Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

Sommario

L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule utilizzando software di patologia digitale.

Abstract

La colorazione multiplexata a immunofluorescenza (IF) rappresenta un cambiamento radicale di sofisticazione rispetto all'imaging IF tradizionale, permettendo la rilevazione sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale. Ciò facilita la profilazione di una gamma più ampia di tipi cellulari e strutture tissutali, oltre a consentire la valutazione della relazione spaziale tra questi in modo non fattibile con sezioni sequenziali. Non esiste un unico marcatore universale della senescenza, ed è ormai ampiamente apprezzato che le firme di senescenza variano in base al tipo cellulare, al trigger della senescenza e al tempo trascorso dall'induzione. Pertanto, gli approcci combinatori offerti dal multiplex IF forniscono uno strumento potente per consentire la rilevazione di cellule senescenti non polarizzate all'interno di una singola sezione tissutale.

Qui sono stati impiegati microarray tissutali contenenti nuclei provenienti da 34 tipi di tessuto umano. Questi sono stati colorati con una combinazione di biomarcatori strutturali, immunitari e di senescenza in un saggio a 10 plex, con immagini acquisite tramite uno scanner di vetrine multiplex. Questo metodo consente di valutare l'abbondanza e la distribuzione spaziale delle cellule senescenti nei tessuti. Colorazione sequenziale, imaging e cicli di inattivazione dei coloranti sono stati utilizzati per generare dataset multiplex, con immagini acquisite tramite un sistema multiplex di scansione delle vetrine a fluorescenza. Sono descritti protocolli sia per la preparazione manuale delle vetrine sia per l'elaborazione automatica tramite coloratore di vetrine, insieme alla segmentazione a singola cellula e all'analisi spaziale tramite software di patologia digitale. Nel complesso, questi metodi forniscono una guida completa per la colorazione, l'imaging e l'analisi spaziale dei biomarcatori associati alla senescenza all'interno di campioni tissutori, oltre a una guida più generale all'imaging multiplexato.

Introduzione

La senescenza è un complesso destino cellulare terminale che si è dimostrato contribuire a una vasta gamma di processi, tra cui l'invecchiamento, il cancro e la funzione immunitaria, oltre all'omeostasi dei tessuti^{normali 1}. Tuttavia, non è stato descritto alcun biomarcatore universale della senescenza e l'identificazione si basa sulla valutazione di una serie di cosiddetti segni². L'imaging intermittente del tessuto è stato limitato alla valutazione di uno o due biomarcatori all'interno di una singola sezione, rendendo la valutazione delle combinazioni di marcatori all'interno dello stesso campione una^{sfida 3}. Questo problema è aggravato dall'emergente quadro dell'eterogeneità cellulare senescente al livello⁴ della singola cellula e dalla scarsità di segnali di senescenza^{in vivo 2}, rendendo difficile la selezione di pannelli di rilevamento ristretti in contesti nuovi o con campioni^{preziosi 5,6}.

L'imaging IF multiplexato mira a superare questa limitazione facilitando la rilevazione sequenziale di più biomarcatori all'interno di una singola sezione^{tissutale 3}. Ciò è possibile sia tramite l'uso di reporter oligonucleotidi marcati fluorescenti sia tramite anticorpi primari marcati il cui segnale fluorescente viene stinto tramite un processo di inattivazione^{di colorante 7}. In entrambi i casi, l'imaging sequenziale viene utilizzato per costruire un pannello di biomarcatori risolto spazialmente, offrendo vantaggi rispetto all'IF tradizionale per la colorazione tessutale sequenziale. Attraverso la generazione di questi profili complessi all'interno di un singolo campione tissutale, può essere rilevato un numero maggiore di fenotipi senescenti, tipi cellulari e strutture tissutali, permettendo una valutazione sofisticata delle loro relazioni spaziali e^{distribuzioni 7}.

Tuttavia, sebbene la complessità dei profili di imaging IF multiplexati sia significativamente superiore a quella dei tradizionali IF, i pannelli marker sono generalmente limitati a <100 biomarcatori a causa di vincoli^{pratici 3}. Questi includono sia la potenziale perdita di antigenicità epitopica, intensità del segnale o integrità tissutale con ogni ciclo successivo, sia la sfida di ottimizzare grandi combinazioni di anticorpi che devono necessariamente non contenere reattività^{incrociata 8,9}. Pertanto, determinare la composizione ottimale di ogni ciclo di anticorpi è una considerazione importante nella progettazione dei panel multiplex. Di conseguenza, il "plex" complessivo è inferiore a quello ottenuto da tecniche come la trascrittomica spaziale. Tuttavia, dato che il multiplex IF quantifica proteine invece dei livelli di trascritto, le due tecniche possono essere considerate complementari e possono essere combinate in pipeline "multi-omiche" su larga^{scala 10}.

Qui sono stati fotografiati microarray di tessuti umani contenenti nuclei di 34 tipi di tessuto. Questi sono stati colorati con una combinazione di biomarcatori strutturali, immunitari e di senescenza in un saggio di 10 plex: Pan-citocheratina (PANCK), CD31, actina muscolo liscio alfa (aSMA), cheratina 15 (K15), vimentina, FOXP3, CD8, Ki67, p16 e Lamin B1. Sono forniti protocolli dettagliati passo dopo passo sia per la preparazione manuale delle vetrine, sia per un adattamento per incorporare l'automazione tramite un coloratore automatico per vetri. Confronti sperimentali rappresentativi mostrano che quest'ultimo migliora sia l'integrità del tessuto sia, per la maggior parte dei marcatori, il segnale di^{fluorescenza 11}. Infine, viene fornita una guida passo dopo passo per l'analisi di immagini microarray tissutali multiplexate tramite il software digitale di patologia HALO, inclusa segmentazione a singola cellula e analisi spaziale dell'espressione dei biomarcatori. I risultati rappresentativi dimostrano la fattibilità tecnica della rilevazione e quantificazione delle cellule senescenti basata sul pannello dei biomarcatori (a differenza di una validazione biologica completa della classificazione della senescenza).

