Generare visualizzazioni spaziali 3D interattive dell'abbondanza microbica nella lettiera avicola utilizzando RStudio

Summary

Qui presentiamo un protocollo per generare una visualizzazione tridimensionale interattiva dei conteggi microbici e del pH su un recinto avicola utilizzando dati di campionamento basati su griglia.

Abstract

Le valutazioni tradizionali della microbiologia e della composizione fisicochimica delle lettiera avicole spesso si basano su tabelle statiche o visualizzazioni bidimensionali che potrebbero non catturare l'eterogeneità spaziale all'interno dell'ambiente del recinto. Questo protocollo descrive visualizzazioni tridimensionali interattive (3D) che integrano dati di enumerazione microbica e parametri ambientali in un recinto avicolo. È stato utilizzato un layout a griglia per approssimare il campionamento della penna, e sono stati generati per primi dataset simulati per dimostrare il flusso di lavoro. Il dataset sperimentale è stato utilizzato per valutare gradienti spaziali rispetto alle caratteristiche ambientali, inclusi la linea dell'acqua, le mangiatoie e l'ingresso del recinto. I dati venivano elaborati in RStudio usando plotly per generare grafici 3D interattivi. I carichi batterici aerobici variavano da 5,9 a 8,6 log₁₀ CFU/g, con un'abbondanza significativamente maggiore vicino alla linea dell'acqua (P = 0,023) e conteggi più bassi con l'aumentare della distanza dalla caratteristica. I grafici superficiali risultanti hanno evidenziato visivamente il raggruppamento delle popolazioni microbiche attorno ad aree ricche di umidità e hanno dimostrato l'utilità del quadro per interpretare i modelli spaziali delle comunità microbiche nella lettiera avicola. Sebbene sia necessaria un'ulteriore valutazione in condizioni avicole commerciali, l'attuale protocollo fornisce un metodo riproducibile per visualizzare e analizzare l'eterogeneità spaziale nei dataset di lettiera avicole.

Introduction

L'industria avicola include sistemi di produzione di ovaiole e polli da carne, ognuno dei quali genera notevoli quantità di lettiera avicola attraverso l'accumulo di materiale per la lettiera, escrementi, particelle per mangime, piume, gusci d'uovo rotti e umidità nel^{tempo 1,2,3}. Questa cucciolata può sostenere varie popolazioni microbiche, provenienti da uccelli, insetti, roditori e^{aerosol 2,3}. Alcuni dei microrganismi possono includere patogeni, come la Salmonella, che possono causare malattie negli uccelli e rappresentare un problema di salute^{pubblica 2}. Poiché la lettiera avicola può essere applicata a terra come^{fertilizzante 4,5}, comprendere la distribuzione microbica ha implicazioni per il monitoraggio ambientale, la salute dello stormo e la sicurezza alimentare.

Un campionamento rappresentativo delle lettiera avicola è quindi importante per caratterizzare le comunità microbiche e rilevare potenziali patogeni. Da diversi decenni sono stati esplorati approcci per il campionamento della lettiera avicola, tra cui tamponi trascinati, raccolta di escrementi fecali, raccolta diretta della lettiera, copriscarpe usa e getta o calzini^{per stivali 6,7}. Tuttavia, la posizione della raccolta del campione determina fortemente quanto bene i dati rappresentino le condizioni complessive della lettiera avicola. Poiché gli uccelli si muovono in tutta la casa e le caratteristiche ambientali come abbeveratori, mangiatoie, ventole e cuscinetti di raffreddamento o riscaldamento creano ambienti localizzati, le popolazioni microbiche della lettiera avicola e i fattori nutritivi non sono distribuiti^{uniformemente} 3,8,9,10. Pertanto, tenere conto dell'eterogeneità nell'interpretazione dei dati associati alla cucciolata è fondamentale per una gestione efficace e il mantenimento della salute dello stormo.

