Il saggio sull'emostasi di Nijmegen: misurazione simultanea fluorogenica della generazione di trombina e plasmina in un singolo pozzo

Sommario

Questo protocollo descrive il saggio di emostasi di Nijmegen, che consente una misurazione simultanea e temporanea della generazione di trombonina e plasmina per fornire una valutazione integrata della coagulazione e della fibrinolisi. Il test mira a migliorare la caratterizzazione dell'equilibrio emostatico in ambito di ricerca e clinico oltre l'ambito dei test emostatici.

Abstract

La trombona e la plasmina svolgono entrambe un ruolo centrale nell'emostasi, regolando rispettivamente la coagulazione e la fibrinolisi. I saggi emostatici convenzionali spesso si concentrano su componenti isolati o fasi limitate dell'emostasi; ad esempio, il tempo di tromboplastina parziale attivata e il tempo della protrombina valutano solo l'inizio della formazione della fibrina, mentre i test di attività dei fattori valutano la funzione dei singoli fattori di coagulazione. Sebbene utili, questi sami mancano di una visione completa del processo complessivo di emostasi secondaria e fibrinolisi, che si sviluppano dinamicamente nel tempo. Il Saggio Emostatico di Nijmegen (NHA) affronta questa limitazione consentendo una misurazione simultanea e risolta nel tempo della generazione di trombine e plasmine in un singolo pozzo microplate. Utilizzando due substrati fluorogeni sintetici con spettri distinti di eccitazione ed emissione e senza reattività incrociata, il saggio consente una quantificazione accurata di entrambi gli enzimi in parallelo. L'emostasi viene avviata nel plasma povero di piastrine utilizzando fattori tissutituali, calcio e attivatori di plasminogeni di tipo tessuto, e la fluorescenza viene registrata ogni 30 secondi per 70 minuti a 37 °C. Le curve di attività enzimatica sono generate utilizzando standard di calibrazione, dai quali si derivano parametri come il tempo di rilag, il potenziale di trombina, il tempo di lisi della fibrina e l'altezza del picco della plasmina. Il saggio cattura in modo affidabile la generazione simultanea di trombona e plasmina con buona precisione intra- e inter-analisi, e rileva la modulazione della coagulazione e della fibrinolisi da parte di effettori come l'eparina, la proteina C attivata e l'acido epsilon-aminocaproico. Nei campioni clinici, è stata osservata una riduzione significativa della generazione di trombina nei pazienti con carenze dei fattori di coagulazione, mentre i pazienti con disturbi fibrinolitici hanno mostrato profili elevati di generazione di plasmina. Combinando le misurazioni della generazione di trombina e plasmina, l'NHA fornisce una visione completa dell'equilibrio emostatico oltre i saghi convenzionali. Questo approccio integrato offre potenzialità per la ricerca e applicazioni cliniche, come la caratterizzazione dei fenotipi emostatici, la valutazione del rischio di sanguinamento e trombo, e il monitoraggio di interventi terapeutici mirati. Questo protocollo delinea la procedura NHA che mira a migliorare la comprensione e la valutazione dell'equilibrio emostatico.