Nel complesso, questa metodologia è presentata come guida alla valutazione multiplex dei biomarcatori di senescenza in vivo, nonché come guida più generale all'imaging multiplexato (Figura 1).

Protocollo

Dichiarazione etica

I campioni di tessuto inclusi in questo lavoro erano in eccesso rispetto ai requisiti diagnostici dell'archivio NHS di Barts Health, i campioni sono stati prelevati in conformità con tutte le linee guida istituzionali e normative pertinenti e approvati secondo i protocolli etici 10/H0704/65 e 05/QO605/140.

1. Preparazione delle vetrine, prelievo di antigeni e blocco

Nota: Salvo indicazione, tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (~20–25 °C) in condizioni standard di laboratorio.

1. Montaggio iniziale del campione
   1. Per garantire una ritenzione ottimale dei tessuti, montare campioni di tessuto con paraffina fissa di formalina (FFPE) su vetri di microscopia di alta qualità (caricati positivamente), preparati da un nuovo pacchetto per garantire una perdita di carica minima.
   2. Assicurarsi che le sezioni non superino i 5 μm di spessore, con una dimensione massima di 4 x 2^cm 2 montate centralmente per garantire visibilità all'interno della finestra di osservazione del portaportavetrino senza slitta.
   3. Eseguire la preparazione del campione manualmente tramite una camera di decloaking o in modo automatico tramite un tintore automatico.
2. Camera di decloacing
   1. Cuocere fino a 24 vetrine durante la notte a 60 °C con il tessuto rivolto verso l'alto.
   2. Dewax e reidratare i campioni utilizzando incubazioni sequenziali di 5 minuti in xilene (eseguire due passaggi) e concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 100%, 90%, 70%) immergendo completamente i vetrini in ciascun reagente.
   3. Lava i vetrimenti immergendoli in PBS per 5 minuti (esegui il passo due volte).
   4. La permeabilizza scivola immergendola allo 0,3% di Triton X 100 diluito in PBS per 10 minuti.
   5. Lava le vetrioni immergendole in PBS per 5 minuti.
   6. Prepara la camera di decloaking aggiungendo i seguenti reagenti a ciascuna delle sezioni separate:
      1. 500 mL ddH₂O nella camera principale.
      2. 250 mL ddH₂O nella posizione centrale del serbatoio sul cestello metallico della cremallera.
      3. 250 mL Soluzione di smascheramento dell'antigene pH 6 1 (ARS1) in posizione sinistra del serbatoio sul cestello metallico del rack.
      4. 250 mL soluzione di smascheramento antigenica pH 9 1 (ARS2) in posizione destra del serbatoio sul cestello metallico (diluito in ddH_2Oda 10x stock).
   7. Immergi i campioni nella soluzione ARS1 e sposa una striscia di vapore su tutti e tre i serbatoi.
   8. Posizionare il coperchio sulla camera di decloaking e ruotare per bloccarla in posizione chiusa, assicurandosi che il valore di rilascio della pressione sia piatto sullo stelo di pressione.
   9. Seleziona e avvia un protocollo che sale fino a un punto di temperatura preimpostato di 110 °C e rimane valido per 4 minuti.
   10. Durante la fase di riscaldamento, quando il pannello indicatore di temperatura mostra 70 °C, avvia un timer per 20 minuti. Il sistema raggiungerà la temperatura, si manterrà e inizierà a ridurre la pressione durante questo periodo.
   11. Decomprimi completamente il sistema inclinando con attenzione la valvola di rilascio con una pinzetta e aprendo il coperchio. Controlla la striscia del getto per assicurarti che la temperatura sia stata raggiunta.
   12. Sposta i campioni dalla soluzione ARS1 nella soluzione ARS2. Rimetti il coperchio della camera (ma senza bloccare o ripresurizzare) e avvia un timer per 20 minuti.
   13. Rimuovi il cestello del serbatoio che contiene i carrelli e porta al banco di lavoro.
   14. Lascia il cestino sul piano a temperatura ambiente per 10 minuti.
   15. Lava i campioni immergendoli in PBS per 5 minuti (esegui questo passaggio quattro volte).
   16. Bloccare i campioni immergendoli in PBS contenente il 10% di siero dell'asino e lo 0,3% di BSA per 1 ora.