Gli approcci di mappatura spaziale sono stati ampiamente applicati in agronomia e scienze del suolo per visualizzare l'eterogeneità microbica e fisicochimica e i punti caldi^{localizzati 11,12}. Tuttavia, quando i dati sulle lettiere avicole vengono raccolti in più aree all'interno di un recinto, le tendenze spaziali possono essere difficili da interpretare dai valori^{numerici 8,9}. La visualizzazione tridimensionale (3D) offre un approccio pratico per integrare misurazioni microbiche e fisicochimiche con coordinate spaziali per generare modelli interattivi di superficie^13,14. Rispetto ai modelli statici 2D, i modelli 3D permettono rotazione, zoom in e out e visualizzazione in profondità dei gradienti lungo la griglia di campionamento, il che può migliorare l'interpretazione dei pattern spaziali all'interno dell'ambiente dell'allevamento avico.

L'attuale protocollo descrive un approccio strutturato e riproducibile per generare visualizzazioni 3D interattive di dati microbici e fisicochimici delle cucciolieri di pollame, raccolti utilizzando una disposizione a griglia e analizzati in RStudio. I dati microbici e fisicochimici simulati vengono inizialmente utilizzati per dimostrare il flusso di lavoro di visualizzazione, seguiti dall'applicazione dell'approccio al conteggio sperimentale dei microbi delle lettiera avicole. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un quadro riproducibile per visualizzare l'eterogeneità spaziale nei dataset delle lettiera avicole e supportare l'interpretazione dei modelli di distribuzione microbica in relazione alle caratteristiche degli ostali avicoli.

Protocol

Questo protocollo utilizza un dataset simulato per i valori microbici e del pH per dimostrare ogni fase del flusso di lavoro di visualizzazione, seguito dall'applicazione ai conteggi microbici sperimentali delle cucciolate avicole per illustrare l'uso con dati sperimentali e supportare l'interpretazione statistica delle associazioni microbiche correlate a distanza. Non sono state eseguite procedure sugli animali vivi. I campioni di lettiera sono stati raccolti da un recinto per pollame senza contatto diretto con gli animali. Non era quindi richiesta l'approvazione istituzionale per la cura degli animali.

1. Raccogliere campioni di lettiera avicola e generare dati sull'abbondanza microbica

1. Stabilisci una disposizione a griglia per campionare nel recinto da grill usando una distanza costante lungo il recinto.
   NOTA: Nei penni più piccoli, questo può essere fatto utilizzando un sistema a griglia di stringhe, mentre i pennetti più grandi possono usare marcatori per segnare ogni punto di campionamento. La griglia inizia tipicamente nell'angolo in basso a sinistra della penna, che viene trattato come punto di partenza. Ogni posizione di campionamento viene registrata utilizzando la sua posizione in griglia.
2. Registra le coordinate X e Y di ogni luogo di campionamento e punti ambientali come alimentatori, linea d'acqua, lampada riscaldante e ingresso all'interno della stessa griglia usando una singola posizione o una linea che rappresenti la loro posizione.
   NOTA: La direzione X corre lungo la lunghezza della penna, e la direzione Y attraversa la larghezza.
3. Includere una colonna "Pen" nel dataset per identificare la penna o il gruppo di trattamento per ogni luogo di campionamento (ad esempio, "P1", "P2").
   NOTA: Il raggruppamento per penna garantisce che le analisi spaziali vengano effettuate all'interno dell'ambiente abitativo corretto. Per questa dimostrazione, è stata definita una griglia strutturata 6 × 10 lungo l'impronta della penna, ottenendo 60 posizioni di campionamento (n = 60) da 1 penna. La griglia 6 × 10 è stata scelta per garantire una copertura spaziale uniforme lungo tutta la penna, con una disposizione simmetrica e equamente distanziata. Un esempio della disposizione a griglia è mostrato nella Figura 1.
4. In ogni punto di campionamento, prelevare tre campioni di lattiera per analisi microbica o fisicochimica. Per i test microbici, pesa 10 g di lettiera per ogni replica e mettila in 90 mL di acqua peptonica sterile tamponata per ottenere la prima diluizione (10⁻¹). Mescola il campione accuratamente per omogeneizzare la sospensione.
5. Prepara diluizioni seriali di 10 volte del campione di lettiera mista e stampa 0,1 mL di ciascuna diluizione su piastre di agar.
   NOTA: Possono essere utilizzati diversi mezzi a seconda del gruppo di batteri misurati. Ad esempio, i batteri aerobici possono essere placcati su agar di soia triptico (TSA), batteri lattici su agar MRS ed Enterobacteriaceae su agar MacConkey.
6. Incubare le placche a 37 °C per 24 ore, poi contare le colonie visibili. Calcola l'abbondanza microbica come unità formative di colonie per grammo di lettiera (CFU/g) utilizzando:
   CFU/g = (colonie conteggiate × fattore di diluizione) ÷ volume impiacciato
7. Segnala il valore medio tra repliche.
   NOTA: Il limite di rilevamento è determinato dal volume placcato (0,1 mL), corrispondente a circa 10 CFU/mL nella sospensione placcata, o 100 CFU/g di lettiera nel campione originale.
8. Registra i risultati dell'enumerazione microbica in un foglio di calcolo in formato numerico per l'analisi statistica e la visualizzazione successive.
9. Crea un file CSV con le seguenti colonne: ID campione, X (coordinate spaziali), Y (coordinate spaziali), Xnum (ordine numerico per X, opzionale) e conteggi microbici o parametri fisicochimici come il pH. Un esempio del foglio simulato è mostrato nella Figura 2.
10. Generare valori simulati di abbondanza microbica usando valori casuali normalmente distribuiti. Definisci la media, la deviazione standard e l'intervallo basandoti su misurazioni empiriche. Applica un seed casuale fisso per garantirne la riproducibilità. Introdurre gradienti spaziali lungo la griglia e aggiungere piccole variazioni casuali per evitare schemi uniformi.
    NOTA: I parametri di simulazione utilizzati per la generazione dei dati, inclusi tipo di distribuzione, distanza e struttura spaziale, sono riassunti nella Tabella 1.

