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Articolo di ricerca

Gli effetti causali dei metaboliti plasmamici sulla lesione del tendine d'Achille: uno studio di randomizzazione mendeliano

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DOI:

10.3791/69807

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27 marzo 2026

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1Department of Orthopaedic Centre Hand-Foot Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 2Ningxia Yinchuan Energy College, Nursing College, 3General Surgery Department, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo combinato di randomizzazione mendeliana e validazione sperimentale per identificare metaboliti causali nella lesione del tendine d'Achille, identificando 19 metaboliti plasmamici con legami causali con lesioni del tendine d'Achille e dimostrando l'applicazione terapeutica di 5,6-diidrotimina e idrossiasparagina nella promozione della riparazione tissutale e nella riduzione dell'infiammazione.

Abstract

Per indagare gli effetti causali dei metaboliti plasmatici, sulla progressione e il recupero della lesione del tendine d'Achille (ATI), è stata applicata la randomizzazione mendeliana (MR) utilizzando un approccio a due campioni con dati genetici provenienti da due grandi dataset. I dati ATI sono stati provenienti dal progetto IEU-OpenGWAS (ebi-a-GCST90018895), mentre i dati sui metaboliti plasmatici, includevano 1.400 metaboliti. Sono state identificate variabili strumentali (IV) significative per i metaboliti e sono stati applicati cinque metodi di risonanza magnetica - IVW, MR-Egger, mediana ponderata, modalità semplice e modalità pesata - per valutare le relazioni causali. È stata condotta un'analisi inversa per risonanza magnetica per esplorare l'impatto dell'ATI sui livelli di metaboliti. La riparazione tissutale e l'espressione di IL-6, TNF-α, VEGFA e TGF-β1 nel tessuto tendine d'Achille del topo sono state valutate al settimo giorno post-trattamento con 5,6-diidrotimina (Dih) e idrossiasparagina (Hyd) utilizzando colorazione H&E e Western blot. L'analisi RM ha identificato 19 metaboliti con associazioni causali significative con l'ATI. Di questi, 12 metaboliti, incluso Dih (IVW: OR = 1,197, IC 95%: 1,074-1,334; P = 0,001) e Pregnanediolo-3-glucuronide (IVW: OR = 1,098, IC 95%: 1,023-1,177; P = 0,001), erano positivamente associati alla progressione dell'ATI. Al contrario, 7 metaboliti, come Hyd (IVW: OR = 0,789, IC 95%: 0,707-0,880; P < 0,001), erano collegati al recupero da ATI. L'analisi RM inversa non ha indicato effetti causali significativi dell'ATI sui livelli di metaboliti, suggerendo una relazione unidirezionale. Le analisi a raggi X e H&E hanno rivelato che il trattamento Dih e Hyd ha migliorato significativamente la guarigione del tendine d'Achille in modo dipendente dalla dose. Inoltre, il trattamento con Dih e Hyd ha notevolmente ridotto l'espressione di IL-6 e TNF-α (P < 0,05) mentre aumentava i livelli di VEGFA e TGF-β (P < 0,05), indicando una riduzione dell'infiammazione e la promozione della riparazione tissutale. Questo studio ha identificato potenziali relazioni causali tra metaboliti plasmamici specifici e gli esiti ATI. Questi risultati potrebbero informare le strategie terapeutiche future e evidenziare l'utilità della RM nell'esplorare le associazioni metaboliti-malattia.

Introduzione

L'infortunio al tendine d'Achille (ATI) è una condizione muscoloscheletrica diffusa e debilitante, in particolare tra atleti e individui fisicamenteattivi 1,2. Il tendine d'Achille, il tendine più grande e forte del corpo umano, svolge un ruolo fondamentale nella locomozione, trasmettendo le forze dai muscoli del polpaccio al tallone durante attività come camminare, correre e saltare 3,4,5,6. La sua limitata fornitura di sangue e l'elevato stress meccanico che subisce la rendono particolarmente vulnerabile all'uso eccessivo e agliinfortuni 2,7. L'ATI si manifesta in varie forme, che vanno da lieve tendinopatia a rottura completa, causando dolore significativo, mobilità ridotta e riabilitazioneprolungata 8,9. Nonostante i progressi nel trattamento, l'ATI spesso provoca dolore persistente, mobilità ridotta e tempi di recupero prolungati, con un rischio aumentato di complicazioni croniche eri-lesioni 5,10,11,12.

