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Articolo di ricerca
Questo protocollo integra campioni clinici, macrofagi coltivati e un modello murino di legatura e puntura cecalis (CLP) per indagare come l'asse NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 regoli la polarizzazione e l'infiammazione dei macrofagi nella sepsi, fornendo indicazioni passo dopo passo che possono essere adattate ad altre vie immunitarie mediate da LNCRNA.
La sepsi è caratterizzata da una risposta immunitaria dell'ospite disregolata e rimane una delle principali cause di mortalità a livello mondiale. L'RNA non codificante lungo NEAT1 è stato implicato nelle malattie infiammatorie, ma il suo ruolo specifico nella polarizzazione dei macrofagi durante la sepsi non è stato completamente definito. Qui esaminiamo sistematicamente l'asse NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 tra campioni clinici, macrofagi coltivati e un modello topino CLP. Per confermare l'interazione competitiva con RNA endogena (ceRNA) tra NEAT1, miR-181a-5p e HMGB1 vengono utilizzati esperimenti quantitativi per PCR, western blotting, saggi con doppia luciferasi e pull-down dell'RNA (RNA) in competizione. Vengono applicati saggi funzionali, tra cui immunofluorescenza, migrazione transwell e colorazione terminale con deossinucleotiltransferasi dUTP nick end (TUNEL), per valutare la polarizzazione, la migrazione e l'apoptosi dei macrofagi. In vivo, il modello CLP combinato con ELISA e istopatologia valida l'impatto del knockdown di NEAT1 sui profili delle citochine e sul danno agli organi. NEAT1 e HMGB1 sono alzati al rialzo, mentre miR-181a-5p è sottoregolato nei pazienti con sepsi e nei macrofagi stimolati da lipopolisaccaridi. Silenziare NEAT1 favorisce la polarizzazione dei macrofagi M2, riduce le citochine pro-infiammatorie, compromette la migrazione dei macrofagi e allevia i danni ai tessuti nei topi settici tramite l'asse miR-181a-5p/HMGB1. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo integrato a caratterizzare il circuito regolatorio lncRNA-microRNA-HMGB1 in sepsi utilizzando approcci clinici, in vitro e in vivo armonizzati. Fornisce un quadro metodologico per indirizzare le reti di ceRNA correlate a NEAT1 come potenziali strategie terapeutiche.
La sepsi è definita come disfunzione degli organi potenzialmente letale causata da una risposta dell'ospite disregolataall'infezione 1. Nonostante i progressi nella gestione clinica, la sua mortalità rimane elevata e i meccanismi molecolari alla base dello squilibrio immunitario non sono ancora pienamentecompresi 2,3. Tra i regolatori immunitari, gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono emersi come importanti modulatori della segnalazione infiammatoria e della funzione deimacrofagi 4,5. NEAT1, un trascrito abbondante arricchito nucleare, è una componente strutturale dei paraspeckles ed è stato associato a risposte immunitarie e di lesionitissutali 6,7. Studi precedenti hanno collegato NEAT1 a infiammazione intestinale, lesioni ischemiche/reperfusione e sindrome da distress respiratorioacuto 8,9,10.
Nel contesto della sepsi, le evidenze accumulate indicano che gli lncRNA regolano la polarizzazione dei macrofagi e la segnalazione infiammatoria, influenzando così la progressione della malattia e l'esito11,12. Ad esempio, gli LNCRNA KCNQ1OT1 e SNHG1 sono stati segnalati modulare la lesione miocardica indotta dalla sepsi attraverso vie mediate damicroRNA 13,14. Tuttavia, non è stato definito sistematicamente se NEAT1 regoli la polarizzazione dei macrofagi attraverso l'asse miR-181a-5p/HMGB1 in sepsis. Per colmare questa lacuna, abbiamo stabilito un protocollo che combina campioni di sangue del paziente, macrofagi RAW264.7 stimolati da lipopolisaccaridi e un modello murino con legatura cecalare e puntatura per interrogare l'asse NEAT1/miR-181a-5p/HMGB115,16. Utilizzando PCR quantitativa, western blotting, saggi di doppio rapporto luciferasi, RNA pull-down e letture funzionali della polarizzazione, migrazione e apoptosi dei macrofagi M1/M2, questo protocollo fornisce un quadro sperimentale riproducibile per definire NEAT1 come regolatore della funzione dei macrofagi in sepsi e per supportare lo sviluppo di strategie mirate aglilncRNA 17,18.
