Articolo metodologico

Isolamento dei periciti dal tessuto corticale del topo tramite FACS per il sequenziamento a singola cellula

DOI:

10.3791/69749

⸱

30 gennaio 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2International Center of Microvascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 3College of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per ottenere periciti corticali cerebrali di topo che soddisfano le esigenze dello scRNA-seq, presentiamo un protocollo FACS ottimizzato in modo critico basato sulla selezione CD13⁺/CD31⁻. I nostri principali perfezionamenti migliorano significativamente la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA, consentendo un profiling trascrittomico affidabile.

Abstract

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I periciti, in quanto componente centrale dell'unità neurovascolare, svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere l'integrità della barriera emato-encefalica e nella regolazione dell'omeostasi emodinamica cerebrale attraverso la modulazione del tono microvascolare. La disfunzione dei periciti è stata implicata in una varietà di disturbi neurologici. Per indagare l'eterogeneità dei periciti e chiarire i loro meccanismi nelle malattie neurovascolari a risoluzione unicellulare, abbiamo stabilito un protocollo ottimizzato e riproducibile per l'isolamento dei periciti cerebrali di topo adatti al sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq). Questo metodo si basa sulla strategia consolidata di ordinamento CD13+/CD31, ma incorpora miglioramenti chiave specificamente adattati alle applicazioni scRNA-seq. Per un breve periodo, sono stati prelevati cervelli da tre topi adulti C57BL/6. I tessuti cerebrali sono stati dissociati meccanicamente e sottoposti a digestione enzimatica per ottenere sospensioni a singola cellula. Dopo la centrifugazione sequenziale, la pellet cellulare finale è stata risospensa in una soluzione al 20% di albumina sieroca bovina (BSA), un passaggio fondamentale che abbiamo introdotto per minimizzare stress e aggregazione, massimizzando così la vitalità e la qualità dell'RNA per il sequenziamento. Questo approccio ottimizzato basato su FACS consente così l'isolamento robusto di periciti cerebrali di topo vitali che soddisfano i rigorosi requisiti per la scRNA-seq, offrendo uno strumento potente per dissezionare l'eterogeneità dei periciti e i loro ruoli patologici nelle malattie neurovascolari.

Introduzione

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I periciti sono un tipo importante di cellula situata lungo i microvasi, tipicamente inseriti nella membrana basale capillare e che avvolgono le celluleendoteliali 1. Nel cervello, i periciti, insieme alle cellule endoteliali, agli astrociti e ad altri tipi cellulari, formano l'unità neurovascolare e sono parte integrante della struttura e funzione della barriera emato-encefalica (BBB). I periciti svolgono ruoli essenziali nella regolazione del flusso sanguigno cerebrale, nel rimodellamento vascolare e nel mantenimento dell'omeostasi vascolare. Mantengono l'integrità del BBB attraverso interazioni fisiche strette e segnalazione paracrina con le cellulevicine 2; regolano dinamicamente il trasporto transendoteliale tramite endocitosi ed espressione di specifiche proteine trasportatrici; e contribuiscono alla stabilità emodinamica cerebrale attraverso le loro attività contrattili erilassanti 3. La disfunzione dei periciti, così come alterazioni nella loro copertura o densità, può portare a disregolazione vascolare e deficit neurologici, portando infine a cambiamenti patologici associati a vari disturbineurologici 4. Tuttavia, l'eterogeneità intrinseca dei periciti pone sfide significative per ulteriori studi meccanicistici.