   17. Lavare i campioni immergendoli in PBS per 5 minuti.
   18. Campioni controcoloranti immergendoli in DAPI (1 μg·^mL-1) diluiti in PBS per 15 minuti.
   19. Lavare i campioni immergendoli in PBS per 5 minuti.
   20. Monta le guide in portaslitte senza slip.
3. Tintore automatico di slitta (ad esempio Bond RXm)
   1. Metti i reagenti di lavaggio, ER1 ed ER2 in blocco nel cassetto inferiore.
   2. Accendi il sistema per inizializzare.
   3. Assicurati che i contenitori dei rifiuti siano vuoti e che tutti gli altri reagenti siano sopra i livelli minimi.
   4. Preparare il braccio del reagente riempiendo le posizioni del potenniere con i seguenti reagenti ai volumi richiesti indicati dal sistema per il numero totale di vetrine:
      1. Inserisci il potenziatore vuoto del reagente riempito con PBS nel braccio del reagente.
      2. Inserire il vaso del reagente contenente 0,3% di Triton X-100 diluito in PBS nel braccio del reagente.
      3. Inserire un vaso di reagente contenente tampone bloccante – 10% siero d'asino con 0,3% BSA in PBS nel braccio reagente.
      4. Inserire un potenniere di reagente contenente DAPI (1 μg·^mL-1) diluito in PBS nel braccio del reagente.
   5. Inserisci l'intero braccio del reagente (con i contenitori pronti) nel sistema.
   6. Seguendo le istruzioni sullo schermo, costruisci un protocollo di colorazione automatico che includa i seguenti passaggi da eseguire durante la notte:
      1. Cuoci a 60 °C per 10 ore.
      2. Incubare con 0,3% di Triton X-100 diluito in PBS (10 min).
      3. Lava con un reagente di lavaggio sfuso (routine preprogrammata).
      4. Incubare con il reagente di raccolta di epitopi 1 (ER1) (20 min, 100 °C).
      5. Lava con un reagente di lavaggio sfuso (routine preprogrammata).
      6. Incubare con il reagente Epitope Retrieval 2 (ER2) (20 min, 100 °C).
      7. Lava tre volte con un reagente di lavaggio in massa (routine preprogrammata).
      8. Incubare con il buffer di blocco - 10% siero dell'asino e 0,3% BSA in PBS (1 ora).
      9. DAPI (1 μg·^mL-1 in PBS) quattro volte per 5 minuti ciascuna.
      10. Lavaggio (routine preprogrammata).
   7. Assicurati che tutti i volumi di addizione siano impostati a 150 μL e che il passaggio di preparazione sia impostato su dewax tramite il menu a tendina.
   8. Aggiungi dettagli per fino a 30 diapositive e stampa etichette con codici a barre.
   9. Rimuovi il vassoio per scorrevoli e inserisci i vetri rivolti verso l'alto. Aggiungi delle tessere di copertura su ogni carrello rivolte verso l'alto. Metti le etichette del codice a barre in modo che si leggano dall'alto verso il basso sulla diapositiva.
   10. Rimetti il vassoio slitto nell'autotintore e blocca tramite il tasto anteriore del vassoio.
   11. Premi il pulsante di avvio per ogni braccio del carrello attualmente carico di carrelli.
       Nota: Il protocollo completo richiede ~15 ore per essere eseguito (inclusa la cottura di 10 ore). L'orario di inizio può essere ritardato per risparmiare lavaggi da reidratazione.
   12. Montare le slide in portaslitte senza slip al termine del ciclo.
4. Portaslitte senza slip per il copricapo di carico
   1. Inserisci le slitte nel portaslip senza coperchissone, assicurandoti di allineare i bordi superiore e destro contro i fermi metallici.
   2. Blocca il carrello in posizione con le camme in plastica (usando entrambe contemporaneamente) girando in posizione chiusa a catena.
   3. Controlla che il carrello sia completamente piatto e non oscilli all'interno del supporto.
   4. Posizionare la camera dell'inserimento del portaslip senza coprislip sopra la slitta, pizzicando le barre laterali con entrambe le mani per limitare la pressione e prevenire roture.
   5. Carica il portaslitte senza scivolamento tramite la porta di ingresso con un mezzo di montaggio da 2 mL contenente il 50% di glicerolo in PBS.
   6. Aggiungi un'etichetta con codice a barre direttamente sulla slide sul lato sinistro della slide in entrambe le orientazioni.
   7. Procedi alle immagini.

