Articolo metodologico

Sviluppo di un nuovo modello di fissazione interna per le fratture radiali dei ratti: valutazione della guarigione delle fratture e isolamento dei ganglioni della radice dorsale

DOI:

10.3791/69707

13 marzo 2026

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Lo studio combina in modo innovativo suture e aghi di titanio per una fissazione interna stabile in un modello di frattura radiale del ratto. La guarigione della frattura è stata valutata tramite micro-tomografia computerizzata (micro-CT) e i neuroni ganglionali della radice dorsale primaria (DRG) sono stati isolati e coltivati per ulteriori indagini.

Abstract

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Il modello della frattura radiale del ratto è di grande importanza nella ricerca ortopedica, in particolare per lo studio dei meccanismi di guarigione delle fratture, lo screening farmacologico e la valutazione di materiali biologici. Nonostante alcune limitazioni, il suo ruolo nella ricerca scientifica rimane insostituibile. Poiché il raggio dei ratti è relativamente sottile, le piastre e le viti d'acciaio attualmente utilizzate nella pratica clinica non sono adatte al trattamento delle fratture radiali dei ratti. Per affrontare questa limitazione, questo studio impiega in modo innovativo la sutura e la fissazione con ago di titanio, un modello di fissazione interna per fratture radiali che fornisce una fissazione relativamente stabile e stabilisce un modello animale robusto per indagare la fissazione interna di tali fratture. L'imaging in vivo è stato eseguito utilizzando un sistema micro-CT su animali vivi per rilevare la guarigione delle fratture radiali nei ratti Sprague-Dawley (SD). L'estrazione e l'applicazione del DRG del ratto sono passaggi importanti nella ricerca neuroscientifica, ampiamente utilizzati in campi come le neuroscienze, la patologia e la biologia cellulare. Questo protocollo è adatto per la coltura primaria dei neuroni ganglionari della radice dorsale da ratti con fratture radiali e può essere utilizzato per studiare i meccanismi di lesione nervosa e la riparazione dopo fratture, come l'apoptosi neuronale e il rilascio di neurotrasmettitori.

Introduzione

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Le fratture radiali sono tra le fratture cliniche più comuni, con un'incidenza globale significativa, e sono una delle principali cause di fratture dell'osso lungo negliarti 1,2,3. Gli studi di popolazione rivelano una distribuzione bimodale per le fratture radiali, tipicamente con picchi sia nella popolazione pediatrica che in quellaanziana 4. Il trattamento ritardato spesso porta a disfunzione rotazionale dell'avambraccio, compromettendo gravemente le attività della vita quotidiana (AVD)5,6. Persistono controversie nella gestione delle fratture radiali, principalmente incentrate sui sistemi di classificazione delle fratture e sulla selezione delle modalitàdi trattamento 7,8. Le evidenze cliniche suggeriscono che la fissazione interna a riduzione aperta (ORIF) migliora significativamente l'ampiezza di movimento (ROM) e il recupero della forza dell'articolazione del gomito o delpolso 9; tuttavia, questo approccio è associato a tassi più elevati di infezioni post-operatorie e complicazioni interne legate allafissazione 10,11.

Il DRG funge da ponte anatomico e funzionale critico per la trasmissione delle informazioni sensoriali tra il sistema nervoso periferico e centrale (SNC). Oltre al suo ruolo principale nella raccolta e trasmissione dei segnali sensoriali periferici (ad esempio, tatto, temperatura), il DRG regola attivamente sensazioni anomale come il dolore, rendendolo una struttura chiave alla base sia della funzione sensoriale normale sia della gestione clinicadel dolore 12,13,14. Cambiamenti patologici come lesioni, infiammazione o neurodegenerazione nella DRG possono scatenare anomalie sensoriali (ad esempio, intorpidimento, formicolio) o dolore cronico, posizionandola come punto focale della ricerca in neuroscienze e medicina del dolore.

In questo caso, sono stati selezionati i ratti SD maschi di 8 settimane di peso di circa 200 g per costruire (1) un modello di fissazione interna per fratture trasversali radiali nei ratti e una successiva valutazione post-guarigione, e (2) l'isolamento e la coltura in vitro di DRG da ratti con un modello di fissazione interna per fratture radiali. Questo protocollo è progettato per facilitare la sperimentazione riproducibile in studi che esplorano i meccanismi di guarigione delle fratture, i cambiamenti sensoriali mediati dalla DRG e potenziali bersagli terapeutici per il dolore o la disfunzione post-frattura.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Etica Animale dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (n. 202508A046). Tutti i ratti utilizzati nei seguenti sagaggi sono stati mantenuti in condizioni specifiche libere da patogeni (SPF). Uno schema che rappresenta il protocollo è mostrato nella Figura 1.

