostrato un'architettura gastrica ben conservata in tutte le regioni, permettendo una chiara visualizzazione degli strati mucosale, submucosale e muscolare (Figura 3). La Figura 4 mostra una colorazione immunofluorescente rappresentativa delle cellule interstiziali di Cajal (ICC; cellule pacemaker che generano onde lente ritmiche alla base della motilità intestinale fasica; identificate da KIT e ANO1), neuroni enteici (neuroni del sistema nervoso enterico che coordinano la motilità gastrointestinale; identificati tramite immunocolorazione TUBB3) e nuclei (DAPI). Nella mucosa gastrica, la KIT è anche espressa nelle cellule Paneth e goblet, come precedentemente^{riportato 9,10,11}. ANO1 è inoltre fortemente espresso nell'epitelio gastrico, in particolare nelle cellule epiteliali colonnari del fondo di terra, coerente con il suo ruolo nel trasporto del cloruro e nella secrezione^{mucosa 11}. Inoltre, TUBB3 è espresso in alcune cellule endocrine gastriche e cellule secretrici di muco, secondo i dati dell'Human Protein^{Atlas 12,13}. La Figura 5 mostra una colorazione immunofluorescente rappresentativa delle cellule muscolari lisce marcate da MYH11, delle cellule epiteliali della mucosa gastrica marcate da E-cadherin e ICC marcate da KIT. MYH11 è espressa anche in miofibroblasti nella mucosa gastrica, come riportato in^{precedenza in 14}. Insieme, questi risultati di immunofluorescenza confermano che il nostro protocollo preserva l'architettura tissutale.

Figura 1: Preparazione del "rotolo svizzero" dello stomaco del topo per la criosezionazione. (A) Subito dopo la rimozione tutto lo stomaco viene posto in una ciotola di dissezione rivestita di silicone nero, riempita con soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) per preservare l'integrità dei tessuti. (B) Lo stomaco si apre lungo il punto medio del duodeno. (C) Lo stomaco viene delicatamente allungato e bloccato nel piatto per rimanere piatto senza applicare una tensione eccessiva. Una linea tratteggiata rossa è delineata lungo il fazzoletto per indicare dove deve essere tagliata e facilitare il rotolamento. (D) Lo stomaco aperto e fisso viene posizionato su carta filtrante inumidita con PBS in preparazione all'arrotolamento in una configurazione compatta. La freccia rossa indica la direzione del movimento dello stomaco. (E) I pezzi di tessuto vengono incorporati in un composto a temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) e congelati su ghiaccio secco in preparazione alla criosezionazione. (F) I blocchi congelati vengono conservati a −80 °C e criosezionati a 5 μm di spessore per l'analisi a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione dell'acquisizione ND e visualizzazione della saturazione durante l'imaging Z-stack. (A) Impostazioni del laser e del rivelatore configurate nel software di imaging confocale per l'imaging spettrale multicanale. Sono utilizzati quattro fluorofori: 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) e Alexa Fluor 647 (AF647), ciascuno abbinato a laser di eccitazione e rivelatori di emissione corrispondenti. Il grafico spettrale mostra le curve di eccitazione ed emissione, permettendo di aggiustare per minimizzare la diafonia e ottimizzare il rilevamento del segnale. (B) Le impostazioni di esposizione vengono regolate individualmente per ciascun fluoroferano per evitare la saturazione dei pixel e preservare i dettagli nelle regioni ad alta intensità. (C) Ampia impostazione per acquisizione dell'immagine (ad esempio, 6 × 6 campi) consente la visualizzazione dell'intero rotolo svizzero gastrico; La dimensione del campo dell'immagine deve essere regolata in base alla dimensione e alla compattezza del tessuto arrotolato. (D) Finestra di acquisizione ND che mostra le impostazioni dei parametri dello stack Z. L'intervallo Z è definito selezionando le posizioni superiore e inferiore del muscolo gastrico, con otto passaggi configurati per catturare l'intera profondità del tessuto per un'analisi tridimensionale (3D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine di un rotolo svizzero di topo con ematossilina ed eosina colorato con ematossilina ed eosina. La scansione delle piastrelle dimostra la capacità di visualizzare l'intero rotolo svizzero gastrico di una femmina di 8 settimane di topo C57BL/6J. Sono indicate le principali regioni anatomiche, tra cui l'esofago (linea tratteggiata rossa), lo sfintere esofageo inferiore (linea tratteggiata viola), il fondo di fondo (linea tratteggiata nera), il corpo (linea tratteggiata blu), l'antro (linea tratteggiata verde) e il duodeno (linea tratteggiata arancione). Barra della scala: 1000 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini confocali di un rotolo svizzero di un intero stomaco murino: ANO1, KIT, TUBB3. Pannelli superiori: Immagini rappresentative confocali cucite di un rotolo svizzero gastrico di una femmina di 8 settimane di topo C57BL/6J, che mostrano immunocolorazione per ANO1 (verde), KIT (ciano), TUBB3 (giallo) e nuclei (blu). Viene visualizzato l'intero stomaco piegato, inclusi fondo di fondo, corpus e antrum. Barre di scala: 1000 μm. Pannelli inferiori: Vedute ingrandite della regione delimitata dalla casella tratteggiata bianca nei pannelli superiori, che evidenziano i dettagli cellulari delle cellule interstiziali di Cajal (ANO1⁺ e ^KIT+; frecce gialle) e dei neuroni enteici (TUBB3⁺; frecce rosse). Barre di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini confocali di un rotolo svizzero di uno stomaco murino intero: MYH11, KIT, E-cadherin. Pannelli superiori: Immagini confocali cucite rappresentative di un rotolo svizzero gastrico di una topo femmina C57BL/6J di 8 settimane, che mostrano immunocolorazione per MYH11 (verde), KIT (ciano), E-cadherin (giallo) e nuclei (blu). Viene visualizzato l'intero stomaco piegato, inclusi fondo di fondo, corpus e antrum. Barre di scala: 1000 μm. Pannelli inferiori: Viste ingrandite della regione delimitate dalla scatola bianca tratteggiata nei pannelli superiori. Linee bianche tratteggiate delimitano l'epitelio mucoso (E-cadherina) e lo strato muscolare (MYH11). Le frecce bianche indicano le cellule interstiziali ^KIT+ del Cajal (ICC). Barre di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Utilizzando il nuovo metodo Swiss-roll gastrico ottimizzato, tutti e tre i segmenti dello stomaco (fondo di parola, corpus e antro), insieme all'esofago e al duodeno, sono inclusi su un singolo vetrino. Questa immersione completa permette ai ricercatori di analizzare i cambiamenti strutturali e molecolari in tutto lo stomaco e riduce i costi di sezionamento e colorazione dei reagenti (Figura 1).

