Articolo metodologico

Una procedura passo dopo passo per la produzione di chimera germinale nel pollo tramite trapianto di cellule germinali primordiali

DOI:

10.3791/69704

⸱

5 dicembre 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

In questo articolo

Sommario

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Le chimere della linea germinale aviaria, generate dal trapianto di cellule germinali primordiali (PGC) in embrioni riceventi, consentono applicazioni nella transgenesi, nell'editing genico e nella conservazione delle specie. Questo protocollo dettaglia le procedure per l'isolamento PGC, l'espansione in vitro , la microiniezione e la verifica del donatore, fornendo una piattaforma affidabile per la produzione di chimere germinali e per l'avanzamento della biotecnologia aviaria.

Abstract

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La generazione di chimere germinali nei polli tramite trapianto di cellule germinali primordiali (PGC) fornisce una piattaforma robusta e riproducibile per la transgenesi aviaria, l'editing genomico e la conservazione delle specie. Gli approcci tradizionali che utilizzano cellule blastodermali provenienti da embrioni di stadio X di EGK sono limitati dalla bassa efficienza di trasmissione della linea germinale dovuta alla precoce segregazione della linea cellulare. Al contrario, le strategie mediate dalla PGC sfruttano la competenza intrinseca della linea germinale di queste cellule unipotenti, permettendo un'incorporazione affidabile nelle gonadi riceventi. Qui presentiamo un protocollo a passo per l'isolamento dei PGC dagli embrioni HH stadio 26-28, mantenendoli ed espandendoli in vitro, e trapiantandoli nell'aorta dorsale degli embrioni riceventi HH stadio 14-17. L'ingrafto a breve termine viene monitorato utilizzando marcatori fluorescenti come il PKH26, mentre il contributo a lungo termine della linea germinale è confermato dall'analisi PCR delle gonadi riceventi. Questo approccio garantisce una generazione coerente di chimere germinali preservando la vitalità e la competenza funzionale dei PGC donatori. Inoltre, il metodo è compatibile con strumenti di editing genomico come CRISPR/Cas9 e vettori basati su transposoni, permettendo la produzione di modelli aviari transgenici e geneticamente modificati. Oltre alla ricerca di base, questa strategia supporta gli sforzi di conservazione attraverso la trasmissione interspecie delle linee germinali e la conservazione delle risorse genetiche. Nel complesso, questo protocollo fornisce un quadro completo e affidabile per manipolare la linea germinale aviaria, offrendo una piattaforma versatile sia per studi fondamentali che applicati nella biotecnologia avicola.

Introduzione

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La trasmissione mediata dalla linea germinale primordiale delle cellule germinali (PGC) è il metodo più efficiente per trasferire informazioni genetiche alla generazione successiva negli uccelli 1,2,3. Le chimere della linea germinale, definite come individui che portatori sia di cellule germinali derivate dal donatore che dall'ospite, permettono la trasmissione del materiale genetico del donatore alla prole, supportando applicazioni nella transgenesi, nella genomica funzionale e nella conservazione delle specie inpericolo 4,5,6,7,8. A differenza degli approcci che si basano sulle cellule blastodermali, le strategie mediate dalla PGC offrono una maggiore efficienza e riproducibilità nella trasmissione della linea germinale, rendendole particolarmente adatte a una manipolazione genetica precisa.

Nelle specie aviarie, le PGC hanno origine nella regione centrale delle pellucide del blastoderma allo stadioX 9 di Eyal-Giladi e Kochav (EGK) e successivamente migrano alla mezzaluna germinale presso lo stadio 4 10 di Hamburger eHamilton (HH). Tra gli stadi 9 e 12 dell'HH, i PGC circolano tramite vasi sanguigni embrionali prima di depositarsi nella crestagonadale 11,12,13. Questi distinti modelli migratori permettono l'isolamento dei PGC in molteplici stadi, inclusi il crescent germinale, il sangue circolante ele gonadi 14. In particolare, i PGC prelevati dalle gonadi HH stadio 26-28 e trapiantati in embrioni riceventi HH stadio 14-17 hanno dimostrato di mostrare una competenza ottimale della linea germinale ed efficienza nell'ingerto, fornendo un quadro pratico per l'applicazione standardizzata di questo protocollo.

