La resistenza alla Teicoplanina è rilevata dal sistema automatizzato nelle ceppi di Staphylococcus spp affidabile?

Sommario

Qui viene presentato un protocollo per valutare l'affidabilità di un sistema automatizzato (VITEK 2) per determinare la suscettibilità alla teicoplanina negli isolati di Staphylococcus tramite confronto con la microdiluizione del brodo (BMD), con applicazioni per confermare la resistenza e guidare la terapia antimicrobica appropriata.

Abstract

In questo studio sono stati inclusi in questo studio un totale di 467 isolati di Staphylococcus aureus (S. aureus) e 66 isolati di Staphylococcus (CoNS) coagulasi negativi raccolti tra giugno 2022 e dicembre 2024. Il test di suscettibilità alla Teicoplanina è stato eseguito utilizzando il sistema automatizzato di test antimicrobico per la suscettibilità antimicrobica, la microdiluizione del brodo (BMD) e un metodo di test a gradiente. La resistenza alla meticillina è stata rilevata nel 71,7% degli isolati di S. aureus e in tutti gli isolati di CoNS. In questo studio, 13 isolati di S. aureus e 4 isolati di CoNS sono stati identificati come resistenti alla teicoplanina tramite un sistema automatizzato di test di suscettibilità. Tutti e 13 gli isolati di S. aureus sono risultati suscettibili alla teicoplanina sia dal test del gradiente che dalla BMD. Tutti e quattro gli isolati di CoNS sono stati identificati come suscettibili dal test del gradiente, mentre la BMD ha classificato due isolati come suscettibili e due come resistenti. La resistenza alla Teicoplanina è stata rilevata in quattro ceppi [S. capitis (n = 1) e S. haemolyticus (n = 3)] tra gli isolati di CoNS tramite BMD. I quattro ceppi di CoNS resistenti alla teicoplanina identificati dalla BMD sono stati isolati da ematocolture; tre sono stati ottenuti da pazienti pediatrici e uno da un paziente adulto. Nel complesso, il tasso di S. aureus resistente alla meticillina (MRSA) è stato relativamente alto nello studio, e tutti gli isolati di CoNS erano resistenti alla meticillina. Inoltre, i sistemi automatizzati si sono rivelati inaffidabili nel determinare la resistenza alla teicoplanina, e gli isolati identificati come resistenti dovrebbero essere confermati dalla BMD. Dato che la teicoplanina è un antibiotico di ultima risorsa utilizzato per trattare patogeni come MRSA e CoNS resistente alla meticilina, la sua suscettibilità dovrebbe essere attentamente monitorata.

Introduzione

Staphylococcus aureus (S. aureus) è una delle specie di Staphylococcus più clinicamente significative grazie alla sua ampia gamma di fattori di virulenza e alla sua capacità di causare gravi infezioni in vari tessuti e organi. È responsabile delle infezioni della pelle e dei tessuti molli, infezioni dei tessuti profondi, infezioni delle vie respiratorie, infezioni delle vie urinarie e infezioni del flusso sanguigno, e rimane uno dei patogeni più importanti negli ambienti^{ospedalieri 1,2}. In particolare, la S. aureus resistente alla meticillina (MRSA) è una delle principali cause di infezioni associate all'assistenza sanitaria a livello mondiale e continua a essere una delle principali cause di infezioni postoperatorie delle^{ferite 2,3}. Gli stafilococchi coagulasi negativi (CoNS), sebbene facciano parte della flora cutanea normale, sono stati sempre più implicati in infezioni locali e sistemiche negli ultimi anni. Questo aumento ha portato a test di suscettibilità antimicrobica più frequenti e, di conseguenza, a un aumento della rilevazione della resistenza agli antibiotici glicopeptidici come la^{teicoplanina 4}.

Poiché i ceppi di S. aureus e CoNS mostrano comunemente resistenza agli antibiotici β-lattamici, gli antibiotici glicopeptidici, principalmente vancomicina e teicoplanina, sono ampiamente utilizzati per il trattamento di queste infezioni5. La crescente prevalenza di patogeni nosocomiali gram-positivi resistenti ha portato all'uso esteso dei glicopeptidi, contribuendo a una diminuzione della suscettibilità batterica a questi^{agenti 5,6}. Vancomicina e teicoplanina hanno un'efficacia antimicrobica comparabile; Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato che la teicoplanina è associata a meno effetti avversi, in particolare una riduzione della^{nefrotossicità 7,8}. Pertanto, la teicoplanina è spesso considerata un'alternativa adatta alla vancomicina in specifiche popolazioni di pazienti, inclusi quelli con neutropenia, batteriemia o compromisso della funzione^{renale 9,10}.