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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state approvate dal Comitato di Revisione Etica dell'Ospedale Affiliato dell'Università dell'Hebei (Approvazione n. HDFY-LL-2021-232). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti o, quando applicabile, dai loro surrogati legali. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali e le normative nazionali, e sono stati approvati dallo stesso comitato etico. Il protocollo approvato specificava i dettagli della procedura di legatura e puntura cecalica (CLP), la somministrazione di adenovirali, il regime anestetico e gli endpoint umani.
Raccolta di campioni da parte del paziente
I pazienti con sepsi sono stati reclutati prospettivamente presso l'Ospedale Affiliato dell'Università dell'Hebei tra febbraio 2022 e luglio 2024. Un totale di 50 pazienti ha soddisfatto i criteri di inclusione, inclusi 26 maschi e 24 femmine, di età compresa tra 24 e 69 anni (media 52,4 ± 10,2 anni). La sepsi è stata diagnosticata secondo i criteri di Sepsi-3, richiedendo un'infezione sospettata o confermata più un aumento del punteggio della Valutazione Sequenziale di Insufficienza Organo (SOFA) di ≥ 2 punti. Per ogni paziente, sono state registrate la fonte primaria di infezione (come infezione polmonare, intra-addominale, delle vie urinarie o del flusso sanguigno) e la gravità della malattia (sepsi o shock settico), e la distribuzione dei punteggi SOFA è stata riassunta per caratterizzare il carico della malattia. Come gruppo di controllo, sono stati arruolati 39 individui sani senza evidenza clinica di infezione o malattia infiammatoria sistemica (20 maschi e 19 femmine, di età compresa tra 26 e 70 anni, media 50,7 ± 11,0 anni), e non sono state osservate differenze significative di età o sesso tra i gruppi.
Il sangue venoso periferico è stato raccolto da pazienti con sepsi prima dell'inizio del trattamento specifico per sepsi quando possibile. Il sangue (tipicamente 5-10 mL) veniva prelevato in tubi rivestiti di acido etilendediamina-tetraacetico (EDTA) e delicatamente invertito più volte per mescolare l'anticoagulante. I campioni sono stati processati entro circa 1 ora dalla raccolta. Il plasma veniva ottenuto tramite centrifugazione a 1.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente, alquotato in microtubi marcati e conservato a -80 °C per successive misurazioni delle citochine. Per l'estrazione di RNA e proteine, le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da una porzione degli stessi campioni utilizzando un mezzo di separazione a gradiente di densità secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state poi lavate due volte in PBS, contate e conservate come pellet cellulari a -80 °C.
Coltura cellulare e trasfezione
Le cellule macrofagiche murine RAW264,7 sono state mantenute in un mezzo RPMI-1640 integrato con siero fetale inattivato al 10% di calore, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Le cellule venivano attraversate con un raschiatore cellulare prima di raggiungere la sovraconfluenza per preservare un fenotipo stabile.
Per la trasfezione, le cellule RAW264,7 sono state seminate a 5 × 105 cellule per pozzo in piastre a 6 pozzi in 2 mL di mezzo completo circa 24 ore prima dell'esposizione al reagente. Quando le colture raggiungevano una confluenza del 70-90%, gli acidi nucleici (come plasmidi di espressione NEAT1 o HMGB1, costrutti a forno corto, mimi o inibitori miR-181a-5p e i loro controlli corrispondenti) venivano complessizzati con un reagente di trasfezione a base di lipidi in un mezzo senza siero secondo le istruzioni del produttore. Tipicamente, 2-3 μg di DNA plasmidico o 50-100 pmol di piccolo RNA venivano miscelati con il volume raccomandato di reagente, lasciati formare complessi a temperatura ambiente per 10-15 minuti, e poi aggiunti a goccia alle cellule in un mezzo privo di antibiotici. Dopo 4-6 ore, il mezzo veniva sostituito con un mezzo fresco e completo e le cellule venivano incubate per ulteriori 24-48 ore prima di sagaggi a valle.
Induzione della polarizzazione dei macrofagi
Per indurre la polarizzazione infiammatoria dei macrofagi, le cellule RAW264.7 sono state lasciate aderire in piastre a 6 pozzi per almeno 4 ore nel mezzo completo. Il mezzo è stato poi sostituito con DMEM contenente 100 ng/mL lipopolisaccaridi (LPS), e le cellule sono state incubate per 6 ore a 37 °C con il 5% di CO2. Dopo la stimolazione, le cellule venivano immediatamente processate per l'estrazione di RNA e proteine, colorazione immunofluorescenza, saggio di migrazione o analisi di apoptosi, a seconda del disegno sperimentale.
Reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR)
L'RNA totale è stato estratto da cellule coltivate, PBMC o tessuti di topo utilizzando un reagente monofasico a base di fenolo-guanidinio secondo le procedure standard. In breve, i campioni venivano lisati in 1 mL di reagente ogni 106 cellule o 50-100 mg di tessuto, incubati per 5 minuti a temperatura ambiente, e poi mescolati vigorosamente con cloroformio (0,2 mL per 1 mL di reattivo). Dopo un'incubazione di 2-3 minuti, i lisati sono stati centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per separare le fasi. La fase acquosa è stata trasferita in un nuovo tubo e l'RNA è stato precipitato con un volume uguale di isopropanolo. La miscela è stata poi incubata per circa 10 minuti e centrifugata nuovamente a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Il pellet risultante è stato lavato con etanolo al 75%, centrifugato a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C, brevemente asciugato all'aria e sciolto in acqua priva di RNasi. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate tramite spettrofotometria UV, e campioni con un rapporto A260/A280 di circa 1,8-2,0 sono stati utilizzati per analisi a valle. Quando necessario, l'integrità veniva verificata tramite elettroforesi su gel di agarosio.
Il DNA complementare (cDNA) è stato sintetizzato da RNA totale utilizzando un kit di trascrizione inversa disponibile in commercio, seguendo le istruzioni del produttore. Per miR-181a-5p, sono stati impiegati primer specifici per geni o a bocca di fusto come raccomandato. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando un sistema PCR in tempo reale e un mix master adeguato (come SYBR Green- o chimica basata su sonde) in un volume di reazione totale di 20 μL contenente il modello di cDNA e 0,2-0,4 μM di ciascun primer. Le condizioni tipiche di ciclismo includevano una denaturazione iniziale a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli a 95 °C per 10 secondi e 60 °C per 30 secondi, con analisi della curva di fusione quando opportuno per confermare la specificità dell'amplicone. I livelli di espressione di NEAT1 e HMGB1 sono stati normalizzati a GAPDH, mentre l'espressione di miR-181a-5p è stata normalizzata a piccoli RNA nucleari di U6. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt ed espressa come variazione di piega rispetto ai gruppi di controllo. Le sequenze di primer e le dimensioni degli ampliconi sono state compilate in un foglio di calcolo separato per la presentazione come Tabella Supplementare 1.
Western blotting
Per il western blotting, le cellule sono state lavate due volte con PBS gelato e lisate in un adeguato tampone di radioimmunoprecipitazione (RIPA) integrato con inibitori della proteasi. I lisati sono stati incubati sul ghiaccio per 15-30 minuti con occasionali miscelazioni delicate e centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. I soprantativi sono stati raccolti e le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un saggio sull'acido bicinchoninico (BCA).
Quantità uguali di proteine (tipicamente 40 μg per corsia) sono state miscelate con tampone di carico, bollite a 95 °C per 5-10 minuti per denaturare le proteine, e separata su gel dodecil solfato di sodio (SDS)-poliacrilammide con concentrazione appropriata di acrilammide (ad esempio, 10-12% per HMGB1). Le proteine sono state trasferite su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF) utilizzando un sistema di trasferimento umido o semi-secco nelle condizioni raccomandate per l'intervallo di peso molecolare di interesse. Le membrane sono state bloccate con albumina screma o sierotica bovina al 5% in soluzione salina Trisk-buffed con 0,1% Tween-20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente, quindi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro HMGB1 (ad esempio, diluizione 1:500) e GAPDH (ad esempio, diluizione 1:1.000) diluiti in tampone bloccante. Dopo tre lavaggi in TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo ulteriori lavaggi, le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando un substrato chemiluminescente potenziato e catturate con un sistema di imaging digitale. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando software di analisi delle immagini, i segnali HMGB1 sono stati normalizzati in GAPDH e l'espressione relativa è stata confrontata tra i gruppi.