I PGC possono essere mantenuti ed espansi in vitro mantenendo l'identità e la capacità di trasmissione della linea germinale, permettendone l'uso per una modifica genetica stabile. La produzione di chimere della linea germinale mediata da PGC è stata utilizzata per generare uccelli transgenici che esprimono proteine ricombinanti, tracce di linea germinale, manipolano le vie di determinazione sessuale e conferiscono resistenza alle malattieinfettive 6,15,16,17,18,19. Inoltre, il trapianto PGC facilita la trasmissione interspecie della linea germinale e la conservazione del germoplasma aviarioin pericolo 7,8,20,21,22,23, e la criopreservazione PGC consente la preservazione a lungo termine delle risorse genetiche 24,25.

Sebbene altri tipi di cellule staminali, incluse le cellule staminali embrionali (ESC)26,27,28,29, le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)30,31,32 e le cellule staminali spermatogoniali (SSC)33,34, siano stati esplorati per la modifica della linea germinale aviaria, la loro efficienza di trasmissione della linea germinale rimane inferiore a quella dei sistemi basati su PGC, che attualmente sono considerati i più Fonte affidabile di cellule competenti nella linea germinale.

Negli studi sulle chimere germinali, la scelta della razza donatrice è fondamentale per distinguere le cellule germinali derivate dal donatore da quelle derivate dall'ospite. Il pollo ogye coreano (KOC) possiede l'allele recessivo i/i responsabile della pelle nera e delle piume, facilmente distinguibile dalla linea White Leghorn che porta l'allele dominante I/I 35,36. Questa differenza visibile consente un'identificazione inequivocabile della prole di origine donatrice durante l'analisi della trasmissione della linea germinale, supportando al contempo la conservazione della biodiversità grazie al valore genetico indigeno del KOC.

Nel complesso, la produzione di chimere germinali mediata da PGC fornisce una piattaforma solida per la biotecnologia aviaria (Figura 1). Specificando gli stadi ottimali del donatore (HH26-28) e del ricevente (HH14-17) e incorporando passaggi definiti di coltura e validazione, questo protocollo consente una trasmissione efficiente della linea germinale e fornisce un quadro pratico per la generazione di uccelli transgenici e modificati dal genoma, oltre alla conservazione di preziose risorse genetiche aviarie.

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono i polli sono state approvate dall'Istituto delle Risorse Animali da Laboratorio, Università Nazionale di Seoul, Corea del Sud (numero di approvazione IACUC: SNU-250226-4). Gli animali venivano mantenuti in condizioni controllate e igieniche, con acqua e mangime sterilizzati. Inoltre, tutti i rifiuti chimici e biologici generati durante le procedure, incluse soluzioni tripsina/EDTA, cellule marcate con PKH26 e tessuti embrionali o gonadali, sono stati manipolati e smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza e la gestione dei rifiuti pericolosi dell'Università Nazionale di Seul. Tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. I PGC, i mezzi e i reagenti utilizzati per il campionamento di gonadi e la coltura cellulare da embrioni donatori devono essere sterili.