Con il progresso della tecnologia di sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq), un numero crescente di studi ha utilizzato lo scRNA-seq per esplorare l'eterogeneità cellulare e identificare bersagli chiave nella patogenesi e nella progressione delle malattie. I marcatori pericitari comunemente utilizzati includono il receptor-beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR-β)5, l'antigene gliale neuronale 2 (NG2) e l'actina muscolo-liscio alfa (α-SMA). Tuttavia, questi marcatori hanno una specificitàrelativamente bassa 6, poiché possono contemporaneamente etichettare altre cellule vascolari, come le cellule muscolari liscie, e cellule precursori neurali come le cellule progenitrici degli oligodendrociti, rendendo difficile distinguere i periciti da altre cellule cerebrali. In cerca di un'alternativa più robusta, ci siamo rivolti al CD13 (Aminopeptidasi N, APN), un marcatore ampiamente riconosciuto per la sua forte e costante espressione nei periciti cerebrovascolari in studiprecedenti 7,8,9,10. Nel nostro studio, abbiamo condotto una colorazione immunofluorescente su sezioni di tessuto cerebrale e i risultati hanno confermato l'espressione di CD13 nei periciti, dimostrandone l'efficacia nel distinguere periciti da cellule endoteliali, poiché il segnale CD13 era associato esclusivamente alle cellule perivascolari ed assente nelle cellule endoteliali CD31⁺. (Figura 1A). Tuttavia, è importante notare che l'espressione del CD13 non è del tutto esclusiva dei periciti; Livelli rilevabili sono osservati anche nelle cellule muscolari lisce di arteriole e venule (Figura 1B,C).

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Figura 1: La colorazione immunofluorescenza mostra l'espressione del CD13 nei periciti vascolari cerebrali e nelle cellule muscolari lisce, senza segnale rilevabile nelle cellule endoteliali. (A) Imaging immunofluorescenza rappresentativo della zona di transizione arteriolo-capillare nella microvascolatura cerebrale. L'immagine unita mostra periciti CD13⁺ (verde) che richiudono cellule endoteliali CD31⁺ (rosso). Le cellule muscolari lisce α-SMA+ (ciano) sono localizzate nella regione arteriolare e sono assenti nei capillari. (B) Sezione trasversale di un'arteriola. Le immagini mostrano una chiara co-localizzazione del pericita CD13⁺ (verde) e delle cellule muscolari lisce α-SMA+ (ciano) nello strato muscolare liscio circostante, confermando l'espressione del CD13 nelle cellule muscolari lisce arteriolari. (C) Sezione trasversale di una venula. Analogamente, CD13 (verde) è rilevabile nelle cellule muscolari lisce α-SMA (punte di freccia) della parete venulare. Barra di scala: 20 μm (A-C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ottenere periciti corticali vascolari di topo che soddisfano i requisiti per lo scRNA-seq, abbiamo eseguito un ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) utilizzando la marcatura degli anticorpi CD13⁺/CD31⁻ per l'isolamentopericito 11. Inizialmente, i marcatori CD45 e CD41 sono stati utilizzati per escludere le cellule ematopoietiche dalle sospensioni del tessutocerebrale 12. Successivamente, i periciti sono stati arricchiti selezionando cellule CD13+ , e le cellule endoteliali sono state ulteriormente escluse tramite gating per le popolazioni CD31, isolando così la popolazione target dipericiti 13.

Riconosciamo che la fase di selezione positiva al CD13 cattura contemporaneamente le cellule muscolari lisce che esprimono il CD13 sia dalle arteriole che dalle venule. Per soddisfare i requisiti critici per scRNA-seq e massimizzare la ritenzione dei periciti, abbiamo selezionato strategicamente questa combinazione di marcatori per dare priorità alla resa dei periciti nella fase di smistamento. Sebbene questo approccio porti alla co-isolamento di una popolazione minore di cellule muscolari lisce, massimizza efficacemente il recupero di tutti i potenziali periciti durante la fase preliminare di arricchimento. Questa strategia di gating a passo a passo riduce significativamente la perdita cellulare iniziale. Inoltre, per massimizzare la vitalità e la resa dei periciti, abbiamo utilizzato anche una soluzione BSA al 20% per la risospensione e filtrazione cellulare post-dissociazione, rimuovendo efficacemente i detriti preservando la vitalità e la purezza cellulare14 ordinate.

Utilizzando questo metodo, abbiamo distinguito con successo i periciti vascolari cerebrali da altri tipi cellulari, ottenendo preparazioni di periciti ad alta purezza e alta vitalità che soddisfano i rigorosi requisiti per la scRNA-seq. Questa tecnica fornisce una solida base per successive indagini approfondite sui ruoli dei periciti in vari contesti di malattia.