Introduzione

L'emostasi è il risultato di un equilibrio dinamico tra coagulazione e fibrinolisi. La trombona e la plasmina sono gli enzimi chiave che guidano questi processi: la trombina converte il fibrinogeno in fibrina, mentre la plasmina degrada la fibrina dissolvendo i coaguli. La compromessa di questo equilibrio può portare a emorragie o eventi^{trombotici 1,2}. Tuttavia, gli esami di laboratorio utilizzati per valutare l'emostasi in pratica clinica si concentrano tipicamente su fasi isolate di coagulazione o fibrinolisi, fornendo una comprensione limitata dell'equilibrio emostatico complessivo. Nei pazienti con sospetta tendenza al sanguinamento, sono comunemente utilizzati test di screening di routine come il tempo di protrombina (PT) e il tempo di tromboplastica parziale attivata (aPTT) per verificare carenze nei fattori di coagulazione. Tuttavia, questi saggi misurano il tempo fino alla formazione iniziale della fibrina e non catturano la generazione di trombina oltre l'inizio della coagulazione, dove si verifica la maggior parte dell'attività fisiologicamente rilevante ^{della trombina 1,2,3}. Di conseguenza, possono fornire risultati normali nei pazienti con lievi carenze dei fattori di^coagulazione 3,4,5,6,7,8. Per identificare queste specifiche carenze vengono utilizzati saghi di attività dei fattori di coagulazione. Sebbene informativi per la diagnosi, questi saghi valutano le singole proteine isolatamente e non riflettono l'equilibrio emostatico complessivo. Di conseguenza, nei pazienti con carenze lievi, i livelli di fattore spesso corrispondono in modo scarso al fenotipo di^{sanguinamento 9,10}. Ciò complica la valutazione del rischio clinico e l'ottimizzazione della gestione del paziente, inclusi i tempi e la somministrazione della terapia, nonché interventi in risposta a eventi trombotici o emorragici gravi. Queste limitazioni evidenziano la necessità di sagaggi che offrano una visione più completa del processo emostatico nel tempo e possano aiutare a colmare il divario tra i risultati di laboratorio e la presentazione clinica.

Il Saggio dell'Emostasi di Nijmegen (NHA) è stato sviluppato per affrontare queste limitazioni consentendo la misurazione simultanea e temporanea della generazione di trombine e plasmine in plasmi poveri di^{piastrine 8,9}. Utilizza due substrati fluorogenici sintetici con spettri distinti di eccitazione ed emissione per quantificare entrambi gli enzimi nello stesso pozzo di microplacche senza reattività incrociata. Le curve di generazione enzimatica permettono di derivare parametri quantitativi che riflettono la dinamica della coagulazione secondaria e della fibrinolisi, inclusi il tempo di ritardo, l'altezza del picco della trombona, il tempo di lisi della fibrina e l'altezza del picco della plasmina. L'NHA offre diversi vantaggi rispetto ai saggi esistenti sulla generazione della trombina, come il Calibrated Automated Thrombogram (CAT), Ceveron s100 e ST Genesia, che forniscono informazioni preziose sulla dinamica della trombomba ma non valutano l'attività fibrinolitica 10,11,12,13. Gli saggi di lisi coagulata, a loro volta, catturano aspetti della fibrinolisi ma mancano di informazioni sulla generazione¹⁴ della trombina. Ciò limita la loro utilità nella valutazione delle complesse interazioni che determinano l'equilibrio emostatico complessivo. Sebbene alcuni approcci sviluppati in laboratorio combinino misurazioni di generazione di trombona e plasmina, queste richiedono tipicamente pozzi separati o saggi paralleli, limitando l'allineamento temporale e la portata^{di 15}. Analisi globali come la tromboelastografia (TEG) e la tromboelastometria rotazionale (ROTEM) forniscono informazioni complementari catturando l'emostasi primaria, la coagulazione secondaria e la fibrinolisi^16,17. I sistemi di camere di flusso rappresentano un altro approccio emergente ma sperimentale per valutare l'emostasi totale in condizioni^{di flusso 18}. Sebbene questi saggi globali offrano un contesto fisiologico più ampio, generalmente sono meno sensibili ai lievi disturbi emorragici 19,20,21. Misurando simultaneamente la generazione di trombombina e plasmina nello stesso pozzo reattivo, l'NHA combina la sensibilità dei TGA convenzionali con la visione integrata dei saghi globali, consentendo una valutazione diretta dell'emostasi secondaria, della fibrinolisi e delle loro interazioni.