1. Stabilimento di un modello di fissazione interna per le fratture radiali nei ratti

NOTA: I ratti si sono abituati a un ambiente tranquillo con illuminazione soffusa e diffusa prima dell'intervento, proteggendoli da rumori e illuminazione intensa. Durante la maneggiazione, l'addome e il torace dei ratti venivano sostenuti con una delicata contenzione manuale, evitando di afferrare la coda, una pratica nota per indurre dolore e disagio e per ridurre il disagio associato alla lotta.

  1. Preparare gli strumenti chirurgici come mostrato nella Figura 2. Gli strumenti chirurgici includono una lama per bisturi, un manico per bisturi, forbici operatorie, un portaago, pinze emostatiche e pinze di tessuto dentato. Il maschio di ratto Sprague-Dawley (SD) aveva circa 8 settimane e pesava circa 200 g.
  2. Anestetizzare il ratto usando una macchina per anestesia a gas isoflurano. Per l'induzione, utilizzare il 4% di isoflurano e mantenere l'anestesia ventilatoria (2% di isoflurano) utilizzando un cono nasale durante tutta la procedura chirurgica. Mantieni la temperatura della sala operatoria a circa 28 °C.
    NOTA: Determinare il successo dell'anestesia controllando i segni vitali (come respirazione e frequenza cardiaca), riflesso corneale (nessuna risposta indica un'anestesia efficace), riflesso di battito di ciglia (assenza) e risposta alla contrazione delle dita dei piedi (nessuna retrazione dopo la stimolazione).
  3. Posiziona il ratto in posizione laterale, esponi l'arto anteriore destro e rasa i peli con un tagliacapelli. Stendere un lenzuolo sterile e avvolgere un laccio emostatico attorno all'arto anteriore destro prossimale per ridurre il sanguinamento chirurgico.
  4. Prepara la pelle alternando tre volte gli scrub di alcol e betadina.
  5. Eseguire un'incisione longitudinale di 1,5 cm sul lato radiale dorsale dell'avambraccio destro, come mostrato nella Figura 3. Separare gli spazi muscolari ed esporre completamente il raggio dell'arto anteriore destro.
    NOTA: Il raggio è esposto separando in modo semplicemente i muscoli lungo lo spazio intermuscolare. Solo i muscoli dorsali del radio sono esposti senza rimuovere completamente i muscoli circostanti.
  6. Usa forbici operatorie per tagliare il radio e creare una frattura trasversale. Le forbici sono orientate a un angolo di 90 gradi rispetto al raggio (Figura 4).
  7. Prendi un ago in titanio lungo 10 mm di diametro e 10 mm e inseriscilo nella frattura del radio lungo il suo asse longitudinale (Figura 5). Fissare il raggio e l'ago di titanio con la sutura (4-0 [1,5 metriche] intrecciata in seta non assorbibile), come mostrato nella Figura 6.
  8. Lega la sutura con tre nodi consecutivi e fissa l'ago di titanio al raggio tramite quattro suture interrotte.
    NOTA: Le estremità prossimale e distale della frattura sono fisse rispettivamente due volte.
  9. Sutura (4-0 [1,5 metriche] treccia di seta non assorbibile) la pelle, taglia la sutura in eccesso e chiude la ferita. Disinfetta la pelle con scrub Betadine.
  10. Copri la ferita con una garza sterile e fissala con delle bende. Mette il ratto in una gabbia per farlo riprendere conoscenza fino alla guarigione.
  11. Gestione del dolore post-operatorio:
    1. Se l'animale mostra segni di dolore, non mangia e/o esita a camminare sulle zampe posteriori, consulta il personale veterinario e somministra ulteriori analgesici.
      NOTA: Il cefuroxima sodio viene utilizzato nel trattamento delle infezioni batteriche. Il tramadolo cloridrato viene utilizzato per somministrare analgesici.