Saggio del reporter dual-luciferasi
Frammenti di tipo selvatico e mutanti di NEAT1 e della regione 3′-non tradotta di HMGB1 (3′-UTR) contenenti i siti di legame previsti di miR-181a-5p sono stati clonati in un vettore segnalatoreluciferasi 19. Tutti i costrutti sono stati verificati tramite sequenziamento Sanger per confermare i siti di inserimento emutazione 20. Le cellule RAW264,7 sono state seminate in piastre a 24 pozzi e lasciate aderire durante la notte. Le cellule sono poi state co-trasfettate con plasmidi reporter e con inibitori miR-181a-5p, mimics o controlli negativi corrispondenti utilizzando un reagente di trasfezione a base di lipidi, come descritto per la procedura generale di trasfezione.
Dopo circa 24-48 ore di incubazione, le cellule sono state lavate con PBS, lisate in un apposito tampone passivo di lisi (ad esempio, 20 μL per pozzo) e agitate delicatamente per garantire una lisi completa. L'attività della luciferasi è stata misurata utilizzando un kit di analisi a doppia luciferasi e un luminometro, seguendo le istruzioni del produttore. L'attività della luciferasi delle luciole è stata normalizzata all'attività di luciferasi di Renilla per controllare l'efficienza della trasfezione, e l'attività relativa della luciferasi di ciascun gruppo è stata confrontata con il corrispondente controllo.
Saggio migratorio Transwell
La migrazione dei macrofagi è stata valutata utilizzando camere transwell pre-rivestite con un gel di matrice extracellulare adatto ai saggi di invasione cellulare. Il gel è stato diluito 1:6 in mezzo senza siero su ghiaccio, e 50 μL della soluzione diluita sono stati aggiunti sulla superficie superiore di ogni inserto. La piastra è stata incubata a 37 °C per circa 4 ore per permettere al gel di solidificarsi. Sono state prelevate cellule RAW264.7 trasfectate o trattate, risospese in un mezzo siero a 1 × 106 cellule/mL, e 100 μL della sospensione cellulare (1 × 105 cellule) sono state aggiunte alla camera superiore. La camera inferiore è stata riempita con 600 μL di mezzo completo contenente il 10% di siero bovino fetale come chemioattrante.
Le cellule sono state incubate a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore. Al termine dell'incubazione, le cellule non migrate rimaste sulla superficie superiore della membrana venivano delicatamente rimosse con un cotton fioc. Le cellule migrate aderenti alla superficie inferiore della membrana sono state fissate con etanolo al 95% per circa 20 minuti a temperatura ambiente, poi colorate con soluzione di viola cristallina allo 0,5% per 10-15 minuti. Il colorante in eccesso veniva rimosso lavando con PBS e le membrane venivano asciugate all'aria. Le cellule migrate sono state esaminate al microscopio ottico, e le cellule in diversi campi selezionati casualmente per inserto sono state conteggiate in modo cieco per quantificare la capacità migratoria.
Saggio di apoptosi TUNEL
Per la rilevazione dell'apoptosi, le cellule RAW264.7 sono state coltivate su vetrature di vetro e sottoposte ai trattamenti o trasfezioni indicati. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 30-60 minuti a temperatura ambiente e risciacquate con PBS. L'attività endogena della perossidasi è stata bloccata dall'incubazione allo 0,3% di perossido di idrogeno per 20 minuti, seguita da lavaggi PBS. Veniva utilizzato un kit per il test TUNEL e la miscela di etichettatura veniva applicata per coprire le celle. I campioni sono stati incubati a 37 °C per circa 60 minuti in una camera umidificata, e la reazione è stata interrotta secondo le istruzioni del kit. Dopo l'incubazione con streptavidina-HRP o un reagente di rilevamento equivalente per 30 minuti a 37 °C, i nuclei venivano visualizzati con un substrato cromogenico come la 3,3′-diaminobenzidina (DAB) fino a quando i nuclei apoptotici colorati di marrone non divennero evidenti. I vetrini venivano controcolorati con ematossilina, disidratati tramite etanolo graduato, ripuliti con xilene e montati con un mezzo permanente. Cellule apoptotiche e nuclei totali sono stati osservati al microscopio ottico, e l'indice apoptotico è stato calcolato come percentuale di cellule TUNEL-positive.