I saghi sulla generazione della trombona hanno già mostrato notevoli promesse per applicazioni traslazionali, come il profiling individualizzato del sanguinamento e del rischio trombotico e il monitoraggio della terapia 22,23,24,25. Nella ricerca clinica, l'NHA ha dimostrato una riduzione della generazione di trombina in pazienti con emofilia A, emofilia B e rare carenze di fattori di coagulazione, nonché una maggiore generazione di plasmina in condizioni iperfibrinolitiche come la carenza di α2-antiplasmina 26,27,28,29. Differenze in entrambe le vie sono state osservate anche nei pazienti con ipofibrinogenemia, un disturbo associato sia al sanguinamento sia a un aumento del rischio di trombosi. In questa popolazione, livelli più bassi di fibrinogeno erano correlati a una riduzione della produzione di plasmina, probabilmente a causa della mancanza di siti di legame al plasminogeno, mentre i pazienti con storia di trombosi hanno mostrato un aumento della generazione^{di trombina 30}. Inoltre, il saggio rileva gli effetti degli agenti terapeutici, tra cui anticoagulanti, procoagulanti e antifibrinolitici^. In uno studio precedente, abbiamo proposto un approccio di standardizzazione e normalizzazione per migliorare la riproducibilità e permettere il confronto dei risultati tra esecuzioni e laboratori, un passo essenziale verso l'implementazione^{clinica 28}. Questo protocollo delinea la procedura completa e l'approccio analitico dell'NHA per l'implementazione in contesti di ricerca clinica o traslazionali.

Protocollo

Tutte le procedure che hanno coinvolto campioni di plasma umano sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e approvate dal comitato etico medico di Arnhem-Nijmegen. Il consenso scritto informato di tutti i donatori è stato ottenuto prima della raccolta del campione.

1. Preparazione di tamponi, reagenti e campioni di plasma

1. Preparare soluzioni tampone
   1. Pesare 1,2 g di Tris (p.a.) e sciogliere in 180 mL di 0,9% di NaCl.
   2. Regola il pH a 7,4 usando HCl.
   3. Portare il volume finale a 200 mL con 0,9% di NaCl per ottenere un buffer di 50 mM Tris-150 mM NaCl (TBS).
   4. Aliterizza il TBS in due tubi da 50 mL.
   5. Usa i restanti 100 mL di cucchiai per preparare il tampone contenente calcio. Sciogliere 7,34 g di CaCl_{2,2H 2}O in 100 mL di TBS per ottenere il tampone Tris-NaCl-CaCl₂ (TBS-Ca, pH 7,4).
   6. Smonta il TBS-Ca in due tubi da 50 mL.
   7. Conserva entrambi i buffer a 4 °C e utilizzi entro una settimana.
2. Prepara i substrati fluorogenici
   1. Sciogliere 53,2 mg del substrato di trombina (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) in 4 mL di tampone Tris-NaCl.
      NOTA: La scatola contiene un volantino con un certificato di analisi. Il volume di tampone da aggiungere dipende dalla concentrazione specificata e deve essere regolato in modo che 1 μL di trombina umana aggiunta in un reagente da 120 μL produca una concentrazione finale di 76 nmol/L.
   2. Aliquota 100 μL in tubi Eppendorf e conserva a −80 °C.
   3. Scongelare un'aliquota di substrato fluorogenico specifico per trombona per 10 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Vortice e tieni il ghiaccio durante l'esperimento.
   4. Dissolvere il contenuto di una fiala di substrato plasminico (CBZ-L-Phe-Arg-rodamina) in 1.955 μL di DMSO.
      NOTA: La scatola contiene un volantino con un certificato di analisi. Il volume di tampone da aggiungere dipende dalla concentrazione specificata e dovrebbe essere regolato in modo che 1 μL di plasmina umana aggiunta in un reagente da 120 μL produca una concentrazione finale di 200 nmol/L.
   5. Aliquota 60 μL in tubi Eppendorf e conserva a −80 °C.
   6. Scongelare un'aliquota di substrato fluorogenico specifico per plasmina per 10 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Vortice e mantenete a temperatura ambiente durante l'esperimento.
      NOTA: Questo substrato è disciolto nel dimetilsolfossido (DMSO) e non deve essere raffreddato per evitare precipitazioni.
3. Prepara i reagenti di innesco
   1. Ricostituisci la cefalina liofilizzata aggiungendo 1 mL di acqua distillata. Vortice fino a disciollo completamente.
      NOTA: La cefalina viene ricostituita per fornire fosfolipidi, essenziali per catalizzare molteplici reazioni di coagulazione che permettono una coagulazione fisiologicamente rilevante nel saggio.
   2. Aliquota 60 μL in tubi Eppendorf (sufficiente per 20 pozzi) e conserva a −20 °C.
   3. Scongela un'aliquota prima dell'uso e conservala sul ghiaccio. Vortice brevemente prima di pipettare.
   4. Ricostituire il contenuto di una fiala di fattore tissutale umano ricombinante (TF) in 4 mL di acqua distillata.
   5. Aliquota 60 μL in tubi Eppendorf e conserva a −80 °C.
   6. Scongelare brevemente un aliquota di TF e vortice.
   7. Preparare una diluizione 1:500 di TF tramite diluizione sequenziale:
      1. Aggiungere 6 μL di TF a 54 μL di buffer TBS. Vortice.
      2. Prendi 6 μL di questa diluizione e aggiungi 54 μL di TBS. Vortice.
      3. Prendere 20 μL di questa seconda diluizione e aggiungerli 80 μL di TBS per raggiungere una concentrazione finale di 0,28 pM. Vortice.
   8. Ricostituire il contenuto di una fiala (20 mg) di attivatore di plasminogeno di tipo tessutale (tPA) in 20 mL di acqua distillata per ottenere una concentrazione finale di 580.000 IU/mL (verificare la concentrazione specifica per lotto).
   9. Aliquota 50 μL in tubi Eppendorf e conserva a −80 °C.
   10. Scongelare brevemente un aliquota di tPA e vortice.
   11. Preparare una diluizione 1:50 di tPA aggiungendo 20 μL di tPA a 980 μL di tampone Tris-NaCl, raggiungendo una concentrazione finale di 11.600 IU/mL. Vortice.
4. Preparare i campioni di plasma
   1. Raccogliere sangue venoso in tubi di citrato da 3 mL contenenti il 3,2% di citrato, assicurandosi di raccolere almeno 2,7 mL (90% di riempimento).
   2. Non usare il primo tubo dopo la venipuntura; Scartalo per evitare l'attivazione del fattore tissutale.
   3. Inverti il tubo almeno 10 volte subito dopo la rimonta.
   4. Centrifugare entro 2 ore a temperatura ambiente, prima a 2.500 × g per 5 minuti, seguita da 10.000 × g per 10 minuti.
   5. Usa una pipetta usa e getta per raccogliere il plasma appena sopra lo strato cellulare.
   6. Plasma aliquota in crioviali marcati, congela rapidamente in azoto liquido e conserva a −80 °C.
      NOTA: Assicurati che il campione sia privo di coaguli. Usa solo plasma fresco o scongelato una volta. Un tubo CTAD è sufficiente per l'analisi duplicata.