2. Impostare l'ambiente informatico

1. Installa e carica i necessari pacchetti di calcolo statistico.
   install.packages(c("plotly"))
   Biblioteca (trama)
2. Importare il set di dati CSV nell'ambiente di calcolo e impostare una directory funzionante.
   setwd("percorso/a/tuo/cartella")
   dataset <- read.csv("path_to_your_file.csv")
   NOTA: Il dataset di input dovrebbe essere organizzato in formato foglio di calcolo (file CSV), con ogni riga che rappresenta una singola posizione di campionamento. La struttura dati di input richiesta e le definizioni delle variabili sono riassunte nella Tabella 2.

3. Preparare e formattare i dati

1. Controlla il file CSV per valori di dati mancanti o incoerenti.
   Sommario(dataset)
   any(is.na(dataset))
2. Pulire il dataset quando necessario rimuovendo i valori 'NA'.
   dataset <- na.omit(dataset)
3. Per normalizzare e migliorare la visualizzazione dei grafici, trasformare logaritmicamente i conteggi microbici.
4. Standardizzare i nomi delle variabili utilizzando notazioni coerenti basate su sottolinee (ad esempio, log10_CFU_A e log10_CFU_B) per migliorare la leggibilità e la riproducibilità.
5. Applicare la trasformazione log10 ai dati di conteggio microbico per stabilizzare la varianza e allinearsi alle pratiche standard di reporting delle CFU.
   dataset$Log10_CFU_A <- log10(dataset$OrganismA_counts + 1)
   dataset$Log10_CFU_B <- log10(dataset$OrganismB_counts + 1)
6. Assicurarsi che i valori delle coordinate X e Y siano numerici. Se i dati sono alfabetici, converti in valori numerici per corrispondere accuratamente alle posizioni di campionamento sulla griglia.
   NOTA: Il dataset finale dovrebbe includere tutti gli identificatori unici all'interno del sistema di coordinate penna, coordinate spaziali numeriche e conteggi microbici trasformati in log.