2. Micro TC imaging

  1. Anestesiare il ratto usando una macchina anestesica a gas isoflurano (dose indutiva del 4%).
  2. Posizionare il ratto in posizione prona all'interno della camera di scansione, regolare la posizione di arto e testa per centrare l'area di scansione del bersaglio nel campo visivo e mantenere una ventilazione e anestesia continue (2% di isoflurano) durante tutta la procedura.
  3. Spingi il letto fisso per animali nella camera di scansione e chiudi la porta della camera.
  4. Imposta i parametri di scansione micro-CT come segue. Modalità scansione: standard; Tempo di esposizione: 2 min; campo visivo: 72 mm; dimensione voxel: 144 μm; tensione: 90 kV; corrente: 88 μA; filtro: 3D-soft.
    NOTA: I dati della scansione vengono automaticamente trasmessi al software e viene generata un'immagine TC tridimensionale.
  5. Separare i tessuti bersaglio.
    1. Analizza l'area del tessuto osseo selezionata dalle immagini micro-CT originali. Fai scorrere la linea della funzione di trasferimento per separare l'osso dal muscolo, evitando di includere troppo tessuto muscolare. Esegui la ricostruzione ad alta risoluzione sull'area segmentata del tessuto osseo per generare un modello 3D.
  6. Esporta le immagini elaborate.
    1. Dopo aver elaborato le immagini, localizza e clicca sul pulsante di fine fine per finalizzare il flusso di lavoro corrente.
    2. Apparirà una finestra pop-up, prima seleziona la foto fissa per confermare che vuoi esportare un'immagine statica (non una sequenza dinamica).
    3. Scegli jpeg come formato file di output tra le opzioni disponibili.
    4. Seleziona dimensioni grandi per assicurarti che l'immagine esportata mantenga alta risoluzione adatta all'analisi o alla documentazione.
    5. Clicca su OK per completare il processo di esportazione.

3. Isolamento e coltura della DRG nei ratti con fratture radiali

NOTA: L'eutanasia viene somministrata con anestesia per inalazione di isoflurano al 4%, seguita da una rapida lussazione cervicale per eutanasiare gli animali. I DRG vengono estratti 20 giorni dopo l'istituzione del modello per la frattura radiale.

  1. Recidi la colonna vertebrale, rimuovi i corpi vertebrali C1-C7. Taglia la colonna cervicale lungo le linee medie anteriori e posteriori, e dividila in metà sinistra e destra. Se necessario, interrompere i processi spinosi per facilitare l'operazione.
  2. Pulisci delicatamente il tessuto del midollo spinale e le fibre nervose all'interno dei forami intervertebrali. Risciacquare i forami intervertebrali con una siringa riempita di PBS per rimuovere il sangue ed esporre le rientranze laterali.
    NOTA: La DRG si trova all'interno dei rientri laterali, presentandosi come un nodulo giallo chiaro, con fibre nervose collegate a entrambe le estremità.
  3. Usa pinze di tessuto dentato per sollevare la DRG, sollevala delicatamente e poi usa forbici operative per tagliare le fibre nervose a entrambe le estremità.
  4. Trasferire i DRG estratti in un tubo centrifuga da 1,5 mL con mezzo di estrazione; Mettere sul ghiaccio.
    NOTA: Prepara il mezzo di estrazione aggiungendo il siero bovino fetale al 2% (FBS) al α-Minimum Essential Medium (α-MEM). I DRG vengono incubati nel mezzo di estrazione per circa 30 minuti prima di passare alla fase successiva.
  5. Aspira lentamente e scarta il mezzo di estrazione. Aggiungi 1 mL di soluzione funzionante a enzimi digestivi misti. Digerisci in un bagno d'acqua a 37 °C per 60-70 minuti.
    NOTA: Per preparare la soluzione di lavoro enzimatica digestiva mista, sciogliere 100 mg di collagenasi di tipo I e 100 mg di dispasi in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Durante l'uso, diluiscilo in una soluzione funzionante di 5 mg/mL e conservalo sul ghiaccio.
  6. Ricoprire una piastra di Petri pipettando un volume appropriato della soluzione di lavoro sulla fibronectina, poi incubare a 37 °C per 1 ora.
    NOTA: La soluzione lavorativa con fibronectina plasmica umana (soluzione lavorativa con fibronectina) viene preparata diluendo la soluzione stock di fibronectina da 1 mg/mL con ddH₂O in una soluzione lavorativa di fibronectina da 0,02 mg/mL.
  7. Dopo la digestione, aspirare e eliminare la soluzione funzionante di enzimi digestivi misti. Aggiungi 1 mL di mezzo intero e pipetta delicatamente il tessuto DRG più volte.
    NOTA: Per preparare il mezzo completo, mescolare 45 mL di mezzo MEM-α, 4,5 mL di FBS e 0,5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina (PS), e sterilizzare tramite filtrazione attraverso una membrana microporosa di grado sterilizzante da 0,22 μm.
  8. Raccogli il filtrato, centrifuga a 75 × g per 8,5 minuti a 25 °C.
  9. Dopo la centrifugazione, aspirare e scartare il surnatante nel tubo della centrifuga, aggiungendo 1 mL di mezzo intero per risospendere il precipitato.
  10. Togli la piastra di Petri. Scartare la soluzione funzionante di fibronectina e lavare due volte con PBS.
  11. Inoculare le cellule nella piastra di Petri rivestita, aggiungere 1 mL di mezzo intero e incubare in un incubatore a temperatura costante a 37 °C con il 5% di CO₂ per 8-12 ore.
  12. Dopo 8-12 ore, sostituire il mezzo completo con il mezzo sostitutivo. Poi, sostituisci metà del volume con il mezzo di ricambio ogni 2-3 giorni.
    NOTA: Per preparare il mezzo di sostituzione, miscela 44,5 mL di mezzo MEM-α, 4,5 mL di FBS, 0,5 mL di soluzione di Penicillina-Streptomicina (PS) e 0,5 mL di Ossossiuridina. Sterilizza tramite filtrazione attraverso una membrana microporosa di grado sterilizzante di 0,22 μm.