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Protocollo

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In questo studio, abbiamo utilizzato tre topi adulti C57BL/6J (3 mesi, 20-25 g). Tutti i topi sono stati alloggiati in un ciclo di 12 ore luce e buio con temperatura e umidità rigorosamente controllate, con libero accesso a cibo e acqua prima degli esperimenti. Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono animali da laboratorio sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Etica degli Animali da Laboratorio dell'Istituto di Microcircolazione, dall'Accademia Cinese delle Scienze Mediche e dal Collegio Medico dell'Unione di Pechino, e sono state condotte in rigorosa conformità con le linee guida pertinenti per il benessere animale.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Soluzione di glucosio al 30% (in peso/vol): Sciogliere 15 g di glucosio in 50 mL di dH2O UltraPure DNase/RNasi libera. Per garantire la completa dissoluzione, si aggiunge prima glucosio a 20 mL di UltraPure DNase/RNasi senza RNasi dH2O e mescola accuratamente. Poi aggiungi UltraPure DNase/RNasi senza dH2O a un volume finale di 50 mL. Filtra la soluzione e conserva a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
  2. DNasi I (10 mg/mL): Sciogliere 50 mg di DNasi I in 5 mL di ddH2Osterile. La soluzione di serie può essere conservata a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
    NOTA: I cicli ripetuti di congelamento-scongelamento devono essere rigorosamente evitati per prevenire la perdita di attività enzimatica. Per minimizzare gli effetti di congelamento-disgelo, si impongono 150 μL della soluzione in tubi microcentrifughe sterili prima del congelamento iniziale e si scongelano le individuali aliquote secondo necessità per gli esperimenti.
  3. Siero Fetale Bovino (FBS) al 2% (vol/vol) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): Prepara 1× PBS mescolando 5 mL di 10× PBS con 45 mL di UltraPure DNase/RNasisenzaRNasi 2 O. Aggiungi 1 mL di FBS a 49 mL di 1× PBS e mescola accuratamente.
    NOTA: Prepara questa soluzione da zero durante il Passaggio 2.1.2. Allocare 15 mL per ogni campione di tessuto.
  4. Soluzione di collagenasi e enzima dispasa (CD): Sciogliere separatamente 100 mg di Dispase e 100 mg di Collagenasi in 1 mL di UltraPure DNase/RNase senza RNasi2O ciascuno. Combinare le soluzioni per ottenere un volume finale di 2 mL (concentrazione enzimatica di 100 mg/mL).
    NOTA: Aliquot 500 μL in tubi microcentrifughe sterili e conservati a -20 °C. Vortice prima dell'uso per evitare la perdita di attività dovuta ai cicli di congelamento-disgelo. È importante notare che la forma in polvere può causare gravi irritazioni della pelle/occhi e difficoltà respiratoria. Maneggialo sempre con una cappa chimica mentre indossi guanti di nitrilo e una maschera N95. In caso di esposizione, irrigare immediatamente l'area interessata con acqua abbondante e cercare assistenza medica.
  5. Soluzione funzionante enzimatica CD: Mescolare 1,5 mL di soluzione stock enzimatica CD con 43,5 mL di FBS al 2% (vol/vol) in PBS (dal Passo 1.3) tramite inversione delicata.
    NOTA: Prepararsi immediatamente prima della dissociazione dei tessuti (Passo 2.3.4). Questo volume è ottimizzato per tre topi; Aggiusta proporzionalmente secondo necessità.
  6. Soluzione Percoll 22% (vol/vol): Combinare 11 mL di Percoll, 5 mL di PBS al 10× e 34 mL di UltraPure DNase/RNasi senza dH2O per preparare una soluzione da 50 mL.
    NOTA: Filtrare tramite una membrana PES da 0,22 μm. Può essere conservato a 4 °C per un mese senza una perdita significativa di stabilità.
  7. Buffer di dissociazione meccanica: Aggiungi 1 mL di DNasi I (10 mg/mL) a 10 mL di FBS al 2% (vol/vol) nel PBS (dallo Passo 1.3). Mescola tramite pipetta.
  8. Soluzioni BSA: Preparare soluzioni BSA 1%, 20% e 35% (peso/volume) separatamente come segue:
    1. 1% (peso/vol) BSA: Sciogliere 0,15 g di BSA in 15 mL di soluzione fisiologica tamponata (DPBS) di Dulbecco.
    2. 20% (peso/vol) BSA: Sciogliere 3 g di BSA in 15 mL di DPBS.
    3. 35% (peso/vol) BSA: Sciogliere 0,7 g di BSA in 2 mL di DPBS.
      NOTA: Filtrare tutte le soluzioni attraverso una membrana PES da 0,22 μm prima dell'uso.
  9. Soluzione Salina Bilanciata (HBSS)/BSA/Buffer di glucosio: Aggiungi 167 μL di glucosio al 30% (peso/vol) (dal Passo 1.1) e 1,4 mL di BSA al 35% (peso/volume) (dal Passo 1.8) a 50 mL di HBSS, mescola delicatamente.
    NOTA: Prepara questa soluzione fresca in condizioni sterili durante il Passaggio 2.1.2. Conserva a 4 °C fino all'uso.
  10. Cushion per la raccolta dei tessuti: Integrare 12 mL di HBSS/BSA/Glucosio Buffer (dal Passo 1.9) con 800 μL di DNasi I (10 mg/mL). Da usare per conservazione temporanea dei tessuti e per risciacquo di pipette.
    NOTA: Prepara questa soluzione fresca in condizioni sterili durante il Passaggio 2.1.2.
  11. Soluzione di tribromoetanolo 1,25% (p/v): Sciogliere 1,25 g di 2,2,2-Tribromoetanolo in 2,5 ml di 2-Metil-2-butanolo, poi aggiungere questa miscela a 97,5 ml di ddH2Osterile o soluzione fisiologica per ottenere una soluzione trasparente all'1,25% di tribromoetanolo.
    NOTA: Prepara la soluzione fresca prima di ogni utilizzo. Conservalo al sicuro dalla luce a temperatura ambiente e usalo prontamente.