4. Generare visualizzazioni 3D interattive

1. Prima di costruire la matrice spaziale, verifica la struttura del dataset per assicurarti che la griglia possa essere generata correttamente. Successivamente, prepara le matrici di dati spaziali combinando più parti, come coordinate spaziali e conteggi batterici trasformati in log, per adattarle alla disposizione della griglia della penna.
   NOTA: Il codice raggruppa le osservazioni per Pen, X e Y, calcola la Log10_CFU_A media in ogni punto della griglia e poi rimodella i valori in una matrice basata sulle coordinate uniche X e Y nel dataset.
   org1_means <- aggregato(Log10_CFU_A ~ Pen + Y + X,
   dati = dataset,
   DIVERTENTE = significa,
   na.rm = VERO)
   org1_P1 <- sottoinsieme(org1_means, Pen == "P1")
2. Ordina i punti in modo che la matrice si mappe correttamente
   x_vals <- sort(unique(org1_P1$X))
   y_vals <- sort(unique(org1_P1$Y))
   ncol_grid <- lunghezza(x_vals)
   nrow_grid <- lunghezza(y_vals)
   org1_mat_P1 <- matrice (org1_P1$Log10_CFU_A,
   nrow = nrow_grid,
   ncol = ncol_grid,
   byrow = FALSO)
3. Assicurati che non manchino valori per un grafico dall'aspetto fluido.
   for(i in 1:ncol(org1_mat_P1)) {
   org1_mat_P1[is.na(org1_mat_P1[,i]), i] <- significano(org1_mat_P1[,i], na.rm=VERO)
   }
4. Visualizza i conteggi microbici spazialmente come 3D.
   NOTA: Per questo grafico, la dimensione della griglia rifletteva la disposizione spaziale del dataset
   figA <- plot_ly(
   x = x_vals,
   y = y_vals,
   z = org1_mat_P1,
   Tipo = "superficie", Scala colore = lista(
   c(0, "blu scuro"),
   c(1, "verde")
   )
   )
5. Aggiungi elementi ambientali, come una linea d'acqua, per aiutare a visualizzare la distanza dei conteggi microbici o di altri parametri dei rifiuti fino a quel punto, permettendo agli utenti di vedere i modelli spaziali.
   figA <- figA %>%
   add_trace(
   x = c(1, 5),
   y = c(6, 6),
   z = c(8,5, 8,5),
   Tipo = "scatter3d",
   modalità = "linee",
   linea = lista(colore(colore = "#1f77b4", larghezza = 8),
   nome = "Linea d'acqua"
   ) %>%
   add_text(
   x = 3, y = 6, z = 8.6,
   testo = "Linea d'acqua",
   textfont = lista(dimensione = 14, colore = "blu scuro"),
   showlegend = FALSO
   ) %>%
   Layout(
   title = "Organismo simulato A",
   scena = lista(
   xaxis = lista(titolo = "Coordinate X", tickvals = x_vals),
   yaxis = lista(titolo = "Coordinata Y", tickvals = y_vals),
   zaxis = lista(titolo = "log10 CFU")
   )
   )
   figA
6. Consulta il File Supplementare 1 per il codice utilizzato per visualizzare i livelli di pH all'interno del recinto avicolo.

5. Applicazione del modello 3D ai conteggi microbici sperimentali delle lettiera avicole

1. Raccogliere campioni di lettiera avicola da una disposizione a griglia definita all'interno del recinto e registrare le posizioni di campionamento utilizzando coordinate spaziali.
   NOTA: In questo studio, i campioni sono stati raccolti da un recinto per pollame presso l'Università del Wisconsin, Madison, WI, utilizzando una disposizione a griglia definita. I campioni sono stati raccolti utilizzando una griglia di 5 × 7 m.
2. Pesare una quantità definita di lettiere da ciascuna posizione di campionamento e sospespirla in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o diluente equivalente per preparare una diluizione iniziale.
   NOTA: In questo studio, 1 g di letto per luogo è stato raccolto utilizzando sacchetti Whirl-Pak e diluito 1:10 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Effettuare l'enumerazione microbica impiegando campioni di lettiera su un terreno di crescita appropriato e incubandoli in condizioni adeguate.
   NOTA: In questo studio, i campioni sono stati impiattati in duplicato utilizzando un metodo di placcatura a punti su agar di soia triptico (TSA) e incubati a 37 °C per 24 ore. I materiali necessari per l'enumerazione microbica sono elencati nella Tabella dei Materiali.
4. Quantificare l'abbondanza microbica come unità formative di colonie (CFU) e applicare la trasformazione log₁₀ ai dati per l'analisi.
5. Integrare i dati microbici processati nel flusso di lavoro computazionale e formattarli secondo la struttura di input richiesta.
6. Genera una visualizzazione spaziale 3D utilizzando i metodi sopra descritti per rappresentare l'abbondanza microbica attraverso la penna.
   NOTA: In questo studio, la visualizzazione è stata generata per rappresentare l'abbondanza batterica aerobica nel recinto campionato.