2. Preparazione degli strumenti e configurazione del software

1. Prepara il lettore a piastre fluorescenti
   1. Accendi il lettore di piastre e lascialo equilibrare a 37 °C.
   2. Imposta i seguenti parametri di base:
      1. Greiner 96-well, fondo piatto, nero.
      2. Impostazioni generali: ritardo di posizionamento: 0,1 s; Numero di finestre cinetiche: 1.
      3. Finestra cinetica: Numero di cicli: 140; Tempo di inizio della misurazione: 0,0 s; Numero di lampi per pozzo e ciclo: 10; Tempo di ciclo: 30 s.
      4. Ottica: Ottica superiore
      5. Impostazioni del filtro: Numero di monocromatici: 2. Filtro di eccitazione: 355 nm per la trombina; 485 nm per la plasmina. Filtro di emissione: 460 nm per la trombina, 520 nm per la plasmina. Guadagno: 600.
   3. Definisci la disposizione con un massimo di 20 pozzi per piatta.
   4. Naviga su Concentrazioni/Volumi/Scuotimento e conferma le seguenti impostazioni. Pompa 1 = 20 μL; Pompa 2 = 0 μL; Velocità = 420 μL/s.
2. Prepara il sistema di iniezione
   1. Rimuovi e risciacqua gli aghi di iniezione in un contenitore con tampon.
   2. Imposta il volume di risciacquo a 2.500 μL e risciacquo le pompe con un tampone Tris/NaCl a 37 °C.
   3. Resetta il volume di risciacquo a 500 μL.