1. Isolamento dei PGC per pollo

  1. Incubare uova di gallina fecondate fresche allo stadio X di Eyal-Giladi e Kochav (EGK) a 37 °C per 5,5 giorni fino a quando gli embrioni raggiungono gli stadi HH 26-28.
    NOTA: Mantieni l'umidità al 60%-65% per garantire uno sviluppo embrionale normale.
  2. Isolare con cura gli embrioni dagli uova agli stadi HH 26-28 usando una força sterile.
  3. Lavare gli embrioni con 1× PBS, poi posizionare l'embrione su un piatto di carbone e fissarlo con spille a forma di insetti. Utilizzando uno stereomicroscopio, sezionare con cura le gonadi embrionali accoppiate con una pinza affilata.
    NOTA: Maneggiare i tessuti con delicatezza per prevenire danni e garantire un accurato isolamento delle gonadi. A causa della loro vicinanza al rene mesonefrico agli stadi HH 26-28, una piccola quantità di tessuto renale può essere raccolta involontariamente; tuttavia, una dissezione attenta sotto stereomicroscopio e condizioni di coltura selettiva garantiscono che solo i PGC si proliferino, mantenendo la purezza.
  4. Trasferire le gonadi accoppiate raccolte da tre embrioni in un tubo da 1,5 mL contenente 500 μL di tripsina/EDTA allo 0,05% e incubare a 37 °C per 5 minuti per dissociare le cellule.
  5. Aggiungi 50 μL di FBS per inattivare la tripsina.
  6. Centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (circa 20-25 °C). Rimuovi con cura il surnatante senza disturbare la pellet cellulare.
  7. Risospendere le cellule gonadali dissociate in 1 mL di 1× PBS.

2. Proliferazione in vitro dei PGC dei polli

  1. Prepara il mezzo di coltura PGC (KO-DMEM integrato con FBS al 20%, siero di pollo al 2%, nucleosidi, GlutaMAX, amminoacidi non essenziali MEM, 2-mercaptoetanolo, 10 mM piruvato di sodio, antibiotico-antimicotico, 10 ng/mL bFGF) e riscalda il mezzo a 37 °C.
  2. Aggiungere cellule gonadali dissociate raccolte da tre embrioni agli stadi HH 26-28 (circa 100-150 PGC per embrione37,38) a 1 mL di mezzo di coltura preriscaldato per pozzo e placcare le cellule su una piastra di coltura a 12 pozzi.
  3. Dondola delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
  4. Mantenere i PGC a 37 °C con il 5% di CO₂, monitorare quotidianamente la morfologia e la densità cellulare. Le PGC rimangono rotonde, rifrattibili e tipicamente fluttuanti, mentre le celle somatiche sono aderenti (Figura 2A).
    NOTA: Le condizioni di coltura supportano selettivamente la proliferazione dei PGC, permettendo loro di espandersi mentre le cellule somatiche vengono gradualmente eliminate.
  5. I PGC coltivati in una piastra a 12 pozzi vengono mantenuti cambiando il mezzo di coltura ogni 3-4 giorni per supportare una proliferazione e una vitalità ottimali (Figura 2B).
  6. Opzionalmente, si utilizzano marcatori specifici per PGC (ad esempio CVH, DAZL, NANG e POUV) per verificare la purezza e condurre la determinazione del sesso tramite PCR (Tabella 1).
    1. Prepara i campioni PGC per l'estrazione dell'RNA utilizzando il sistema RNA Miniprep secondo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire RT-PCR (ad esempio, CVH, DAZL, NANOG e POUV) o immunocolorazione utilizzando marcatori specifici PGC (SSEA1 e DAZL) secondo i protocollistandard 39 (Figura 2C,D).
    3. Eseguire analisi PCR per sesso secondo i protocollistandard 40 (Figura 2E).