6. Analisi statistica

1. Eseguire analisi statistiche di base per riassumere i modelli spaziali nell'abbondanza microbica e nelle variabili ambientali.
2. Effettuare analisi statistiche solo sul dataset sperimentale delle lettiere avicole. Utilizzare i dataset simulati esclusivamente per dimostrazioni di visualizzazione e non includerli nei test statistici.
3. Calcolare i valori medi per ogni posizione della griglia quando erano disponibili misurazioni replicate.
4. Utilizzare l'analisi di regressione lineare per valutare le relazioni tra abbondanza microbica e distanza dai punti di riferimento ambientali.
5. Calcola le distanze dai punti di riferimento ambientali usando le loro posizioni note sulla griglia all'interno del recinto. Considera le distanze come variabili continue.
6. Utilizzare i risultati per esplorare tendenze spaziali e supportare l'interpretazione della visualizzazione piuttosto che per stabilire relazioni biologiche causali.

Results

Dati microbici e fisicochimici simulati per illustrare il modello 3D
L'attuale studio fornisce un codice per visualizzare l'abbondanza di organismi microbici (Organismo A e Organismo B) e il pH della lettiera all'interno di un recinto avicolo, basandosi su dati simulati. I grafici 3D risultanti hanno visualizzato i conteggi microbici (Figura 3A,B) e il pH (Figura 3C; per l'esperienza interattiva, vedi Supplementary File 3) basati sul modello a griglia. I valori simulati del pH mostravano variazioni spaziali attraverso la penna, con variazioni graduali lungo la griglia che corrispondevano ai gradienti spaziali imposti. Il codice completo, privo di interruzioni testuali, è disponibile nel Supplementary File 1.

Applicazione del modello 3D ai conteggi microbici sperimentali delle lettiera avicole
Per dimostrare come il modello funziona con dati ecologici reali, sono stati mappati e analizzati statisticamente i conteggi batterici aerobici provenienti da lettiera avicola per valutare l'effetto della distanza dai punti ambientali, come alimentatori e linee d'acqua, sull'abbondanza batterica utilizzando un modello di regressione lineare (LRM). Il dataset sperimentale utilizzato per l'analisi è fornito nel Supplementary File 2. La visualizzazione 3D ha mostrato differenze chiare nei conteggi aerobici tra il recinto, dimostrando che l'approccio può mostrare efficacemente reali distribuzioni microbiche all'interno degli ambienti di alloggio avicoli (Figura 4; per l'esperienza interattiva, vedi Supplementary File 3). Queste visualizzazioni hanno rivelato una distribuzione spaziale eterogenea, con aree localizzate di maggiore abbondanza batterica vicino a specifiche caratteristiche ambientali. Nel recinto avicolo, i conteggi aerobici variavano da 5,9 a 8,6 log₁₀ CFU/g, con le concentrazioni più alte rilevate vicino alla linea dell'acqua e conteggi più bassi intorno ai feeder centrali e distali rispetto alla linea dell'acqua. L'abbondanza aerobica media è diminuita da 8,0 log₁₀ CFU/g vicino alla linea dell'acqua a 7,4 log₁₀ CFU/g nella distanza più lontana registrata. I conteggi microbici rappresentano i valori medi delle misurazioni replicate in ciascuna posizione di campionamento. Inoltre, la distanza dalla linea dell'acqua era un indicatore significativo del carico batterico aerobico (LRM, P < 0,05), mentre le distanze dagli alimentatori e dall'ingresso non lo erano (LRM, P > 0,05). Questi risultati quantitativi corroborano la tendenza visiva osservata nei grafici superficiali 3D, dimostrando un chiaro calo dell'abbondanza microbica con l'aumentare della distanza dalle fonti di umidità. In definitiva, questi risultati mostrano che il framework basato su griglia 3D offre un approccio pratico per la visualizzazione e l'analisi dell'eterogeneità spaziale nei dataset di lecciolieri di pollame. Utilizzando sia dati simulati che sperimentali, questo modello ha catturato schemi di distribuzione microbica localizzati e ha permesso ulteriormente l'interpretazione statistica dell'associazione tra abbondanza batterica e caratteristiche ambientali all'interno del recinto.