2. Imaging multiplex

1. Selezione delle regioni e imaging autofluorescenza
   1. Apri il software di acquisizione di immagini multiplex (ad esempio il workflow Mx (4.2.0.4)) e crea un protocollo con i round/biomarker e i tempi di esposizione richiesti usando il supporto del publisher del protocollo.
      Nota: Determinare in anticipo l'assegnazione di ciascun anticorpo ai canali disponibili. Limita i marcatori deboli (cioè quelli che richiedono tempi di esposizione più alti) ai canali Cy5 e Cy7 che hanno la minore autofluorescenza. Un massimo di 4 anticorpi per colpo può essere utilizzato nel sistema di immagini a fluorescenza multiplex.
   2. Se sono necessarie immagini virtuali H&E, assicurati che il canale Cy3 venga acquisito.
   3. Aggiungi le slide a un protocollo (usando il numero di codice a barre) tramite lo strumento batch creator per creare un flusso di lavoro di esperimenti multiplex.
   4. Carica il vetrino nel microscopio tramite il software di acquisizione (4.2.0.4) e segui il flusso di lavoro disegnando le regioni di interesse tramite i passaggi di imaging 2x e 10x per ogni vetrina. Quando selezioni le regioni, assicurati che ogni campo visivo abbia almeno due vicini per evitare problemi di cucitura.
   5. Minimizza la quantità di vetro vuoto fotografato per evitare problemi di cucitura e riduci i tempi di esecuzione non selezionando campi vuoti.
   6. Esegui l'imaging autofluorescenza 20x utilizzando i tempi di esposizione impostati nel passo 2.1.1 e segui il wizard di controllo qualità (QC). Conferma visivamente che non ci siano aree o artefatti fuori fuoco. Se questi vengono identificati, fallisci il controllo qualità e si riimmagine.
      Nota: Non esiste una misura unica della stringenza accettabile del controllo qualità, e il successo dipenderà dalle letture sperimentali richieste e da quanto sia prezioso il campione. Il tessuto a fuoco con sufficiente intensità di colorazione dovrebbe idealmente apparire visivamente nitido e chiaro. Spesso si osservano piccole aree di distacco/degradazione del tessuto, che non migliorano con ulteriori immagini e possono essere tollerate se il resto del campione ha effettuato una buona imaturazione. Se vengono osservati grandi artefatti luminosi (ad esempio polvere), è meglio rimuoverli pulendo il vetrino e facendo una nuova immagini.
   7. Genera immagini di sfondo che verranno sottratte dal segnale finale del biomarcatore, in un processo che si ripete per ogni round multiplex.
      Nota: Tutti i round multiplex saranno allineati automaticamente tramite il software di acquisizione.
2. Uso del robot per il manipolatore di piastre
   1. Assicurati che il software di acquisizione sia chiuso.
   2. Apri il software di integrazione robotica e clicca su start.
   3. Inserisci il portaslip senza copertura impilato nello stack di input.
   4. Assicurati che lo stack di output sia vuoto.
   5. Apri il software di controllo Robotic Plate Handler (ad esempio software robotico Harmony (3.2.0)) e segui il wizard, assicurandoti che il tipo e il numero di targa corretti siano selezionati.
   6. Clicca start e il responsabile della piastra caricherà il microscopio, che riconoscerà automaticamente la fase corretta del flusso di lavoro grazie al codice a barre del vetrino.
      NOTA: Se si utilizza il caricatore robotico per i passaggi di biomarcatore di seguito, è essenziale deselezionare l'opzione "tempi di esposizione dinamicamente impostati" nel software e utilizzare tempi di esposizione preimpostati.
3. Colorazione sequenziale di biomarcatori, inattivazione di coloranti e imaging multiplex
   1. Anticorpi centrifugi a 13.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per limitare i reperti.
   2. Prepara la soluzione di anticorpi in PBS contenente lo 0,3% di BSA.
      Nota: Le concentrazioni finali degli anticorpi varieranno, ma una diluizione 1:200 è un buon punto di partenza per l'ottimizzazione di un nuovo anticorpo.
   3. Rimuovi il supporto di montaggio pipettando fuori dalla porta del portaslitte senza slip e lava aggiungendo 2 mL PBS contenenti 0,01% Tween per 5 minuti (ripeti questo passaggio tre volte).
   4. Rimuovere PBS ed eseguire la colorazione degli anticorpi pipettando una soluzione di anticorpi da 350 μL diluita in PBS nel port. Questo volume è stato ottimizzato per garantire una copertura completa del campione all'interno della camera di colorazione.
   5. Incuba per 1 ora a temperatura ambiente sul piano di lavoro.
   6. Rimuovere la soluzione di anticorpi pipettando fuori dal porto del portavetrino senza slip e lava aggiungendo 2 mL di PBS contenente 0,01% Tween per 5 minuti (ripeti questo passaggio tre volte).
   7. Rimuovi PBS e aggiungi un supporto di montaggio da 2 mL.
   8. Inserire il portavetri senza copertura nel microscopio per avviare un passaggio automatico di imaging specifico per il round.
   9. Una volta completato, prosegue il flusso di lavoro passando i passaggi di controllo qualità come indicato sullo schermo.
   10. Rimuovi il supporto di montaggio pipettando fuori dalla porta del portaslitte senza slip e lava aggiungendo 2 mL PBS contenenti 0,01% Tween per 5 minuti (ripeti questo passaggio tre volte).
   11. Preparare frescamente la soluzione di inattivazione del colorante contenente 7 mL ddH₂O, 2 mL 0,5M_{NaHCO 3} e 1 mL 30% H_{2O 2}. Prepara questa soluzione immediatamente prima dell'uso e applica ai vetri senza indugio.
       Attenzione: il perossido di idrogeno deve essere maneggiato con DPI di laboratorio appropriati.
   12. Rimuovere PBS e aggiungere 2 mL di inattivazione di colorante per vetrina immediatamente dopo che H_2O2 è stato aggiunto alla soluzione operativa.
   13. Incuba per 15 minuti sul piano di lavoro nel portaslide.
   14. Rimuovere la soluzione di inattivazione del colorante pipettando dalla porta portavetri senza slip e lavare per 5 minuti in 2 mL PBS contenente 0,01% Tween.
   15. Rimuovi PBS e aggiungi un supporto di montaggio da 2 mL.
   16. Inserire il portaportavetri senza copertura nel microscopio per avviare l'imaging automatico a autofluorescenza specifico per round 20x.
   17. Una volta completato, prosegue il flusso di lavoro passando i passaggi di controllo qualità come indicato sullo schermo.
   18. Ripeti i passaggi da 2.3.1 a 2.3.17 per tutti i round/marcatori necessari. (La procedura è stata validata dal produttore fino a 10 colpi, anche se l'integrità dei tessuti sarà il principale determinante di questo limite).