2. Procedura sperimentale (usando tre topi come esempio)

  1. Preparazione pre-esperimento (Tempisti: 30 min)
    1. L'autoclave richiedeva consumabili e disinfezione degli strumenti chirurgici con etanolo al 75% (vol/vol).
    2. Preparare soluzioni operative: 1× PBS (dal Passo 1.3), FBS al 2% (vol/vol) in PBS (dal Passo 1.3), HBSS/BSA/soluzione di glucosio (dal Passo 1.9) e tampone di raccolta dei tessuti (dal Passo 1.10).
    3. Versa 10 mL di 1× PBS in una piastra per cellule da 10 cm e lasciala sul ghiaccio.
    4. Prepara tre fiale, aggiungi 3 mL di tampone per la raccolta dei tessuti a ciascuna e conservale sul ghiaccio.
    5. Prepara tre tubi centrifughe da 15 mL, aggiungi 10 mL di FBS al 2% (vol/vol) in PBS a ciascuno e conservali sul ghiaccio.
  2. Raccolta del cervello del topo (Tempistica: 30 min)
    1. I topi sono stati profondamente anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (dal Passo 1.11) a una dose di 0,2 mL per 10 g di peso corporeo. Dopo la perdita dei riflessi pedalali, l'eutanasia è stata eseguita tramite lussazione cervicale.
      NOTA: Se il topo non raggiungeva un piano chirurgico di anestesia (valutato in assenza di riflesso di astinenza del pedale) entro 5-10 minuti dall'iniezione, veniva somministrata una dose supplementare intraperitoneale di tribromoetanolo, pari a un terzo della dose iniziale.
    2. Spruzza la zona della testa/collo con etanolo al 75%. Fai un'incisione al cuoio capelluto mediano dalla regione occipitale a quella frontale per esporre il cranio. Eseguire un'incisione trasversale anteriore alle orbite bilaterali, seguita da incisioni laterali lungo i margini inferiori del cervelletto per staccare la base del cranio. Infine, incidere il calvario longitudinalmente lungo la sutura sagittale da posteriore a anteriore. Solleva il lembo cranico per esporre il cervello racchiuso nella dura. Sollevare delicatamente il cervello mentre si recidono i nervi ottici e la connessione midollo oblungato-midollo spinale con forbicichirurgiche 15. Metti il cervello intatto in una piastra da 10 cm contenente 10 mL di PBS gelato 1×.
      NOTA: Maneggiare delicatamente il tessuto per evitare danni.
    3. Trasferisci il cervello in carta stagnola. Usando la pinza, solleva la dura madre dai margini e stirala lungo i solchi mediani. Dopo la completa rimozione della dura, esponi lo spazio subaracnoidea. Risciacquare lo spazio subaracnoideo con soluzione HBSS, poi dissezionare i vasi con un ago smussato e rimuovere con cura la pia mater16. Dividere il cervello coronalmente in fette spesse 2-3 mm usando una lametta. Scartare le sezioni bulbo olfattivo e caudale. Isolare la corteccia cerebrale lungo il corpo calloso e trasferire il tessuto corticale in fiale contenenti 3 mL di tampone di raccolta del tessutogelido 11.
    4. L'isolamento dei periciti in questo protocollo prende di mira specificamente la corteccia cerebrale. Per altre regioni di interesse: posizionare le sezioni coronali in una diapositiva a due pozzi con una caduta del 2% (vol/vol) FBS in PBS. Identificare le regioni target sotto microscopia di disseczione, isolare manualmente e procedere con gli stessi passaggi di elaborazione successivi.
  3. Dissociazione tissutale (Tempismo: 3-3,5 h)
    1. Tritano i tessuti nelle fiavelle usando bisturi chirurgici in frammenti di circa 1 mm × 1 mm.