Figura 1: Disposizione a griglia del recinto per pollame per la raccolta dei campioni. Rappresentazione schematica del quadro di campionamento a griglia utilizzato per definire le coordinate spaziali e le posizioni di campionamento nel recinto avicolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio di layout di dati simulati in formato foglio di calcolo. Struttura rappresentativa di fogli di calcolo che mostra identificatori di campioni, coordinate spaziali (X e Y) e variabili microbiche o fisicochimiche utilizzate per l'analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Distribuzioni spaziali simulate dei conteggi microbici e del pH attraverso il recinto avicolo. (A) conteggi simulati dell'organismo A, (B) conteggi simulati dell'organismo B e (C) valori simulati del pH visualizzati utilizzando un modello spaziale 3D basato su griglia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Distribuzione spaziale dei conteggi batterici aerobici nel recinto avicolo. Il grafico 3D della superficie mostra variazioni nei conteggi batterici aerobici (log CFU/g) lungo le distanze (coordinate X–Y). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro	Valore
Distribuzione	Normale
Meschina (μ)	8.26
SD (σ)	0.77
Distribuzione	7.10–9.37
Schema spaziale	Gradiente lineare (direzione Y)
Rumore	Normale (μ=0, piccola variazione)
Seme casuale	10

Tabella 1: Parametri utilizzati per la generazione simulata del dataset microbico. Riepilogo dei parametri di distribuzione, inclusi media, deviazione standard, intervallo di valori e impostazioni del gradiente spaziale utilizzati per generare dati microbici simulati.

Nome della colonna	Descrizione	Tipo di Dati	Richiesto
Pen	Identificatore per penna o gruppo di trattamento	Testo	Sì
X	Posizione delle coordinate X sulla griglia	Numerico	Sì
Y	Posizione delle coordinate Y sulla griglia	Numerico	Sì
Log10_CFU_A	Conteggio microbico trasformato in loga (Organismo A)	Numerico	Sì
Log10_CFU_B	Conteggio microbico trasformato in logaritmica (Organismo B)	Numerico	Opzionale
pH	Valore del pH misurato	Numerico	Opzionale
Distanza Monumento	Distanza dalla caratteristica ambientale (ad esempio, linea d'acqua)	Numerico	Opzionale

Tabella 2: Struttura del dataset di input richiesta per l'analisi spaziale. Elenco delle variabili necessarie, inclusi identificatori di campioni, coordinate spaziali e misurazioni microbiche o fisicochimiche, insieme ai relativi formati dati.

File supplementare 1: Codice per generare visualizzazioni mimicrobiche e spaziali simulate del pH.Script R utilizzato per elaborare dataset simulati e generare grafici di superficie 3D per l'Organismo A, l'Organismo B e il pH nel recinto avicolo. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Dataset microbico sperimentale di pollame per lettiera. Foglio di calcolo contenente conteggi batterici aerobici e coordinate spaziali associate utilizzate per la visualizzazione 3D e l'analisi statistica. Clicca qui per scaricare questo file.