Esporre tutte le regioni gastriche alle stesse soluzioni di colorazione simultaneamente durante l'immunocolorazione garantisce coerenza e migliora la precisione. L'immunocolorazione dei rotoli svizzeri gastrici rivela chiaramente gli strati distinti della parete gastrica. Come mostrato nelle Figure 4 e 5, questo metodo consente la visualizzazione delle differenze morfologiche tra i segmenti gastrici e consente la rilevazione di ICC (KIT e ANO1)¹⁰, neuroni (TUBB3)¹⁵, cellule muscolari lisce (MYH11), cellule epiteliali mucose (E-cadherina) e nuclei.

Possono essere apportate modifiche minori a seconda delle condizioni tissutali e dello scopo della ricerca. Ad esempio, rimuovere il grasso attaccato in eccesso può aiutare a mantenere la forma del rotolo durante la fissazione. Regolare lo spessore della sezione può anche aiutare a preservare la struttura del tessuto o migliorare l'adesione al vetrino. Un altro potenziale raffinamento prevede l'uso di uno stampo metallico per un taglio più uniforme, come avviene con gli Intestinal Swiss^{Rolls 16}. Sebbene questo protocollo si concentri sulle criosezioni, può essere adattato ai tessuti incorporati nella paraffina. Mentre l'immersione della paraffina preserva l'integrità strutturale del tessuto, la criosezionazione permette un processo più rapido e una migliore conservazione dell'antigene, rendendola più adatta all'immunofluorescenza.