      NOTA: Completare la tritazione entro 5 minuti per preservare la freschezza dei tessuti.
    2. Pre-risciacquo le punte della pipetta con il tampone per la raccolta dei tessuti. Aspira lentamente i frammenti tritati verso l'apice della punta mantenendo l'orientamento verticale (punta verso il basso). Espellere delicatamente i frammenti in tubi centrifughe da 15 mL pre-raffreddati (preparati nello Passo 2.1.5).
      NOTA: Evitare di aspirare frammenti nella canna superiore per evitare l'aderenza alla parete della pipetta.
    3. Lavare le fiasole contenenti frammenti (dal Passo 2.3.1) con FBS al 2% (vol/vol) in PBS e trasferire il lavaggio ai tubi centrifuga. Centrifuga a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
    4. Scartare i soprannatanti dopo la centrifugazione. Risospendere i pellet in 3 mL di soluzione di lavoro enzimatica CD (dal Passo 1.5) per ogni provetta. Una quota di sospensione in tre tubi (totale 9 tubi, 1 mL/tubo), poi integra con 4 mL di soluzione di lavoro enzimatica CD (volume finale: 5 mL/tubo).
    5. Incubare i tubi in un forno ibrido a 37 °C per 100 minuti con scuotimento orbitale a 100 xg 14.
    6. Prepara la soluzione di dissociazione tissutale durante l'incubazione aggiungendo 1 mL di soluzione di DNasi I a 10 mL di FBS al 2% (vol/vol) in PBS (dallo Passo 1.10).
    7. Terminare la digestione centrifugando a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
      NOTA: Valutare l'efficienza digerente microscopicamente usando un'aliquota da 10-20 μL. L'estremità ideale si manifesta come frammenti vascolari simili a perle; I segmenti vascolari allungati indicano una sottodigestione, mentre le cellule singole predominanti indicano una sovradigestione.
    8. Sospendere pellet in 1 mL di soluzione di dissociazione tissutale per provetta. Dissocia meccanicamente pipettando 100 volte11.
      NOTA: Evitare l'aspirazione a volume completo della pipetta per minimizzare la formazione di bolle e preservare la vitalità cellulare.
    9. Mettere tutte le sospensioni (da un totale di 9 tubi di digestione che rappresentano i tessuti cerebrali di 3 topi) in un tubo centrifuga da 50 mL. Risciacquare ogni tubo digeritivo con 2 mL di FBS al 2% (vol/vol) in PBS e combinare i lavaggi. Centrifuga a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
    10. Dopo la centrifugazione, sono visibili strati distinti. Scartare con cura lo strato superiore (contenente impurità e piccoli detriti cellulari), mantenendo lo strato intermedio (composto da cellule o gruppi cellulari a densità inferiore) e lo strato inferiore (cellule intatte e frammenti di tessuto parzialmente non digeriti). Aggiungi 12,5 mL di soluzione al 20% di BSA e inverti delicatamente il tubo per risospendere i pellet. Centrifugare di nuovo a 1000 × g a 4 °C per 20 minuti.
    11. Raccogli il pellet inferiore (arricchito con cellule intatte di purezza superiore) e trasferisci il soprantantante (contenente principalmente detriti di mielina, lipidi e un piccolo numero di cellule) in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL. Risospendere con inversione dolce e ripetere centrifuga a 1.000 x g a 4 °C per 20 minuti.
    12. Risospendere ogni pellet ottenuto dai due passaggi di centrifugazione (passo 2.3.10 e passo 2.3.11) in 2 mL di FBS al 2% (vol/vol) in PBS ciascuno (volume combinato finale: 4 mL).