File Supplementare 3: Link di accesso interattivi per visualizzazioni 3D e codici QR. Codici QR e corrispondenti link web per accedere a grafici 3D interattivi di dataset simulati e sperimentali.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

I grafici basati su simulazioni presentati in questo studio sono stati sviluppati per dimostrare il potenziale della mappatura spaziale 3D nel migliorare la visualizzazione delle distribuzioni microbiche e fisicochimiche all'interno degli ambienti di lettiera avicola (Supplementary File 3). Inoltre, abbiamo combinato questo approccio con dati di enumerazione microbica e marcatori ambientali e spaziali all'interno della penna per valutare i modelli di distribuzione localizzati e identificare relazioni dipendenti dalla distanza (Supplementary File 3).

Un passaggio fondamentale nell'attuale protocollo è l'istituzione accurata del quadro di campionamento basato su griglia. Poiché la superficie 3D dipende da coordinate spaziali affidabili, la corretta designazione dei punti di origine, la spaziatura uniforme e la registrazione precisa delle posizioni X e Y sono essenziali. La parte più laboriosa del metodo è tracciare la griglia e confermare che ogni campione corrisponda alle coordinate assegnate e al punto di riferimento ambientale, come alimentatori, linee d'acqua, punti di ingresso o zone di riscaldamento. Piccoli errori posizionali in questa fase possono influenzare analisi successive. In contesti più grandi o commerciali, strumenti di misura basati su laser o ausili di posizionamento simili possono ridurre la manodopera e migliorare la riproducibilità. Un'annotazione accurata dei punti di riferimento del pennato è importante anche perché queste caratteristiche forniscono un contesto ecologico per comprendere i gradienti microbici negli ambienti di letra, creati dall'attività degli uccelli, dall'umidità e dalla distribuzione dei^{nutrienti 2}.

L'attuale protocollo è adattabile ad applicazioni agricole più ampie. Oltre ai conteggi microbici e al pH, può essere applicato ad altre variabili associate a lettiera o pavimento, tra cui umidità, temperatura, distribuzione dei nutrienti, misure legate all'ammoniaca o caratteristiche delle comunità microbiche derivate dal sequenziamento. Le modifiche pratiche includono il raggruppamento dei dati per penna, la generazione dinamica di matrici da dataset registrati e lo screening per valori mancanti prima di tracciare. I passaggi comuni nella risoluzione dei problemi includono la conversione delle etichette delle coordinate in valori numerici, la media dei valori replicati nei punti condivisi, il controllo della presenza di coordinate duplicate o mancanti, e la conferma che la struttura matriciale corrisponde al layout originale della penna. Il quadro può anche essere ampliato per includere analisi multivariate e profondità di cucciolo, permettendo la valutazione sia dell'eterogeneità orizzontale che verticale.

Devono essere riconosciute anche diverse limitazioni. Il metodo non migliora essenzialmente la risoluzione del campionamento o la rappresentazione biologica; Al contrario, migliora l'organizzazione spaziale e l'interpretazione dei dati dopo la raccolta. Pertanto, la qualità del modello finale dipende ancora dal disegno di campionamento e dalla coerenza dell'esecuzione sul campo. La costruzione di una rete può essere fisicamente impegnativa e richiedere molto tempo. Inoltre, un'implementazione di successo richiede accesso al computer e competenze di base nell'elaborazione dei dati. Errori nei modelli di denominazione, nell'inserimento delle coordinate o nelle celle della griglia mancanti possono interrompere la generazione delle matrice o produrre visualizzazioni fuorvianti. Nel complesso, l'approccio attuale dovrebbe essere visto come un quadro esplorativo basato sulla visualizzazione piuttosto che come un sostituto della statistica spaziale formale o dell'inferenza meccanicistica.