La determinazione rapida e accurata della suscettibilità ai glicopeptidi è importante a causa dell'uso diffuso di questi agenti nelle infezioni da Staphylococcus resistenti alla meticillina e delle crescenti segnalazioni di ceppi resistenti ai^{glicopeptidi 11}. Sono disponibili diversi metodi di laboratorio per valutare la suscettibilità ai glicopeptidi nelle specie di Staphylococcus, tra cui diluizione dell'agar, test di gradiente, microdiluizione del brodo (BMD) e sistemi automatizzati di test di suscettibilità^{antimicrobica 5}. Studi precedenti hanno riportato discrepanze tra sistemi automatizzati e metodi di riferimento nel rilevare una minore suscettibilità o resistenza ai glicopeptidi, in particolare alla teicoplanina, nelle specie 4,11 di Staphylococcus.

Il presente studio ha mirato a valutare l'affidabilità del sistema automatizzato di test di suscettibilità antimicrobica per determinare la suscettibilità alla teicoplanina negli isolati di Staphylococcus , rispetto al metodo della microdiluizione del brodo, lo standard di riferimento. La valutazione delle caratteristiche prestazionali del sistema automatizzato può aiutare i laboratori clinici a valutarne l'idoneità per la rilevazione di routine della suscettibilità ai glicopeptidi nella pratica clinica.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale il 27 gennaio 2025 (numero di protocollo: HRU/25.02.03). Lo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki.

1. Progettazione dello studio

Questo studio retrospettivo ha valutato le prestazioni del sistema automatizzato di test di suscettibilità antimicrobica per determinare la suscettibilità alla teicoplanina nelle specie di Staphylococcus , confrontando i risultati con il metodo di riferimento per microdiluizione del brodo (BMD) e un metodo di test a gradiente.

2. Selezione isolata

1. Raccolta di isolati clinici
   1. Includono un totale di 467 isolati di S. aureus e 66 isolati di Staphylococcus (CoNS) coagulasi negativi ottenuti da vari campioni clinici tra giugno 2022 e dicembre 2024.
   2. Elaborare tutti i campioni clinici secondo procedure microbiologiche di routine nel laboratorio diagnostico.
   3. Includere solo un isolato per paziente nell'analisi. Escludere isolati ripetuti ottenuti da campioni diversi dello stesso paziente.
2. Identificazione iniziale e screening
   1. Identificare tutti gli isolati a livello di specie utilizzando la spettrometria di massa a tempo di volo di ionizzazione assistita da disorbimento laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS).
   2. Test S. aureus e CoNS isolati per la resistenza alla meticillina e la suscettibilità alla teicoplanina utilizzando schede VITEK 2 AST-P664 con il sistema automatico di test della suscettibilità.
   3. Registrare i valori della concentrazione inibitoria minima (CMI) generati dal sistema automatico di test di suscettibilità per un confronto successivo.
3. Immagazzinaggio isolato e sottocultura
   1. Conservare gli isolati a −80 °C in brodo di soia triptico integrato con il 20% di glicerolo dopo un sistema automatico di test di suscettibilità.
   2. Prima dei test di riferimento, isola lo scongelamento a temperatura ambiente e li subcolla due volte su agar di sangue di pecora al 5%.
   3. Incubare le piastre a 37 °C per 24 ore dopo ogni passaggio per garantire purezza e vitalità.

3. Test di suscettibilità agli antimicrobici

1. Microdiluizione del brodo (BMD)
   1. Preparazione di soluzioni di Teicoplanina
      1. Prepara una soluzione di stocco di polvere di teicoplanina a una concentrazione di 2560 mg/L in un brodo Mueller-Hinton adattato per cationi (CAMHB).
   2. Procedura di microdiluizione del brodo
      1. Eseguire test di microdiluizione del brodo utilizzando micropiastre sterili a U-bottom a 96 pozzi.
      2. Erogare 100 μL di CAMHB in ciascun pozzo. Diluire la soluzione di teicoplanina dieci volte e aggiungere 100 μL al primo pozzo.
      3. Preparare diluizioni seriali doppie tra i pozzi 1–10 per ottenere concentrazioni finali di antibiotici che variano da 64 a 0,125 μg/mL.
      4. Usa il pozzo 11 come controllo della crescita contenente CAMHB e inoculo batterico. Usare il pozzo 12 come controllo negativo contenente solo CAMHB¹².
   3. Preparazione e incubazione dell'inoculo
      1. Sospendere le colonie batteriche pure in soluzione salina sterile e regolare la sospensione a una torbidità equivalente a uno standard McFarland di 0,5.
      2. Prepara una diluizione 1:100 nel CAMHB e aggiungi 100 μL della sospensione batterica ai pozzi 1–11 per ottenere una concentrazione finale dell'inoculo di circa 5 × 10⁵ CFU/mL.
      3. Incubare le microplacche a 37 °C per 24 ore in condizioni atmosferiche^{ambientali 12}.
   4. Determinazione e interpretazione dei MIC
      1. Definire la concentrazione inibitoria minima (CMI) come la concentrazione più bassa di teicoplanina che inibisce completamente la crescita batterica visibile dopo l'incubazione.
      2. Interpretare i valori di MIC secondo le linee guida 14.0 del Comitato Europeo per il Test di Suscettibilità Antimicrobica (EUCAST)^{versione 14.0}.