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Risultati

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Le immagini micro-TC hanno confermato l'affermazione con successo dei modelli di rati per fratture radiali nella Figura 7 e il modello di fissazione interna per le fratture radiali dei ratti nella Figura 8. Le immagini micro-CT sono state confrontate tra il giorno della costruzione del modello di fissazione interna della frattura e venti giorni dopo l'istituzione del modello. Venti giorni dopo la modellazione, l'analisi micro-CT...

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Discussione

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La frattura radiale è una delle fratture dell'osso lungo più comuni nella pratica clinica. Il suo processo di guarigione coinvolge complesse interazioni tra la riparazione del tessuto osseo e la regolazione neurale (come la regolazione di osteoblasti/osteoclasti da parte di neuropeptidi e fattori neurotrofici rilasciati dal ganglio della radice dorsale)15,16,17,18.

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del progetto di ricerca scientifica della Jiangsu Traditional Chinese Medicine Society (XYLD2024038) e dal progetto di ricerca scientifica del Comitato per la Salute e il Benessere di Nantong (QNZ2023115).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5-Fluoro-2' desossiuridinasigmaF0503
Cefuroxima sodio Shandong Runze Pharmaceutical Co., Ltd., CinaGuoyao Zhunzi H20205058
Soluzione per la colorazione DAPIBiyotimeC1005
DispersasiShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd.S25046
Siero fetale bovino (FBS)Thermo16000-044
pinze emostatiche Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J31070
Fibronectina plasmatica umana (Fibronectina umana) & nbsp;sigmaF0895
IsofluranoRWDR510-22-10 
Sistema di micro-TC per animali viviPerkinElmer negli USAQuantum GX 
Mezzo della cultura MEM-ALPHA  BIC3060
portaaghi  Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;200622
forbici operative  Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J21130
PenicillinaSolarbio140051251
Soluzione di penicillina e streptomicina NovaCellsN-PSS125
Povidone-IodioMeilunbioMB1313800g
Lama del bisturiShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.RYY070
Manico di bisturiShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J11010
sutura Johnson & Johnson MEDICAL (CINA) LT. SA84G
Ago per sutureATTREZZATURE MEDICHE SHANGHAI XIAOYU.& Delta; 3/8 & middot; 3 e volte; 6
Ago di titanioDispositivi medici Tianjin Yutong  2-0X250 
pinze di tessuto dentato Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J41055
Cloridrato di tramadoloJiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co., Ltd., CinaCYHB2201997
Tubulina beta-IIIsigmaCBL412X
Collagenasi di tipo I & nbsp;Thermo17100-017
Microscopio a fluorescenza invertita Zeiss Axio Vert A1ZeissAxio Vert A1

Riferimenti

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Frattura radiale nel rattoimaging micro CTfissazione con ago di titaniofissazione con suturaisolamento del DRGcoltura primaria di neuronivalutazione della guarigione ossea

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