3. Analisi automatizzata HighPlex tramite software di patologia digitale

1. Caricamento dei dati e segmentazione TMA
   1. Trascina e rilasci immagini IF multiplexate nella scheda "studi" nel software di patologia digitale.
      1. Le immagini virtuali H&E devono essere importate separatamente.
   2. Per i campioni di microarray tissutale (TMA) si utilizza il "modulo TMA". Questo permette l'etichettatura core-by-core, rendendo il tracciamento dei dati molto più semplice rispetto alla gestione della slide nel suo insieme.
   3. Per creare un blocco TMA, prima naviga fino alle azioni del blocco e crea una nuova mappa TMA.
      1. Questo può essere inserito manualmente o utilizzando un foglio Excel tramite la wizard di importazione.
   4. Segmenta il TMA cliccando con il tasto destro sul campione nella scheda studi e selezionando "Segment TMA".
   5. Seleziona la dimensione dei core e allineali alla mappa spostando le caselle rosse. Clicca su salva una volta completato.
   6. L'analisi e l'esportazione dei dati possono ora essere eseguite in modo core-wise.
      Nota: La pipeline seguente può essere eseguita anche su sezioni tissute complete senza l'uso del modulo TMA.
2. Segmentazione a bersaglio singolo
   1. Naviga nella scheda analisi.
   2. Nel menu a tendina "azioni impostazioni" clicca su carica e seleziona il modulo di analisi della fluorescenza HighPlex.
      1. Per questi risultati è stata utilizzata la versione 5.2.2.
      2. Nella selezione dei coloranti, compila i marker in valutazione manualmente o tramite la funzione "autofill tinte".
      3. Nel rilevamento nucleare si seleziona un tipo di segmentazione appropriato alla versione di HALO (qui viene descritta la versione tradizionale, non AI).
      4. Imposta la soglia di contrasto nucleare per rilevare i nuclei (di solito nell'intervallo 0,4 – 0,6).
         1. Imposta l'intensità nucleare minima per captare i nuclei (di solito non inferiore a 0,05).
         2. Riduci la luminosità massima dell'immagine a circa 0,4 a seconda dell'intensità del segnale DAPI (ridotta da 1 a causa della gamma dinamica delle immagini a 16 bit).
         3. Regolare ulteriori parametri, come l'aggressività della segmentazione, i fori di riempimento e i filtri di dimensione, a seconda del tipo di tessuto.
      5. Ripetiamo questo processo per la rilevazione di membrane e citoplasmi.
         1. Per la rilevazione tradizionale del citoplasma, un raggio del collare tra 2 e 5 è spesso un buon punto di partenza.
3. Selezione positiva della soglia per biomarcatori
   1. Ogni biomarcatore selezionato nella fase di selezione del colorante sarà misurato per valori di intensità grezza.
   2. Imposta una classificazione di soglia binaria (positiva vs negativa) o multipla (alta, media, bassa, negativa) per ogni marcatore, regola i valori usando i cursori nei compartimenti nucleare, citoplasmatico o membrana a seconda del modello di colorazione.
      1. Per impostare una soglia binaria, si regola solo il cursore inferiore per determinare il valore di taglio.
      2. Valuta le prestazioni usando la finestra di regolazione in tempo reale nel menu "Analizza" e attivando o disattivando la maschera di analisi per confrontare con i livelli di colorazione grezza.
   3. Crea combinazioni di marcatori utilizzando la funzione "fenotipi".
      1. La gate logica include AND/O positivi/negativi per tutti i marcatori, permettendo di costruire una matrice illimitata su tutte le colorazioni.
   4. Imposta i dati di memorizzazione degli oggetti su true se sono necessari dati a singolo target (richiesti per l'analisi spaziale).
   5. Salva il protocollo e nella scheda studi evidenzia tutte le slide per analisi, clic destro e analisi con il protocollo desiderato.

4. Revisione dei risultati

1. Valutazione spaziale nel software di patologia digitale
   1. Visualizza tutti i risultati nella "scheda risultati" del software digitale di patologia.
   2. La tabella riassuntiva in alto sarà costituita dalle medie di tutte le caratteristiche dell'immagine corrente.
      1. Questo sarà per un singolo nucleo se aperto separatamente.
   3. La tabella inferiore mostrerà i dati del singolo target per ogni caratteristica.
      1. Interroga i singoli dati selezionando dalla tabella o cliccando sull'immagine.
   4. Filtrare fenotipi, indicatori positivi o soglie di intensità nelle colonne appropriate. Questi possono poi essere tracciati navigando per: "azione oggetto" > "grafico" > "grafico spaziale".
   5. Una volta che questo è stato fatto per diversi gruppi, si può effettuare un'analisi spaziale.
   6. Selezionando il pulsante "analisi spaziale" e selezionando le opzioni secondo necessità:
      1. Vicino più prossimo: Trova la distanza dall'osservazione più vicina di un tipo di cella specificato rispetto a un altro.
      2. Analisi di prossimità: Misura in bande attorno a un tipo cellulare selezionato e quantifica sia il numero che la distanza di qualsiasi altro tipo di cellula.
      3. Analisi di infiltrazione: Misura in bande la distanza in uno strato di annotazione specificato (segnalato sull'immagine tramite lo strumento di annotazione) in cui viene trovato un particolare tipo di cella.
      4. Heatmap della densità: Genera una visualizzazione della distribuzione di un tipo di cella all'interno dell'immagine.
   7. L'analisi spaziale può essere eseguita su tutti i core TMA tramite il pulsante "risultati macchi" sotto le azioni slide e il menu a tendina "azioni risultati".
2. Esportazione dei risultati da Software di Patologia Digitale
   1. I risultati possono essere esportati dalla scheda TMA navigando nelle "azioni slide" > "esporta".
   2. Solo dati riassumtivi o l'analisi completa del singolo obiettivo possono essere esportati tramite la scheda avanzata.
   3. Generare dati come file .csv che possono poi essere analizzati in software come R per generare un'analisi a livello di popolazione dell'intensità dei biomarcatori in tutte le cellule. Le caratteristiche di un singolo oggetto includono: ID campione, ID unico dell'oggetto (per cellula), valori grezzi di intensità per ogni marcatore, classificazioni fenotipiche e coordinate spaziali.

Risultati

10-plex IF e H & virtuale abbinato Sono state generate immagini elettroniche per 136 nuclei di microarray tissutali che coprono 34 tipi di tessuto umano su due vetrine preparate con metodologie diverse (Figura 2). Queste immagini rappresentative dimostrano una colorazione multiplex di successo con morfologia tissutale preservata e una chiara rilevazione di più biomarcatori attraverso i nuclei di microarray tissutali. Una slitta utilizzava il tintore automatico per vetri, l'altra il processo manuale di preparazione delle vetrine. Una maggiore incidenza di artefatti tissutali è stata osservata con il metodo manuale basato su camera di decloaking, inclusi distacco di tessuto, così come carote perse o scivolate (Figura 3). Questi artefatti riducono la regione tissutale analizzabile per campione o carota, influenzando così l'analisi multiplex a valle. Queste osservazioni confermano che il protocollo consente una colorazione multiplex affidabile e imaging su diversi tipi di tessuti.