3. Validazione della competenza germinale dei PGC coltivati utilizzando l'etichettatura PKH26

  1. Prelevare i PGC quando raggiungono la fase di crescita log-log, tipicamente a una densità di circa 1-5 × 105 celle per pozzo in una piastra a 12 pozzi.
  2. Granulare le cellule centrifugando a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (circa 20-25 °C), risospendere in 1× PBS e valutare la vitalità usando il blu di tripana.
  3. Preparare il diluente C dal kit di collegamento delle cellule fluorescenti rosse PKH26 per la marcatura generale della membrana cellulare e bilanciarlo a temperatura ambiente (circa 20-25 °C).
  4. Ricostituire il colorante PKH26 e preparare una soluzione operativa nel diluente C a una concentrazione finale di circa 1-2 μM.
  5. Risospensa il pellet PGC in 1 mL di diluente C. Aggiungi rapidamente 1 mL di soluzione PKH26 (rapporto 1:1), mescola delicatamente e incuba per 2-5 minuti a temperatura ambiente (circa 20-25 °C).
  6. Aggiungere rapidamente 1 mL di soluzione lavorativa PKH26 alla sospensione della cella (rapporto 1:1), mescolare delicatamente tramite pipetto e incubare a temperatura ambiente (circa 20-25 °C) per 2-5 minuti.
    NOTA: Non superare il tempo di incubazione raccomandato.
  7. Ferma la colorazione aggiungendo 2-4 volte il volume di FBS o 1%-5% di BSA nel PBS.
  8. Centrifuga a 200 × g, 5 min a temperatura ambiente (circa 20-25 °C); lavare tre volte con substrato di coltura PGC o 1× PBS + 0,1% di BSA.
  9. Risospendere le cellule in buffer a iniezione (mezzo di coltura PGC o 1× PBS + 0,1% BSA) a una concentrazione di 1-5 × 104 a 1 ×10 5 cellule/μL. Conservarle brevemente sul ghiaccio per preservare la vitalità.
  10. Verifica l'etichettatura sotto un microscopio a fluorescenza prima dell'iniezione (Figura 3A).
  11. Iniettare più di 3.000 PGC marcati vitali, contati usando blu di tripano, negli embrioni HH stadio 14-17 e incubare fino al giorno 6 (Figura 3B).
  12. Confermare la colonizzazione delle gonadi riceventi entro il sesto giorno (Figura 3C).

4. Trapianto di PGC da donatore nel vaso sanguigno embrionale ricevente

  1. Incubare le uova riceventi allo stadio HH 14-17 (37 °C, 60-70% di umidità, oscillazione a 45° ogni ora).
  2. Prepara una micropipetta capillare di vetro utilizzando tubi di vetro borosilicato (diametro esterno di 1,0 mm, diametro interno 0,5-0,75 mm). Estrai il capillare usando un estratore di micropipette e lucida la punta fino a un diametro interno di circa 10-20 μm.
  3. Creare una piccola finestra (circa 0,5 cm × 0,5 cm) all'estremità appuntita dell'uovo per consentire l'accesso alla microiniezione minimizzando il disturbo all'embrione.
    NOTA: Sterilizza la superficie del guscio d'uovo con etanolo al 70% prima di aprire la finestra per prevenire contaminazioni.
  4. Iniettare 2 μL di una sospensione contenente più di 3.000 PGC in 1× PBS o HBSS nell'aorta dorsale sotto uno stereomicroscopio.
    NOTA: Eseguire l'iniezione sotto uno stereomicroscopio per evitare di danneggiare l'embrione o i vasi sanguigni, e manipolare con attenzione l'ago della microiniezione per prevenire lesioni.
  5. Sigillare la finestra dell'uovo con pellicola di paraffina; posizionare l'uovo con l'estremità rivolta verso il basso e incubare fino alla schiusa a 37,5 °C, 60-70% di umidità, oscillando a 45° ogni ora.
    NOTA: Mantenere una temperatura e umidità adeguate per garantire la vitalità dell'embrione e uno sviluppo di successo.