      NOTA: Evitare di toccare le pareti dei tubi durante la risospensione per minimizzare la contaminazione da detriti.
    13. Combinare le due sospensioni risospese del passaggio precedente in un tubo centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 300 × g, 4 °C per 5 minuti. Scartare il soprandanante (tampone di scarto contenente BSA, detriti cellulari e potenzialmente tracce di residui di lipidi mielicali). Risospendere il pellet (le cellule bersaglio intatte e purificate e lavate) in 2 mL di soluzione PBS contenente il 2% di FBS.
      NOTA: Questo passaggio consiste nel trasferire le celle in un buffer di sospensione pulito e adatto per applicazioni a valle.
    14. Preparare quattro tubi centrifughe da 15 mL, ciascuno contenente 4 mL di soluzione Percoll al 22%. Applicare delicatamente 0,5 mL aliquote della risospensione sul gradiente di Percoll (quattro aliquote in totale) per massimizzare la resa della cella. Centrifuga a 560 x g a 4 °C per 10 minuti.
      NOTA: Imposta la centrifuga su "nessun freno" per evitare una perturbazione del gradiente di densità indotta dal vortice, assicurando che i detriti di mielina rimangano stabili nel soprantantante.
    15. Aspira con cura i soprannatanti. Risospendere i pellet in 1 mL di HBSS/BSA/buffer di glucosio per provetta. Sospensioni a piscina in un nuovo tubo da 15 mL. Risciacquare i tubetti Percoll con 2 mL di HBSS/BSA/glucosio buffer e combinare i lavaggi. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 minuti).
  4. Preparazione e acquisizione della classificazione della citometria a flusso (Tempismo: 50 min)
    1. Aspira con cura il soprandante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di buffer HBSS/BSA/glucosio.
    2. Aggiungi 5 μL di reagente bloccante del recettore Fc (FcR) alla sospensione cellulare e incuba a 4 °C per 5 minuti.
    3. Aggiungere i seguenti anticorpi coniugati fluorescenti alla sospensione cellulare ai volumi indicati (sufficienti per tessuto derivato da 3 topi): 5 μL di CD45-PE; 5 μL di CD41-PE; 20 μL di CD31-APC; 15 μL di CD13-FITC.
    4. Incubare le cellule sul ghiaccio per 20 minuti al buio.
      NOTA: Proteggi dalla luce. Evita di mescolare.
    5. Aggiungi 6 mL di HBSS/BSA/buffer di glucosio per lavare le cellule. Centrifuga a 300 x g a 4 °C per 5 minuti.
    6. Aspira il soprandante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di buffer HBSS/BSA/glucosio. Aggiungere 200 μL di soluzione 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (per escludere le cellule morte) e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, regola il volume a 2 mL con HBSS/BSA/buffer di glucosio.
      NOTA: Proteggi dalla luce.
    7. Aggiungi una soluzione BSA all'1% ai tubi di raccolta per la selezione (tubetti conici da 15 mL), fai girare delicatamente per risciacquare le superfici interne. Aspirare la soluzione in eccesso, lasciando esattamente 1 mL di soluzione BSA all'1% in ogni tubo per ricevere le cellule selezionate. Conserva temporaneamente sul frigo.
    8. Filtrare la sospensione delle celle colorate attraverso un colino da 40 μm immediatamente prima della smistamento.
    9. Stabilire un gate iniziale basato sui parametri di scatter diretto (FSC-A) e side scatter (SSC-A) per escludere detriti cellulari che mostrano segnali FSC-A/SSC-A bassi.