L'imaging multiplex riuscito è indicato da una morfologia tissutale preservata, un allineamento costante tra i round di colorazione e una rilevazione chiara e specifica del segnale di biomarcatore. Al contrario, gli esiti subottimali sono caratterizzati da distacco tissutale, perdita di segnale o artefatti di imaging che riducono le regioni analizzabili e compromettono l'analisi a valle.

Successivamente, il profilo di colorazione di marcatori tra cui PANCK (tessuto epiteliale), CD31 (tessuto endoteliale), aSMA (tessuto stromale), cheratina 15 (K15; epitelio basale), vimentina (cellule mesenchimatose), Ki67 (marcatore di proliferazione), CD8 (cellule T citotossiche) e FOXP3 (TREG), è stato confrontato tra entrambe le tecniche di preparazione delle vetrine, con una lieve riduzione del segnale osservata qualitativamente (visivamente) con il metodo manuale (Figura 4A)). Utilizzando soglie di classificazione dei biomarcatori nel software di patologia digitale, i campioni sono stati stratificati in popolazioni positive e negative per ciascuna delle ~630K cellule presenti nel dataset (Figura 4B). La valutazione quantitativa del segnale dei marcatori è stata effettuata utilizzando misurazioni di intensità derivate dal flusso di lavoro di analisi patologica digitale. Le stime della densità di popolazione (dove l'area sotto la curva rappresenta il 100% della popolazione) e i valori mediani di intensità hanno mostrato aumenti modesti di 5/8 biomarcatori all'interno di popolazioni positive utilizzando il coloratore automatico per vetri rispetto al processo manuale (Figura 4C).

Completando il pannello, i marcatori sopra descritti sono stati poi abbinati ad ulteriori biomarcatori per Lamin B1 (membrana nucleare) e p16 (inibitore della chinasi dipendente da ciclina), permettendo la visualizzazione dell'abbondanza e distribuzione relativa dei tessuti di tutti e 10 i marcatori in un singolo campione (Figura 5). La capacità di profilare un gran numero di biomarcatori è di particolare utilità nel campo della senescenza, che si basa sulla valutazione di più marcatori ortogonali per garantire una classificazione^{valida 2}. Qui siamo riusciti a profilare i cambiamenti nell'intensità della Lamin B1 all'interno delle popolazioni alte e basse di p16. È importante sottolineare che, essendo un campione multiplex, queste cellule potevano essere inserite in un contesto spaziale, confrontandole con la distribuzione di altri tipi cellulari all'interno dello stesso tessuto (Figura 6A). Attraverso la soglia di classificazione del Digital Pathology Software, questa colorazione è stata quantificata per dimostrare che le cellule p16 positive erano associate a livelli più bassi di Lamin B1 rispetto alle loro controparti negative (Figura 6B), un profilo coerente con i pattern marcatori associati alla senescenza descritti^{in precedenza 12}. Abbiamo anche osservato che le cellule Lamin B1 negative presentavano livelli più elevati di p16 (Figura 6C). Utilizzando la funzione fenotipica del Digital Pathology Software (che classifica le cellule in base alla segmentazione e alla soglia di più marcatori), la combinazione di questi marcatori è stata poi utilizzata per definire una popolazione di cellule come senescenti, cioè sia p16 positive che Lamin B1 negative. Successivamente, la proporzione di queste cellule in tutti i nuclei per tipo di tessuto è stata quantificata, insieme a ciascuno dei 10 marcatori individualmente (Figura 6D). Questo risultato consente il confronto quantitativo delle popolazioni cellulari definite da biomarcatori tra più tipi di tessuto all'interno del dataset multiplex. Sebbene la pipeline di analisi operi a livello di singola cellula, il dataset attuale è presentato principalmente utilizzando distribuzioni a livello di popolazione. L'abbondanza relativamente bassa di cellule positive a p16 in questo dataset potrebbe limitare la potenza statistica per un'analisi robusta di correlazione cellula per cellula tra p16 e Lamin B1, e quindi tali relazioni devono essere interpretate con cautela.