3. Configurazione del saggio in formato microplate

1. Configurazione dello shaker a micropiastra
   1. Imposta lo shaker a micropiastra a 37 °C e verifica la temperatura prima dell'uso.
   2. Imposta l'intensità del tremore a 1100 giri/min.
   3. Utilizzare questo shaker per tutte le fasi di miscelazione del saggio per garantire una distribuzione omogenea dei reagenti e un'attività enzimatica costante.
2. Aggiungi reagenti ai pozzi
   1. Scongelare il plasma del paziente e il plasma normale accumulato (NPP) in un bagno d'acqua a 37 °C per un massimo di 10 minuti.
   2. Mescola accuratamente e verifica il completo scongelamento (niente crioprecipitato).
   3. Aggiungere 80 μL di plasma o NPP del paziente ai pozzi preselezionati. Usa una punta di pipetta fresca per ogni campione.
      NOTA: Includere un campione NPP in ogni esecuzione del saggio per tenere conto della variabilità tra le serie (vedi ulteriormente al passo 5.6).
   4. Aggiungi 2 μL di cefalina.
   5. Aggiungere 2 μL di fattore tissutale (diluizione 1:500). Mescola brevemente usando uno shaker per piatti.
   6. Aggiungi 10 μL di tampone Tris-NaCl. Mescola brevemente usando uno shaker per piatti.
   7. Aggiungi 4 μL di substrato trombonico.
   8. Aggiungi 2 μL di substrato plasminico. Mescola brevemente usando uno shaker per piatti.
3. Pre-incubazione
   1. Inserisci la micropiastra nel lettore di piastre.
   2. Lascia che la piastra si equilibri a 37 °C per diversi minuti.

4. Preparazione e iniezione del reagente di partenza

1. Prepara il reagente per la Pompa 1
   1. Combinare 672 μL di tampone Tris/NaCl, 192 μL di tampone Tris/NaCl/CaCl₂ e 96 μL di tPA (dal passaggio 1.2.5). Vortice a fondo.
   2. Perfora due fori nel tappo del tubo del reagente.
   3. Inserisci il tubo della pompa attraverso un foro fino al fondo del tubo.
2. Innalzare e iniziare il test
   1. Usa il software per primerare la pompa con 500 μL del reagente.
   2. Reinserire gli aghi di iniezione nelle loro posizioni designate.
   3. Inizia immediatamente la misurazione della fluorescenza.
3. Inizio manuale del test
   NOTA: Questa procedura di avvio manuale offre un'alternativa al flusso di lavoro di iniezione automatica descritto nei passaggi 2.2, 4.1 e 4.2.
   1. Preparare il reagente di partenza come descritto in 4.1.1 immediatamente prima dell'uso.
   2. Rimuovi la micropiastra dal lettore di piastre e aggiungi rapidamente 20 μL del reagente di partenza manualmente in ogni pozzo usando una pipetta calibrata o una pipetta multicanale per una gestione più veloce.
   3. Riporta immediatamente la piastra al lettore e avvia la misurazione della fluorescenza senza ritardo.
      NOTA: Minimizzare il tempo tra l'aggiunta del reagente e l'inizio della misurazione (<10 s per linea) per ridurre la variabilità.
4. Lettura cinetica
   1. Registra la fluorescenza ogni 30 secondi per 70 minuti.
   2. Mantieni la piastra a 37 °C durante la misurazione.