    10. La depurtazione delle cellule della linea ematopoietica è stata ottenuta tramite gating dual-negativo per CD45 e CD41, eliminando efficacemente la contaminazione da leucociti, cellule immunitarie e piastrine.
    11. Cattura i periciti presunti tramite selezione CD13-positiva da cellule della parete vascolare.
    12. Valutare l'integrità della membrana tramite sondaggio fluorescente 7-AAD; escludere le cellule apoptotiche tramite la 7-AAD⁻ gating.
      NOTA: Raccogliere periciti ad alta purezza CD31⁻/CD13⁺ tramite selezione CD31-negativa. Raccogli i periciti selezionati direttamente in tubetti contenenti l'1% di BSA (dal Passo 2.4.7) e mettili sul ghiaccio. Preparare immediatamente le sospensioni a singola per il conteggio. Poi carica direttamente i campioni per il sequenziamento senza passaggi intermedi di coltura.
  5. Sequenza e analisi scRNA (Tming: 3-4 giorni)
    1. Sono state preparate sospensioni a singola cellula di periciti ordinati seguendo il protocollo della guida utente dei kit di reazione 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits" (CG000731)17,18. La sospensione a celle preparata per il carico aveva una vitalità di > 90% ed era diluita a una concentrazione all'interno dell'intervallo raccomandato di 300-2000 cellule/μL.
    2. Combinare la sospensione a singola con sfere di gel con codice a barre ed enzimi, quindi partizionare in Gel Beads-in-Emulsion (GEMs) tramite incapsulamento microfluidico di gocce19. Eseguire lisi cellulari in situ , trascrizione inversa e collegamento codice-cDNA in situ.
    3. Rompere i GEM per recuperare i prodotti. Amplificare il cDNA tramite PCR utilizzando il seguente protocollo: denaturazione iniziale a 9 °C per 4 secondi; seguita dal ciclo (13 cicli per <500 celle target, 12 cicli per 501-6000 celle target) che consiste in denaturazione a 9 °C per 2 s, ricottura a 9 °C per 3 s ed estensione a 7 °C per 6 s per ciclo; e un'estensione finale a 72 °C per 1 minuto seguita da una tenuta a 4 °C. Validare i prodotti amplificati per la dimensione del frammento (200-300 pb) e la ressa.
      NOTA: I prodotti di amplificazione possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 72 ore o a -2 °C per una settimana, oppure possono essere processati direttamente nella fase successiva.
    4. Per cDNA qualificato: frammentare, eseguire la riparazione dell'estremità, legare l'adattatore P7 e amplificare con primer indice. Seleziona i frammenti per costruire librerie di sequenziamento.
    5. Librerie di sequenze sulla piattaforma Illumina NovaSeq dopo la validazione QC.
    6. Dati di sequenziamento demultiplex per estrarre codici a barre cellulari, identificatori molecolari unici (UMI) e sequenze di RNA. Align legge il genoma di riferimento.
    7. Quantificare i conteggi UMI, stimare numeri validi di cellule e generare una matrice di espressionegene-codice a barre 20.
    8. Rimuovere i doppietti utilizzando il pacchetto DoubletFinder (v2.0.6) in R. Predire basandosi sull'identificazione artificiale dei vicini più prossimi per garantire la qualità dei dati.
    9. Condurre analisi a componenti principali (PCA) e riduzione della dimensionalità tramite Approssimazione e Proiezione Uniforme di Varietà (UMAP) utilizzando Seurat (v5.0). Identificare i cluster cellulari e visualizzare i geni marcatori specifici dei periciti per validare l'identità cellulare.