5. Validazione della chimera germinale

  1. Raccogli il testicolo o l'ovaio dal pulcino di G0 dopo la schiusa.
  2. Estrarre DNA genomico dai tessuti gonadali raccolti per confermare la formazione della chimera della linea germinale. Eseguire l'estrazione del DNA genomico dai tessuti gonadali raccolti come segue:
    1. Raccogliere testicolo o tessuto ovarico, omogeneizzarlo in 300 μl di tampone per la lisi (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) contenente 1,5 μL di proteinasi K, e incubare a 60 °C per l'h per garantire la lisi completa.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione per la precipitazione proteica (7 M di acetato di ammonio), mescolare accuratamente e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
    3. Trasferire il soprandanante (fase acquosa) in un nuovo tubo, aggiungere 500 μL di isopropanolo per precipitare il DNA e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
    4. Scartare il surnatante, aggiungere 1 mL di etanolo al 70% e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
    5. Rimuovi l'etanolo, asciuga all'aria la pellet di DNA a temperatura ambiente per 10 minuti.
    6. Eludi il DNA con 50 μL di acqua priva di RNasi e misura la concentrazione e la purezza del DNA usando uno spettrofotometro (A260/A 280 ≈ 1.8).
    7. Regola il DNA a 10-5 ng per ogni reazione PCR.
  3. Eseguire l'amplificazione PCR utilizzando primer specifici per specie progettati (Tabella 1) nelle seguenti condizioni: 94 °C per 3 minuti seguiti da 35 cicli a 94 °C per 30 secondi, 68 °C per 30 secondi e 72 °C per 30 secondi, più un'estensione finale a 72 °C per 5 minuti (Figura 4A).
  4. Raccogliere sperma da maschi G0 sessualmente maturi, estrarre il DNA dello spermatozoo seguendo lo stesso protocollo ed eseguire PCR utilizzando primer specifici per specie (Figura 4B).

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Risultati

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Proliferazione in vitro e caratterizzazione dei PGC dei polli
Le cellule gonadali intere contenenti PGC sono state isolate dagli embrioni agli stadi HH 26-28 e coltivate in condizioni definite di coltura PGC. Col tempo, le cellule stromali gonadali si sono attaccate alla superficie della coltura o sono state degradate, mentre le PGC sono rimaste in sospensione e hanno iniziato a proliferare attivamente (Figura 2A). Dopo circa due settimane di co...

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Discussione

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Il trapianto di cellule germinali primordiali (PGC) coltivate in embrioni riceventi fornisce un metodo affidabile per produrre chimere germinali nei polli. Questo protocollo sfrutta il potenziale germinseco intrinseco dei PGC e migliora la coerenza sperimentale rispetto ai sistemi tradizionali basati su blastodermi, che sono inclini al mosaicismo e alla variabilità dello sviluppo. Un vantaggio fondamentale di questo metodo è l'espansione selettiva in vitro dei PGC in condizioni ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) [RS-2024-00418297] e dal Programma di Ricerca Cooperativa per lo Sviluppo della Scienza e della Tecnologia Agricola [RS-2025-02213489] dell'Amministrazione Coreana per lo Sviluppo Rurale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x PBS HycloneSH30256
2-MercaptoetanoloGibco21985023
Soluzione antibiotica antimicotica (100X)Gibco15240062
Anticorpo anti-DAZLAbcamab215718
Siero di pollo sterileRocklandD102-00-0500
Desossiribonucleasi I dal pancreas bovinoSigma aldrich9003-98-9
Microcappucchi Drummond Micropipet Usa e Getta Drummond Scientific Company1-000-0500
Nucleosidi EmbryoMax (100X)MerckES-008-D
FBS (Seurm Fetale Bovina Caratterizzata, Origine USA, 500ml)HycloneSH30919
Integratore GlutaMAXGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
Soluzione di amminoacidi non essenziali MEMGibco11140050
Pellicola di laboratorio Parafilm MAmcorPM996 
Kit di collegamento per cellule fluorescenti rosse PKH26 per l'etichettatura generale della membrana cellulareSigma aldrichPKH26GL-1KT
Anticorpo purificato anti-topo/umano CD15 (SSEA-1)Biolegend125602
Proteina ricombinante umana FGF base/FGF2/bFGF (146 aa) & nbsp;R& Sistemi D  233-FB
Sistemi Miniprep RNA ReliaPrepPromegaZ6011
Piruvato di sodio (100 mM)Gibco11360070
Soluzione blu di tripanoSigmaT8154-100ML
Tripsina-EDTA (0,5%), nessun fenolo rossoGibco & trade;15400054

Riferimenti

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