Immunofluorescenza
Per l'immunofluorescenza, le sezioni di tessuto immerse in paraffina sono state dewaxate nello xilene e reidratate attraverso una serie di etanolo gradato in acqua. Il recupero dell'antigene è stato eseguito utilizzando un tampone appropriato (come il tampone di citrato, pH 6,0) e il recupero dell'epitopo indotto dal calore tramite microonde o pentola a pressione, secondo le raccomandazioni degli anticorpi. Dopo raffreddamento e risciacquo, le sezioni sono state bloccate con il siero normale al 5% in PBS per 1 ora a 37 °C per ridurre il legame aspecifico. I tessuti sono stati poi incubati durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro i marcatori di polarizzazione dei macrofagi e citochine infiammatorie, tra cui CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, sintetasi ossido nitrico indutibile (iNOS), IL-4, IL-10 e Arg-1 (comunemente a diluizione 1:500), diluiti in tampone bloccante.
Il giorno seguente, le sezioni sono state lavate in PBS e incubate con anticorpi secondari coniugati con fluorofori per 1 ora a 37 °C al buio. I nuclei sono stati controcolorati con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti. Dopo i lavaggi finali, le sezioni sono state montate con un mezzo di montaggio anti-sfaccettatura ed esaminate al microscopio a fluorescenza utilizzando adeguati set di filtri. Le immagini sono state acquisite con impostazioni di esposizione coerenti tra i gruppi, e barre di scala (ad esempio, 20 μm) e ingrandimenti sono stati indicati in tutti i pannelli e le legende delle figure.
Modello murino di sepsi indotta da CLP
I maschi C57BL/6 topi (24-32 g) sono stati acclimatati per almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico e poi assegnati casualmente ai gruppi Sham, CLP, CLP più controllo negativo a tornante corto, o CLP più NEAT1 a forcina corta (n = 6 per gruppo). I topi venivano anestetizzati inalando etere in una camera chiusa per circa 1-3 minuti fino alla perdita dell'etere del riflesso di raddrizzamento o di un altro anestetico approvato dall'istituzione a una dose e durata di esposizione che inducevano la perdita del riflesso di raddrizzamento mantenendo al contempo una funzione respiratoria adeguata. I peli addominali sono stati rasati e la pelle disinfetata con una soluzione antisettica appropriata. È stata eseguita una laparotomia della linea mediana di circa 1-2 cm per esporre il ceco con il suo intestino adiacente.
Per la CLP, il ceco è stato delicatamente esteriorizzato e legato con una sutura sterile a circa due terzi della sua lunghezza, facendo attenzione a non ostruire la valvola ileocecale o compromettere il flusso sanguigno mesenterico. Il ceco legato è stato perforato due volte con un ago sterile del calibro specificato nel protocollo approvato (ad esempio, 21 G), e una piccola quantità di materiale fecale è stata delicatamente estrusa per garantire la permeabilità dei siti di puntura. Il ceco veniva quindi riportato nella cavità peritoneale, e la parete addominale e la pelle venivano chiuse a strati con suture. I topi operati da simulazione hanno subito la stessa laparotomia ed esposizione al ceco senza legatura o puntura.
Per ottenere il knockdown in vivo di NEAT1, sono stati preparati un vettore adenovirale che codifica shNEAT1 e un corrispondente vettore di controllo negativo a un titolo definito (ad esempio, 1 ×10 9 unità formative di placca/mL). Un volume fisso di sospensione virale (come 100 μL per topo) veniva somministrato tramite la vena caudale in un momento specificato rispetto al CLP (ad esempio, 1 ora dopo l'intervento), come descritto nel disegno sperimentale e approvato dal comitato etico. Dopo l'intervento, i topi ricevevano cure post-operatorie standard, inclusa la rianimazione sottocutanea con liquido se necessario, e venivano monitorati per segni clinici di sepsi e disagio. Al momento prestabilito, gli animali venivano eutanasiati in modo umano tramite inalazione eccessiva di etere in una camera chiusa, utilizzando circa 5-10 mL di etere per garantire una rapida cessazione della respirazione, seguita dalla conferma della morte, la raccolta di sangue per l'analisi delle citochine e il prelievo degli organi per istopatologia, immunofluorescenza e analisi molecolari.
Analisi statistica
L'analisi statistica veniva effettuata utilizzando SPSS versione 23.0 o un software statistico equivalente. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD) salvo diversa indicazione. Per confronti tra due gruppi, è stato utilizzato un test t di Student non accoppiato quando i dati erano normalmente distribuiti con varianze omogenee. Per i confronti tra tre o più gruppi, è stata applicata un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA), seguita da test post hoc appropriati per confronti multipli quando è stato rilevato un effetto complessivo significativo. Un valore p bilaterale < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Il significato dei simboli statistici (ad esempio, p < 0,05, *p < 0,01) è stato definito nelle legende delle figure, e il numero di repliche biologiche è indicato nel testo o nelle leggende corrispondenti.