Nonostante queste limitazioni, il protocollo offre chiari vantaggi rispetto agli approcci tipici che si basano su campioni aggregati e misurazioni puntuali isolate, che possono mascherare variazioni spaziali su scala fine all'interno di una penna o di una casa 3,4,5,6,7. Nel studio attuale, l'applicazione del quadro ai conteggi batterici aerobici ha dimostrato che le popolazioni microbiche possono raggrupparsi spazialmente all'interno della lettiera avicola. In particolare, l'abbondanza batterica era più alta vicino alla linea d'acqua e diminuiva verso il centro del recinto, produendo un gradiente chiaro nel grafico superficiale 3D (File Supplementare 3). Questo schema supporta l'interpretazione secondo cui condizioni ambientali localizzate distinte, in particolare l'umidità, possano influenzare fortemente la distribuzione microbica nella lettiera avicola. Variabili aggiuntive, come pH e composizione dei nutrienti, possono chiarire ulteriormente queste relazioni. Lavori precedenti hanno dimostrato in modo simile che le comunità microbiche delle lettiera avicole e le condizioni ambientali variano nello spazio in relazione al pH, allo sversamento di mangime e all'attività degli^{uccelli 2}. Collegando misurazioni microbiche o fisicochimiche a posizioni definite all'interno dell'ambiente animale, questo metodo rende tali schemi più visibili e interpretabili. Parallela inoltre gli approcci di mappatura spaziale utilizzati nelle scienze del suolo e agronomiche per identificare gradienti, irregolarità e punti focali localizzati, applicando questi concetti ai sistemi di produzione animale 11,12,13. In futuro, la mappatura spaziale ripetuta tra recinti, stormi e cicli produttivi potrebbe supportare la modellizzazione predittiva dei punti caldi microbici e una gestione più mirata delle zone ecologiche ad alto rischio.

Sebbene la visualizzazione 3D non migliori l'accuratezza o la precisione dei dati, migliora l'interpretazione dei fattori statisticamente rilevanti che influenzano i modelli e le tendenze microbiche nella lettiera avicola. Una visualizzazione più accessibile può supportare la comunicazione e il processo di decisioni informate riguardo alle modifiche della cucciolata, alla salute degli uccelli e alla sostituzione della^lettiera 14,15,16. Oltre alle applicazioni di ricerca, questo strumento ha un valore pratico per i produttori di pollame e il personale accademico^{di estensione 17}. Questi plot 3D possono essere strumenti efficaci per presentare dati microbici complessi in un formato più accessibile e pratico per gestori di allevamento, stakeholder e piccoli produttori avicoli^. La possibilità di accedere a questi lotti su un telefono cellulare tramite un codice QR potrebbe aumentare ulteriormente la loro utilità per il supporto tecnico sul campo. Man mano che la produzione avicola continua a progredire nella tecnologia dei sensori e nella generazione di dati, tali approcci potrebbero diventare sempre più utili all'interno dell'informatica avicola^{integrativa 18,19}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bilanciamento analitico	Fisher Scientific	15997490	Per pesare i lettieri (ad esempio, 10 g/campione)
Computer con accesso a internet	Qualsiasi	N/A	Per gestire RStudio
Incubatore (37 & deg; C)	Thermo Scientific	50125590H	Per la crescita batterica di 24 ore
Mezzi microbiologici (TSA)	BD Difco	236950	Per enumerare i batteri aerobici
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Utilizzato per diluizioni e sospensioni microbiche
Campioni di lettiera avicola	Fornitura per polli o recinto di ricerca	N/A	Rifiuti freschi raccolti utilizzando un design a griglia
Pacchetti R: plotly, dplyr, htmlwidgets	CRAN	https://cran.r-project.org	Per la visualizzazione 3D e la gestione dei dati
Ambiente di calcolo statistico R (v4.3 o successivo)	Progetto R	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio (v2024.12.0.467 o successiva)	Ipotesi	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
Software per fogli di calcolo (Excel, Google Sheets)	Microsoft/Google	https://www.microsoft.com/exce	Per organizzare i dati prima dell'importazione in RStudio
Tubi conici sterili da 10 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	Per il trasporto di aliquote
Pipette sterili e pipette sterili Consigli	Fisher Scientific	N/A	Per una gestione accurata e sterile dei liquidi
Borse Whirl-Pak sterili	Nasco	B01062	Per la raccolta e l'omogeneizzazione del campione
Miscelatore a vortice	VWR	10153-838	Per omogeneizzare i campioni