5. Analisi dei dati

1. Preparare i dati per l'analisi
   1. Esporta i dati di fluorescenza cinetica dal lettore di lastre come una tabella con timepoint e valori di fluorescenza per pozzo.
   2. Converti i dati grezzi di fluorescenza in curve di generazione enzimatica calcolando la prima derivata usando Excel o un altro programma.
   3. Traccia le curve di generazione enzimatica per ciascun pozzo per visualizzare la reazione enzimatica.
      NOTA: Queste curve rappresentano la velocità di generazione di trombina o plasmina nel tempo e corrispondono al risultato grafico mostrato nelle figure.
2. Analizza le curve di generazione della trombona
   1. Identificare i seguenti parametri dalla curva di generazione della trombina (vedi Figura 1):
      1. Tempo di ritardo: Il momento in cui la curva di generazione della trombina aumenta costantemente e raggiunge l'8% dell'altezza massima della trombina.
      2. Altezza massima della trombona: Il valore massimo del segnale sull'asse y (cioè il tasso massimo di generazione della trombina).
      3. Momento di picco della trombona: Il tempo dall'inizio del test fino al picco della trombina.
      4. Potenziale di trombina (area sotto la curva di generazione della trombina): L'area sotto la curva dal ritardo fino al ritorno del segnale di trombina.
         NOTA: Il potenziale di trombina riflette la capacità totale di generazione di trombina del campione in condizioni di saggio.
3. Analizza le curve di generazione della plasmina
   1. Identificare i seguenti parametri dalla curva di generazione della plasmina (vedi Figura 2):
      1. Tempo di lisi della fibrina: Il tempo dall'inizio della generazione della plasmina (cioè il momento in cui la curva di generazione della plasmina aumenta costantemente e raggiunge l'8% dell'altezza del picco della plasmina) fino al momento in cui il picco della plasmina viene raggiunto.
      2. Altezza massima della plasmina: Il primo massimo distinto nella curva, corrispondente allo scoppio iniziale nella generazione della plasmina, è determinato nel punto in cui la seconda derivata della curva di generazione della plasmina (basata su una media mobile di tre minuti) raggiunge zero dopo l'inizio della generazione della plasmina.
      3. Potenziale di plasmina (area sotto la curva di generazione della plasmina): L'area sotto la curva dall'inizio della generazione della plasmina fino al momento del picco della plasmina.
         NOTA: Le fluttuazioni del segnale si verificano dopo il picco iniziale della plasmina e non sono incluse nell'analisi dei parametri di generazione della plasmina.
4. Estrazione dei parametri manualmente o utilizzando software personalizzato
   1. Usa Microsoft Excel, GraphPad Prism o uno script personalizzato (ad esempio, in Python o R) per estrarre i parametri cinetici.
   2. Salva i dati grezzi, le curve tracciate e i parametri calcolati in un formato strutturato per l'archiviazione e il riferimento futuro.
      NOTA: Se si utilizzano macro, verifica la correttezza di tutti i parametri sia in modo visivo che manuale prima di affidarti all'output automatico. La nostra macro per la conversione dati è disponibile su richiesta.
5. Standardizzazione e normalizzazione
   1. Stabilire un riferimento fisiologico misurando 40 campioni individuali da donatori sani in parallelo con il campione NPP utilizzato per la normalizzazione. Esegui questo passaggio una volta per ogni batch di NPP.
   2. Calcola i valori medi dei parametri di generazione di trombina e plasmina dei donatori sani e determina il loro rapporto con i corrispondenti valori NPP ottenuti nello stesso ciclo.
   3. Per ogni campione di paziente in una determinata esecuzione, si normalizza prima il parametro di generazione di trombina o plasmina al valore NPP misurato nello stesso esecuzione.
   4. Dividere questo risultato per il rapporto sano donatore/NPP precedentemente stabilito per lo stesso lotto di NPP (vedi passo 5.6.2). Questo produce un valore relativo normalizzato rispetto all'individuo medio sano, con standardizzazione per la variazione tra corse usando NPP.
   5. Esprime i valori dei parametri come percentuali rispetto al valore medio degli individui sani (definito come 100%). Presentare di conseguenza i risultati del campione dei pazienti.
      NOTA: I valori relativi dei parametri per ogni singolo campione di paziente sono calcolati utilizzando la seguente formula, dove l'esecuzione a si riferisce alla prova di misura del campione del paziente, e la corsa b alla corsa di riferimento in cui i campioni di donatori sani sono stati misurati in parallelo con lo stesso lotto di NPP. Il nostro file Excel contenente i calcoli per la normalizzazione dei dati è disponibile su richiesta.
      