Figura 1: Schema che mostra il flusso di lavoro completo dell'immunofluorescenza multiplex. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica dell'imaging multiplex: (A-B): Virtual H & Immagini elettroniche generate dalla colorazione DAPI e dall'autofluorescenza Cy3 del primo round per visualizzare l'integrità tissutale delle vetrine preparate utilizzando il coloratore automatico o processi manuali di preparazione delle vetrine. (C-D): Colorazione multiplex IF di tutti i biomarcatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di tipi di artefatti: Esempi rappresentativi di diversi tipi di artefatti che possono essere generati principalmente durante la preparazione delle vetrine. Il distacco parziale di tessuto può essere osservato come aree fuori fuoco e può causare problemi di allineamento dei tessuti nei cicli successivi. I nuclei mancanti riducono la potenza sperimentale e spesso si verificano in modo sproporzionato nei tipi di tessuto delicato. I carote scivolate o sovrapposte si verificano quando un carote si stacca dalla sua posizione sulla TMA ma si aggrappa a un'altra regione, aggravando la perdita di campione rendendo difficile l'analisi del nucleo nascosto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto tra autocoloratore BOND e segnale di fluorescenza per preparazione manuale delle vetrine: (A): Colorazione rappresentativa IF per marcatori strutturali pan-citocheratina (PANCK), CD31 e actina muscolo liscio alfa (aSMA). Una fusione di queste tre immagini è mostrata nella prima colonna. (B): Maschere di analisi binaria di classificazione del software di patologia digitale, che indicano il rilevamento di marcatori positivi su diversi tipi cellulari: CD31 (rosso), FOXP3 (turchese), Ki67 (giallo), CD8 (bianco), PANCK (verde). La scatola bianca indica la regione di zoom digitale nei pannelli inferiori. (C): Quantificazione dell'intensità dei biomarcatori nelle popolazioni cellulari raggruppate per metodo di preparazione tissutale (un coloratore automatico di vetrine = rosso, Manuale = blu) e positività dei marcatori (scuro = negativo, chiaro = positivo). L'area sotto ciascun grafico di densità rappresenta il 100% della popolazione cellulare analizzata. AF = Autofluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Panel multiplex completo: immagini rappresentative dal tessuto appendice che mostrano A-B: pannello intero 10-plex IF C: PANCK (verde), D: CD31 (rosso), E:aSMA (giallo), F: K15 (rosa), G: Vimentina (bianco), H: Lamin B1 (turchese), I:p16 (oro), J: Ki67 (giallo brillante), K: CD8 (verde brillante) e L: FOXP3 (viola). Scatola bianca = zoom digitale (Merge, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16), scatola tratteggiata = zoom digitale (Ki67, CD8, FOXP3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Rilevamento dei marcatori di senescenza: (A): FI rappresentativo da immagini del tessuto pancreas che mostrano modelli di colorazione contrastanti tra Lamin B1 (turchese) e p16 (oro) insieme a una relazione spaziale con altri marcatori PANCK (verde), CD31 (rosso) e Vimentin (bianco). (B): Quantificazione dell'intensità del nucleo della Lamina B1 (LB1) in popolazioni cellulari positive e negative di p16. (C): Quantificazione dell'intensità cellulare p16 nelle popolazioni cellulari positive e negative di Lamin B1 (LB1). L'area del grafico di densità sotto la curva rappresenta il 100% della popolazione. (D): Mappa termica normalizzata del punteggio Z della percentuale media di positività del nucleo per ciascun biomarcatore o fenotipo di senescenza (p16+/LB1-ve) tra i tipi di tessuto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'imaging IF multiplexato tramite piattaforme automatizzate facilita la generazione di profili sfumati di un ampio pannello di biomarcatori all'interno di singole sezioni^{tissutali 13}. Quando abbinato a software di patologia digitale, come HALO, questo permette di interrogare sia l'abbondanza che le relazioni spaziali dei tipi cellulari, sia tra loro sia rispetto alla loro distribuzione attraverso diverse strutture^{tissutali 3}. Questo ha il potenziale di portare un valore significativo al campo della senescenza, che si basa su combinazioni di profilazione dei segni distintivi per una classificazione robusta delle cellule senescenti, che a loro volta si dimostrano possedere un'eterogeneità significativa e quindi richiedono una profilazione cellulare bersaglio singola impossibile con sezioni tessuti^{sequenziali 14}. Inoltre, il carico cellulare senescente varia tra i tessuti, può accumularsi a ritmi diversi durante l'invecchiamento e vi è una scarsità comprovata di marcatori in vivo affidabili di senescenza, rendendo desiderabile la capacità di utilizzare un panel più ampio di biomarcatori in contesti nuovi dove può essere richiesta maggiore^{flessibilità 5,15,16}. È importante sottolineare che studi precedenti hanno dimostrato che l'accumulo e la dinamica temporale delle cellule senescenti sono fortemente dipendenti dal tessuto, con una notevole variazione sia nell'abbondanza che nell'insorgenza tra i sistemi d'organo, evidenziando che la senescenza non avviene in modo sincrono tra i tessuti. Tecniche alternative di profilazione spaziale, come la trascritomica spaziale o la citometria di massa per imaging, possono fornire informazioni molecolari complementari; tuttavia, l'immunofluorescenza multiplex misura direttamente l'espressione proteica e consente un'analisi spaziale ad alta risoluzione dei fenotipi cellulari all'interno di sezioni tissutali intatti. La natura sequenziale del multiplex IF si presta anche a una pipeline di discovery iterativa.

L'imaging multiplex IF può essere eseguito in flussi di lavoro ad alta produttività integrandosi con un coloratore automatico di diapositive. Oltre a fornire vantaggi significativi in termini di standardizzazione, la preparazione automatica delle vetrine sembra anche portare a meno artefatti rispetto all'uso di un approccio manuale basato su camere di decloaking, poiché sono stati osservati meno distacco di tessuto e perdita di carote. Tuttavia, queste osservazioni si basano su confronti qualitativi e sarebbe necessaria un'ulteriore valutazione quantitativa per stabilire formalmente le differenze nei danni tissutali indotti dal processamento. Questa è una preoccupazione particolare nei tipi di tessuto adiposo come la pelle e il seno. Inoltre, il sistema Coverslipless Slide Holder consente l'integrazione con i manipolatori robotici di piastre, consentendo una maggiore produttività e riducendo il tempo dell'operatore facilitando miglioramenti del flusso di lavoro come le esecuzioni di imaging notturne. Sebbene si preveda che l'automazione migliori la produttività e la standardizzazione, il benchmarking quantitativo di questi miglioramenti non è stato valutato formalmente in questo studio e dovrebbe essere interpretato come un'osservazione pratica piuttosto che come un risultato misurato. Con i campioni preparati come microarray tissutali, diventa fattibile generare queste analisi complete per centinaia di campioni di pazienti su un numero relativamente basso di vetrine, il che potrebbe facilitare studi futuri che indagano cellule senescenti in campioni di tessuto^{clinico 5,11}.