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Rilevamento dell'espressione e delle interazioni di NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 nella sepsi
Nei pazienti con sepsi, i livelli di NEAT1 e HMGB1 erano significativamente più alti rispetto ai controlli sani, mentre miR-181a-5p era notevolmente ridotto. Modelli di espressione simili sono stati osservati nelle PBMC e nei macrofagi RAW264.7 stimolati con lipopolisaccaridi, indicando che questo asse è costantemente alterato in sepsi e in condizioni infiammatorie simili alla sepsi (
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La sepsi è caratterizzata da una profonda e spesso duratura disregolazione immunitaria, in cui fasi di iperinfiammazione e immunosoppressione coesistono e contribuiscono congiuntamente a insufficienza d'organo e a risultatinegativi 21,22. Le evidenze accumulate indicano che gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) partecipano a questi processi modulando la segnalazione infiammatoria e la polarizzazione deimacrofa...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Gli autori ringraziano il personale clinico e di laboratorio dell'Ospedale Affiliato dell'Università dell'Hebei per il loro aiuto nel reclutamento dei pazienti, nella lavorazione dei campioni e nella cura degli animali. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione Sanitaria della Provincia di Hebei (Grant n. 20220640).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettore Adenovirale (shNEAT1) | 10692-V5 | Vigene Biosciences | Adenovirus usato per ridurre l'espressione di NEAT1 in vivo e in vitro. |
| Kit per il test proteico BCA | 23227 | Thermo Fisher | Kit utilizzato per quantificare la concentrazione proteica nei lisati cellulari. |
| Kit di analisi per giornalisti a doppia luciferasi | E1910 | Promega | Kit utilizzato per saggi di doppia luciferasi per misurare l'interazione miR-181a-5p. |
| Kit ELISA (Citochine) | N/A | R& Sistemi D | Kit utilizzati per misurare i livelli di citochine in campioni di siero e tessuto. |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | 16000-044 | Gibco | Integratore utilizzato nei mezzi di coltura per la crescita cellulare. |
| Anticorpi GAPDH | 2118S | Tecnologia di segnalazione cellulare | Anticorpo primario contro GAPDH utilizzato come controllo del carico nel western blot. |
| Kit per la colorazione di ematossilina ed eosina | N/A | Thermo Fisher | Kit utilizzato per la colorazione istologica delle sezioni tissutali per analisi patologiche. |
| Anticorpi di immunofluorescenza (CD206) | 14693-1-AP | Proteintech | Anticorpo utilizzato per rilevare il marcatore del macrofago M2 CD206 nelle sezioni tissutali. |
| Lipopolisaccaride (LPS) | L2630 | Sigma-Aldrich | LPS viene utilizzata per indurre la polarizzazione infiammatoria dei macrofagi nelle cellule RAW264.7. |
| miR-181a-5p Mimic | N/A | N/A | Mimica sintetica miR-181a-5p utilizzata per modulare i livelli miR-181a-5p. |
| Plasmide di Espressione NEAT1 | N/A | N/A | Plasmide utilizzato per la sovraespressione di NEAT1 nei macrofagi RAW264.7. |
| Cellule macrofagiche RAW264.7 | TIB-71 | ATCC | Linea cellulare di macrofagi murini utilizzata per esperimenti in vitro. |
| Buffer di lisi RIPA | 89901 | Thermo Fisher | Tampone usato per lisi le cellule per estrarre la proteina totale. |
| RPMI-1640 Medium | 11875-093 | Gibco | Mezzo di coltura per macrofagi RAW264.7. |
| SYBR Green Master Mix | 4385612 | Thermo Fisher | Reagente utilizzato per l'analisi quantitativa in tempo reale per PCR. |
| Camere di analisi per la migrazione Transwell | 3422 | Corning | Camere utilizzate per saggi di migrazione transwell per valutare la migrazione dei macrofagi. |
| Kit per il test sull'apoptosi TUNEL | ab66110 | Abcam | Kit utilizzato per rilevare l'apoptosi nelle cellule RAW264.7 tramite colorazione TUNEL. |
| Anticorpi Western Blotting (HMGB1) | ab18256 | Abcam | Anticorpo primario contro HMGB1 usato nel western blotting. |
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