6. Generazione di curve di calibrazione

1. Prepara la curva di calibrazione della trombomba
   1. Ricostituire la α-trombomba umana liofilizzata come indicato nel scheda tecnica del produttore.
      NOTA: Ad esempio, se il datasheet specifica la ricostituzione in 100 μL d'acqua per ottenere 3,34 mg/mL, ciò corrisponde a 0,334 mg in 100 μL.
   2. Diluire la trombina ricostituita 1:10 nel tampone Tris/NaCl.
      NOTA: Questo produce una concentrazione stock di circa 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), basata su un peso molecolare di 36.700 g/mol.
   3. Preparare una serie di diluizione nel tampone Tris/NaCl per ottenere concentrazioni finali di trombocina nel saggio che variano da 0 a 152 nmol/L.
   4. Pipetta trombina in pozzi selezionati già contenenti tampone per raggiungere un volume totale di 100 μL per pozzo.
   5. Preparare la soluzione del substrato per la Pompa 1 mescolando 300 μL di tampone Tris/NaCl con 200 μL di substrato di trombomba del passo 1.2.2.
   6. Diluire ulteriormente questa soluzione combinando 400 μL della miscela con 360 μL di tampone Tris/NaCl.
   7. Aggiungere 20 μL di questa miscela di substrato a ciascun pozzo di calibrazione, portando il volume totale del test a 120 μL.
   8. Mescola delicatamente la piastra e inseriscila nel lettore di piatti. Esegui il test cinetico per 25 cicli, utilizzando le stesse impostazioni di fluorescenza descritte nella sezione 2.
   9. Esporta i dati grezzi di fluorescenza e determina la pendenza iniziale (tasso di aumento della fluorescenza per ciclo) per ogni concentrazione di trombombina usando GraphPad Prism o software equivalente.
   10. Genera una curva standard tracciando la pendenza iniziale rispetto alla concentrazione di trombina.
       NOTA: Assicurarsi che tutti i tamponi siano preriscaldati a 37 °C e maneggiare gli enzimi sul ghiaccio. Prepara sempre diluizioni fresche e mescola accuratamente. La curva standard risultante viene utilizzata per calcolare l'attività relativa della trombomba in campioni sconosciuti utilizzando il macro descritto nella sezione 5.
2. Preparazione della curva di calibrazione della plasmina
   1. Ricostituire la plasmina liofilizzata in acqua distillata (ad esempio, 0,543 mL) secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: La plasmina ha un peso molecolare di 75.400 g/mol. La concentrazione risultante è di circa 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), assumendo 1 mg in 0,543 mL.
   2. Prepara una serie di diluizione nel tampone Tris/NaCl per ottenere concentrazioni finali di plasmina nel saggio che variano da 66 a 532 nmol/L.
   3. Pipetta la plasmina in pozzi contenenti tampone Tris/NaCl per raggiungere un volume finale di 100 μL per pozzo.
   4. Preparare la soluzione substratale per la Pompa 1 mescolando 680 μL di tampone Tris/NaCl con 80 μL di substrato di plasmina/rodamina (prediluito 1:1 se necessario) dal passaggio 1.2.5.
   5. Aggiungere 20 μL di questa soluzione substratale a ciascun pozzo di calibrazione, portando il volume totale a 120 μL.
   6. Mescola delicatamente la piastra e inseriscila nel lettore di piatti. Esegui il test cinetico per 25 cicli utilizzando le stesse impostazioni di fluorescenza descritte nella Sezione 2.
   7. Esporta i dati grezzi di fluorescenza e determina la pendenza iniziale dell'aumento di fluorescenza per ogni concentrazione di plasmina applicando una regressione lineare alla fase lineare della curva cinetica utilizzando GraphPad Prism o software equivalente.
   8. Genera una curva standard tracciando la pendenza iniziale rispetto alla concentrazione di plasmina.
      NOTA: A causa della variazione dell'attività plasminica da batch a lot, la calibrazione dovrebbe essere ripetuta con ogni nuovo lotto. Se si osserva un'attività inaspettatamente alta, si raccomanda una diluizione 1:2 dello stock prima di preparare la serie di calibrazione.
3. Usa la curva di calibrazione per la quantificazione
   1. Utilizzare le curve di calibrazione generate nella Sezione 6 per convertire i valori della pendenza di fluorescenza in attività enzimatica relativa.
   2. Utilizzare solo la porzione lineare della curva di calibrazione per interpolare campioni sconosciuti.