Sebbene siano stati osservati lievi aumenti delle intensità dei marcatori tramite il coloratore automatico rispetto al processo manuale di preparazione del vetrino, in pratica questo vantaggio è minimo, poiché il basso segnale può solitamente essere superato tramite tempi di esposizione più lunghi o aggiustamenti alle soglie di analisi. Diversi passaggi chiave influenzano in modo critico il successo del saggio, tra cui l'ottimizzazione degli anticorpi, la progettazione dei pannelli multiplex e la selezione dei parametri di imaging. Una validazione attenta della compatibilità degli anticorpi, dell'intensità del segnale e della resistenza ai cicli di colorazione ripetuti è essenziale per garantire dati multiplex riproducibili e di alta qualità. Molto più importante è l'ottimizzazione dei round e la selezione dei canali dei biomarcatori. Questi vengono valutati su campioni di prova singolarmente e in combinazione, per garantire la mancanza di reattività incrociata tra anticorpi, nonché per dimostrare che l'inattivazione dei coloranti e il rilevamento degli epitopi sono possibili nei cicli desiderati. Si raccomanda di utilizzare marcatori deboli o meno abbondanti nei canali Cy5 e Cy7, che tipicamente mostrano una minore autofluorescenza. Il pannello finale viene testato nel tipo di tessuto di interesse, poiché alcuni tessuti di ottimizzazione ampiamente utilizzati (ad esempio le tonsille) spesso richiedono concentrazioni e tempi di esposizione inferiori rispetto agli ambienti sperimentali, che possono differire anche in proprietà come l'autofluorescenza. Tuttavia, tali tessuti di controllo positivo possono essere utili quando la presenza di tipo cellulare è incerta nei tessuti sperimentali, poiché la mancanza di segnale non può essere facilmente differenziata dall'assenza di cellule bersaglio. La diligenza in queste ottimizzazioni del panel all'interno del tipo di tessuto bersaglio è il passo sperimentale più critico per garantire un test di successo, al fine di minimizzare la perdita di biomarcatori nelle esperimenti finali. La maggior parte dei problemi sorge a causa di reazioni incrociate di anticorpi, segnale insufficiente dovuto a basse concentrazioni di anticorpi o basso rapporto segnale-rumore nei canali FITC/Cy3. Inoltre, la conservazione dell'antigene sotto ripetuti passaggi di inattivazione del colorante dipende sia dagli anticorpi che dal tessuto, rendendo necessaria ulteriormente l'uso di passaggi di ottimizzazione complessiva per garantire la selezione di composizioni di panel/round appropriate per i campioni sperimentali. Un limite chiave dei flussi di lavoro di immunofluorescenza multiplex è la dipendenza da anticorpi di alta qualità, insieme alla stabilità degli epitopi attraverso cicli ripetuti di colorazione e inattivazione dei coloranti.

Nel complesso, l'imaging multiplexato, abbinato a piattaforme di automazione, rappresenta un cambiamento radicale nella sofisticazione per la valutazione IF dei campioni di tessuto in vivo , facilitando un'analisi spaziale completa di pannelli complessi di biomarcatori a livello di singola cellula. Le applicazioni future di questo flusso di lavoro includono la profilazione su larga scala di biomarcatori associati alla senescenza tra diversi tipi di tessuto e l'integrazione con approcci emergenti di space omics per risolvere ulteriormente l'eterogeneità cellulare in ambienti tissutali complessi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
30% Hydrogen Peroxide (H2O2)	Merck	H1009
Antigen unmasking solution 1 (H3300) (ARS1)	Vector Labs.	H-3300	Preparare con 12,5 ml Antigen Unmasking Solution + 237,5 ml ddH2O
Antigen unmasking solution 2 (ARS2)	Sigma	T6066 / E5134	Preparare 10x stock (12,9 g Trizma base, 3,7 g EDTA, 5 mL Tween 20, 995 mL ddH20).
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A2153
Bulk Dewaxing Solution	Leica	AR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)	Leica	AR9961
Bulk  Epitope Retrieval (ER2)	Leica	AR9640
Bulk Wash Solution	Leica	AR9590
DAPI	Merck	D3571
Doubled distilled water (ddH20)	N/A	N/A
DMSO	Merck	472301
Donkey Serum	Merck	D9663
EDTA	Merck	E5134
Glycerol	Merck	G5516
NaHCO3	Merck	S5761
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	BP399
Propyl Gallate	Merck	P3130
Sodium Bicarbonate	Merck	S5761
Triton X 100	Merck	H5141
Trizma Base	Merck	T6066
Tween20	Merck	P1379
Altri materiali di consumo o attrezzature
Decloaking chamber	BioCare	DC2012
Steam strips	BioCare	613QC
Bond RXm Auto Slide Stainer	Leica	HIS2330	Noto come tintore automatico per vetrini
Cell DIVE	Leica	29429159	Noto come sistema di imaging a fluorescenza multiplex
Click Well slide holders	Leica	29463259	Noto come Supporto per vetrini senza coperchi Well
Elenco degli anticorpi
CD31 (Pecam-1)	Cell Signalling	61255	Clone: 89C2 Fluorofor: AF555 Diluizione: 1 su 50
CD8a	BioLegend	372906	Clone: C8/144B Fluorofor: Alexa 647 Diluizione: 1 su 100
CDKN2A/p16	Santa Cruz	sc-56330 AF647	Clone: jc8 Fluorofor: Alexa 647 Diluizione: 1 su 200
FOXP3	BioLegend	320114	Clone: 206D Fluorofor: Alexa 647 Diluizione: 1 su 50
Keratin 15	Abcam	ab194065	Clone: EPR1614Y Fluorofor: AF_488 Diluizione: 1 su 200
Ki67	Abcam	ab215226	Clone: EPR3610 Fluorofor: AF555 Diluizione: 1 su 50
Lamin B1	Abcam	ab194106	Clone: EPR8985(B) Fluorofor: AF_488 Diluizione: 1 su 100
PanCK_AE1/AE3	Thermofisher	53-9003-82	Clone: AE1/AE3 Fluorofor: AF_488 Diluizione: 1 su 100
SMA	R&D systems	IC1420S	Clone: 1A4 Fluorofor: Alexa 750 Diluizione: 1 su 100
Vimentin	Cell Signalling	69227	Clone: D21H3 Fluorofor: Alexa 750 Diluizione: 1 su 100