Questo metodo ha delle limitazioni. Uno stomaco ingrossato, fibrotico o calcificato, comunemente riscontrato in condizioni come infiammazione, obesità, diabete o invecchiamento, può essere più difficile da rollare e può rappresentare difficoltà per una colorazione^ottimale 17,18,19,20. Nonostante questa limitazione, questa tecnica offre grandi vantaggi rispetto all'embedding tradizionale specifico per regione. Elaborare tutte le regioni gastriche in condizioni identiche migliora la coerenza, riduce la variabilità e conserva sia tempo che reagenti.

Questo approccio è particolarmente utile per studi sui cambiamenti specifici per regione. Supporta inoltre l'analisi spaziale di più tipi di cellule e può essere abbinato alla quantificazione basata su immagini. Nel complesso, questo nuovo metodo Swiss-roll gastrico ottimizzato offre una piattaforma pratica e scalabile per un'analisi completa del tessuto gastrico in ambito sanitario e patologico.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5SF Pinza	STRUMENTI SCIENTIFICI DI FINE QUALITÀ	11252-00
albumina sierica bovina	SIGMA-ALDRICH	A7906
Sorgente luminosa LED ColdVision MC-LS	SCHOTT	MC-LS
Software Confocal	Nikon	Nikon NIS-Elements Imaging Software
Cryoseal XYL	Epredida	9312-4
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dilattato)	Thermo Fisher Scientific	D3571
Vasi per la dissezione, grandi	Sistemi Viventi   Strumentazione	SKU: DD-90
Anti-capra per asini AF647 pAb	Life Technologies	A21447	Lot: 1739289 RRID:AB_2535864
Anti-topo Donkey AF555 pAb	Life Technologies	A31570	Lotto: 1774719 RRID:AB_2536180
Anti-coniglio per asini AF488 pAb	Life Technologies	A21206	Lot: 2668665 RRID:AB_2535792
E-cadharina (diluizione 1:400)	BD in Biologia	610181	lotto: 25510 RRID:AB_397580
Eosina	ELITechGroup	$SS-071C
Pinze rivestite in epossidica	STRUMENTI SCIENTIFICI DI FINE QUALITÀ	11210-10
Etanolo	SIGMA-ALDRICH	459828-4L
TUBO FLESSIBILE 1,5 mL	Eppendorf	22364111
Spugne di garza	Fisherscientific	22-362-178
Forbici Fine Indurite	STRUMENTI SCIENTIFICI DI FINE QUALITÀ	14090-09
Ematossilina	Epredia	7211
KIT (0.2 & micro; g/mL; diluizione 1:1000)	R& Sistemi D	AF1356	Lotto: IEO0217101 RRID: AB_354750
SPRAY SPRAY SPRAY SOLUZIONE PER LA PULIZIA DELLE LENTI DA 1OZ	Nikon	77013066
Vetro di copertura per microscopio	Fisher Scientific	12541016
Vetri per microscopio	CardinalHealth	M6133A
Puntini Minutien	STRUMENTI SCIENTIFICI DI FINE QUALITÀ	26002-20
MYH11 (diluizione 1:400)	Tecnologie biomediche	BT-562	RRID:AB_10013421
Smalto per unghie	COLORI PECCAMINOSI	7.33855E+11
Ago 30 G x 1/2 in.	BD in Biologia	305106
Paraformaldeide	SIGMA-ALDRICH	158127-500G
Lame a filo singolo Personna	La Scaror Blade Co.	76247-652
Soluzione di blocco IgG per mouse ReadyProbes (30x)	Thermo Fisher Scientific	R37621	Lot: 3226230
Montante antifade SlowFade Diamond (Supporto di montaggio)	Thermo Fisher Scientific	S36972
Sistema di colorazione StainTray a 10 venature	Simport Scientific	M918-2
Microscopio stereo 0,8x-5x	Nikon	SMZ645
Sucrosio	SIGMA-ALDRICH	S9378-1KG
Surface-Amps X-100 (Triton X)	Thermo Fisher Scientific	28314
TMEM16A (ANO1: diluizione 1:400)	Abcam	ab53212	Lotto: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Pipetta di trasferimento	Falcon	357575
TUBB3 (diluizione 1:400)	Tecnologia di segnalazione cellulare	4466	Lotto: 5 RRID: AB_1904176
Xileni	Fisher Scientific	X3P-1GAL	MOLTO 206238