4. Controllo qualità

1. Utilizzare Staphylococcus aureus ATCC 29213, con un intervallo di riferimento MIC di teicoplanina di 0,25–1 mg/L, come ceppo di controllo qualità.

5. Analisi statistica

1. Confronto dei metodi
   1. Confrontare i risultati della MIC della teicoplanina ottenuti tramite il sistema automatico di test di suscettibilità con quelli ottenuti tramite il metodo di riferimento BMD.
   2. Definire l'accordo categoriale (CA) come risultati concordanti suscettibili o resistenti tra i due metodi.
2. Classificazione degli errori
   1. Definire errori molto gravi (VME) come isolati categorizzati come suscettibili dal sistema automatico di test di suscettibilità ma resistenti alla BMD.
   2. Definire errori maggiori (ME) come isolati classificati come resistenti dal sistema automatico di test di suscettibilità ma suscettibili alla BMD.
3. Criteri di prestazione
   1. Si considera accettabile la performance del metodo quando l'accordo categorico è ≥90% e i tassi di VME e ME sono ≤3%, in conformità con i criteri di valutazione^{pubblicati 14,15}.

Risultati

Un totale di 533 isolati recuperati da campioni clinici in un periodo di 2,5 anni sono stati inclusi nell'analisi. Tutti gli isolati di CoNS resistenti alla meticillina (MR-CoNS) e il 71,7% degli isolati di S. aureus sono risultati resistenti alla meticilline. I campioni di tampone della ferita sono stati i campioni clinici più comuni che hanno prodotto gli isolati di S. aureus , mentre gli isolati di MR-CoNS sono stati più frequentemente recuperati dalle emicolture (

Discussione

La resistenza agli antimicrobici è una delle minacce più significative per la salute pubblica globale, contribuendo all'aumento dei costi sanitari, al fallimento dei trattamenti e alla^{mortalità 3}. L'incidenza di infezioni acquisite sia nella comunità che in quelle ospedaliere causate da Staphylococcus aureus continua ad aumentare sia a livello nazionale che globale. La resistenza alla meticilina, in particolare, è associata a un aumento della morbilità e ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo Mueller Hinton Regolato per i Cationi	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania	CM0405B	Per la crescita batterica nel metodo di microdiluizione del brodo
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé rieux, Francia	410893	Per l'identificazione batterica
Norma McFarland	bioMé rieux, Francia	95060-958	Standardizzazione dell'inoculo batterico
Piastre di Petri	RTA, Tü Rikie	2102	Per la preparazione del mezzo e la coltivazione batterica
Punta da pipetta 20 - 200 μ L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania	Z740105	Per la distribuzione dei mueller e dash aggiustati per i cationi; Brodo Hinton (CAMHB) in micropiastre U-bottom e preparazione di diluizioni seriali
Agar di sangue di pecora	RTA, Tü Rikie	2001	Isolamento e coltivazione di microrganismi
Staphylococcus aureus	Collezione della Cultura di Tipo Americano	29213	Ceppo di riferimento utilizzato in questo studio
Polvere di teicoplanina	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania	T0578	Antibiotici
Brodo di soia triptico	Merck, Germania	1,054,590,500	Isolamento e coltivazione di microrganismi
Piastra del pozzo inferiore a U	Thermo Fisher Scientific	163320	Per il test di suscettibilità agli antimicrobici tramite il metodo di microdiluizione del brodo
VITEK 2 AST-P664 schede	bioMé rieux, Francia	414197	Per test di suscettibilità agli antimicrobici
VITEK2 Compact	bioMé rieux, Francia	4700030	Per test di suscettibilità agli antimicrobici