Risultati

Le curve rappresentative di generazione di trombina e plasmina ottenute con il Saggio dell'Emostosi di Nijmegen (NHA) sono mostrate nella Figura 3. L'intensità del segnale di ciascuna curva è espressa come percentuale rispetto al campione di plasma normale aggregato (NPP) misurato contemporaneamente. Un campione con NPP è incluso in ogni esecuzione come controllo interno per verificare la validità del saggio e garantire la comparabilità tra le operazioni.

Discussione

Il Saggio dell'Emostasi di Nimega (NHA) è un saggio fluorogenico a doppio enzima che consente la misurazione simultanea e risolta nel tempo della generazione di trombina e plasmina in plasmi poveri di piastrine. Catturando entrambi i processi in un unico pozzo, il metodo facilita l'analisi cinetica ad alta risoluzione dell'emostasi secondaria e della fibrinolisi. Questa doppia lettura offre vantaggi metodologici distinti rispetto ai sami convenzionali ed è stata applicata con successo ne...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali
Cloruridrico di calcio (CaCl2.2H2O)	Merck	1.02382
Cefalina (kit di reazione C.K. Prest 5 APTT)	Stago	00847	Stabile per 6 mesi a -20 &°C.
Acqua distillata			Annota la data di apertura. Da usare entro 1 giorno dalla prima apertura.
Dimetilsolfossido (DMSO)	Merck	1.02950.0500
Alfa-trombina umana	Laboratori di Ricerca sugli Enzimi	HT 1002a	La scatola contiene un opuscolo con un certificato di analisi. Il volume del tampone da aggiungere dipende dalla concentrazione specificata e dovrebbe essere regolato in modo che 1 & micro; L di trombocina umana aggiunta in 120 & micro; Il reagente L produce una concentrazione finale di 76 nmol/L.
Plasmina umana	Laboratori di Ricerca sugli Enzimi	HPlas	La scatola contiene un opuscolo con un certificato di analisi. Il volume del tampone da aggiungere dipende dalla concentrazione specificata e dovrebbe essere regolato in modo che 1 & micro; L di plasmina umana aggiunta in 120 & micro; Il reagente L porta a una concentrazione finale di 200 nmol/L.
Plasma normale aggregato	Preparazione interna	Non applicabile	Stabile per 3 ore dopo lo scongelamento se tenuto sul ghiaccio.
Plasma del paziente	Non applicabile	Non applicabile
Substrato plasminico (CBZ-L-fenilalalile-L-arginina ammide)-rodamina-morfolino urea	Symeres		Stabile per 6 mesi a -80 °C.
Fattore tissutale umano ricombinante (TF): Innovin	Dade Behring	B4212	Stabile per 6 mesi a -80 °C.
Attivatore plasminogeno di tipo tissutale ricombinante (tPA): Alteplase/Actilyse	Boehringer Ingelheim		Stabile per 12 mesi a -80 °C.
Tris(idrossimetil)amminatomano (H2NC(CH2OH)3)	Merck	1.08382.2500
Tampone Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)	Preparazione interna	Non applicabile
Tris-NaCl-CaCl2 tampone, pH 7,4 (TBS-Ca)	Preparazione interna	Non applicabile
Substrato trombonico Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-ammino-4-metilcumarina	Symeres		Stabile per 6 mesi a -80 °C.
Equipaggiamento
Fluorimetro / lettore di micropiastre Fluostar Optima con controllo della temperatura e iniettori di reagenti	BMG Labtech
Piastra microtitolata a 96 pozzi, polistirene, fondo piatto, nero, superficie di legame media (equivalente Microlon)	Greiner BIO-ONE	655076
Bilancio analitico (bilancio a carico superiore)
Punte blu per pipette (per 100-1000 e micro; L)
Tubi di raccolta del sangue citrato 3mL (3,2% citrato)	BD Vacutainer
Secchio di ghiaccio
Macchina del ghiaccio
Incubatore / micropiastra
Agitatore magnetico
Rack per tubi microcentrifughe
Tubi microcentrifughe, chiudibili
Misuratore pH
Punte delle pipette 0,1-10 e micro; L, non sterile
Pipette (2, 10, 20, 100 e 1000 & micro; L)
Cacciavite (usato come sonda)
Miscelatore a valvole
Bagno d'acqua
Punte gialle di pipette (per 20-200 e micro; L)