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Risultati

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Per ottenere un isolamento preciso dei periciti cerebrali, le cellule dissociate dal tessuto cerebrale sono state colorate con PE Texas Red anti-mouse CD41/CD45, FITC conjugato anti-mouse CD13 e APC conjugato anti-mouse CD31, stabilendo una strategia di ordinamento multi-fasi che integra marcatori superficiali e rilevamento della vitalità (Figura 2). Il gating iniziale basato sui parametri di scatter in avanti (FSC-A) e side scatter (SSC-A) ha effettivamente...

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Discussione

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Questo studio descrive una strategia FACS sistematicamente ottimizzata e validata basata sull'etichettatura multicolore CD13⁺/CD31⁻ per l'isolamento altamente efficiente dei periciti vascolaricerebrali del topo 24. Le analisi del citometrico a flusso e le successive scRNA-seq hanno confermato che il metodo discrimina con precisione i periciti dalle cellule endoteliali e produce cellule che soddisfano costantemente tutte le metriche critiche di controllo qualità pe...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per le Scienze Naturali di Pechino (Grant n. 7242222), dal Progetto Provinciale di Piano Scientifico e Tecnologico della provincia di Hebei (Grant No. 203777110D) e dall'Istituto di Ricerca sulla Microcircolazione del Peking Union Medical College, Accademia Cinese di Scienze Mediche (Grant No. CAMS-IM-2023-02).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fetal Bovine Serum (FBS)GibicolA5669701Aliquot e conservare a -20°C; può essere conservato a 4°C fino a 1 settimana dopo lo scongelamento
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)Life Technologies70011-044Diluire prima dell'uso per il lavaggio cellulare
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021-1KGPer la preparazione del buffer energetico cellulare
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA1933-25gProtegge le cellule e previene l'adesione
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)Gibco14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)Life Technologies14175-095Per il lavaggio cellulare e la resuspendenza
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977-015Per la preparazione di sistemi di reazione privi di nucleasi
Collagenase/DispaseSigma-Aldrich11097113001-100mgPer la digestione tissutale e la dissociazione cellulare; aliquotare e conservare a -20°C
DNaseI(RNase-Free)TIANGENRT411-1500UPreviene l'aggregazione del DNA; aliquotare e conservare a -20°C
PercollSigma-AldrichP1644-100MLPer la separazione cellulare; conservare a 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13BD Biosciences558744Coniugato fluorescente; conservare al riparo dalla luce a 4°C per un massimo di 1 mese
APC Rat Anti-Mouse CD31BD Biosciences551262Conservare al riparo dalla luce a 4°C per diversi mesi
PE Rat Anti-Mouse CD41BD Biosciences558040Conservare al riparo dalla luce a 4°C per diversi mesi
PE Rat Anti-Mouse CD45BD Biosciences553081Conservare al riparo dalla luce a 4°C per diversi mesi
FITC Rat IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences552916Controllo di fluorescenza; conservare al riparo dalla luce a 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Biosciences553932Conservare al riparo dalla luce a 4°C per diversi mesi
PE Rat IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences553989Conservare al riparo dalla luce a 4°C per diversi mesi
RNase AWAY Decontamination ReagentAmbion10328011Per eliminare la contaminazione da RNase
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141Previene il legame non specifico degli anticorpi
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)BD Pharmingen559925Per l'esclusione delle cellule morte.
2,2,2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402-25gPer la preparazione di soluzione di tribromoetanolo al 1,25% (w/v)
2-Methyl-2-butanolPsaitongM20008-500mLPer la preparazione di soluzione di tribromoetanolo al 1,25% (w/v)
C57BL/6 mouseJiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tubeCorning430291
15 mL centrifuge tubeCorning430791
cell cluture dish 100mm×20mmCorning430167
Cell Ranger3.1.0/4.0.0Software di analisi dati per sequenziamento di singole cellule
Loupe Cell Browser4.1Browser cellulare
STAR2.5.1bAllineamento dell'RNA
irlbpy-Analisi di componenti principali
tsne0.15Analisi Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)
k-means0.17Clustering K-Means
graph-based clustering0.17Clustering basato su grafi
FastQCv0.11.2Controllo della qualità dei dati (QC)

Riferimenti

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  26. Dias, D. O., et al. Pericyte-derived fibrotic scarring is conserved across diverse central nervous system lesions. Nat Commun. 12 (1), 5501(2021).
  27. Thalgott, J. H., et al. Non-invasive characterization of pericyte dysfunction in mouse brain using functional ultrasound localization microscopy. Nat Biomed Eng. , (2025).
  28. Grant, R. I., et al. Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).
  29. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).

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