Studi recenti hanno evidenziato il ruolo cruciale dei metaboliti plasmamici nel processo di guarigione di ATI13,14. Si ritiene che questi metaboliti, coinvolti in varie vie biochimiche, influenzino fattori chiave come l'infiammazione, la riparazione dei tessuti e la salute deitendini 15. Ad esempio, specifici amminoacidi e lipidi sono essenziali per la sintesi del collagene e per la gestione dello stress ossidativo, entrambi cruciali nella patologia dei tendini16,17. Il plasma ricco di piastrine (PRP), ricco di fattori di crescita come PDGF, TGF-β, VEGF e IGF, ha dimostrato potenziale nel promuovere la guarigione dei tendini, anche se la sua efficacia nel trattamento della tendinopatia cronica d'Achille rimane oggettodi dibattito. Negli ultimi anni, le tecnologie omiche ad alto rendimento, come la metabolomica e la proteomica, hanno offerto opportunità senza precedenti per esplorare il panorama molecolare di condizioni complesse come ATI18,19. Tecnologie metabolomiche avanzate hanno facilitato l'identificazione di biomarcatori legati agli esiti dell'ATI, fornendo informazioni su come metaboliti specifici influenzino la progressione e il recupero della lesione.

La profilazione dei metaboliti e l'analisi delle vie metaboliche sono diventate approcci potenti per identificare biomarcatori e vie associate alesioni 20,21. La randomizzazione mendeliana (MR) è un metodo robusto di inferenza causale che utilizza varianti genetiche come variabili strumentali (IV) per affrontare i bias di confusione comuni negli studi epidemiologicitradizionali 22,23,24,25,26,27. La RM è particolarmente utile per studiare le relazioni causali tra esposizioni, come i metaboliti plasmati, e esiti come l'ATI. A differenza degli studi osservazionali convenzionali, suscettibili a confondimento e causalità inversa, la RM utilizza varianti genetiche come flebo per fornire inferenze causali più forti. Una comprensione più profonda di come i metaboliti plasmamici influenzino la salute dei tendini è essenziale per far avanzare strategie terapeutiche e migliorare i risultati del recupero.

Sulla base di questi progressi, il presente studio indaga il ruolo causale dei metaboliti plasmici nell'ATI utilizzando la risonanza magnetica. Le variazioni genetiche associate ai livelli di metaboliti sono state analizzate per identificare metaboliti specifici legati alla progressione e al recupero dell'ATI. Inoltre, metaboliti candidati, come 5,6-diidrotimina (Dih) e idrossiasparagina (Hyd), sono stati validati sperimentalmente in modelli animali per chiarirne gli effetti sull'evoluzione e sulla guarigione dell'ATI.

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Protocollo

Approvazione etica e consenso alla partecipazione

Tutti i progetti sperimentali sugli animali sono stati condotti rigorosamente in conformità con le Misure di Gestione degli Animali da Laboratorio della Provincia di Ningxia e sono stati approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare della Regione Autonoma Hui di Ningxia, Università Medica di Ningxia.

Progettazione dello studio

Questo studio ha indagato le relazioni causali tra 1.400 metaboliti plasmamici e ATI utilizzando una metodologia di risonanza magnetica a due campioni. Per garantire la validità delle IV nell'inferenza causale, devono essere soddisfatte tre assunzioni critiche: (1) la variazione genetica è direttamente associata all'esposizione di interesse; (2) la variazione genetica non viene confusa da potenziali confondenti tra l'esposizione e il risultato; e (3) la variazione genetica influenza l'esito esclusivamente attraverso l'esposizione e non tramite vie alternative.

Fonti dei dati GWAS per ATI

I dati per il Genome-Wide Association Study (GWAS) su ATI sono stati raccolti dal progetto IEU-OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/), utilizzando specificamente il dataset ebi-a-GCST90018895. L'analisi GWAS ha coinvolto 357.658 individui di origine europea, comprendenti 7.746 casi e 349.912 controlli. A seguito delle procedure di controllo qualità, sono stati identificati in totale 19.072.056 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Le procedure di controllo della qualità includevano la rimozione degli SNP con frequenza allelica minore<0,01, equilibrio Hardy-Weinberg P<1×10-⁶ e tasso di richiamo genotipico <0,95. La stratificazione della popolazione è stata valutata utilizzando l'analisi delle componenti principali e il fattore di inflazione genomica (λ) è stato calcolato per valutare il bias sistematico.

Fonti di dati GWAS per i metaboliti plasmatici

Il dataset Exposure Factors include dati GWAS per 1.400 metaboliti plasmatici, costituiti da 1.091 livelli di metaboliti e rapporti di 309 metaboliti, come catalogato nel database GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Le analisi RM sono state limitate a individui di origine europea. Informazioni dettagliate sul dataset sono fornite nei Materiali Supplementari, Tabella S1.

Selezione dei flebo

Nell'identificazione delle flebo, la soglia di significatività statistica per 19.072.056 SNP associati a metaboliti plasmici è stata fissata a P < 1 × 10-5. Per garantire l'indipendenza delle analisi, gli SNP sono stati aggregati usando soglie di r2 = 0,001 e kilobase (kb) = 10.000, escludendo 19.037.213 SNP con r2 > 0,001 e kb < 10.000 per eliminare potenziali effetti di Disequilibrio di Collegamento (LD). Gli SNP con valori F-statistici < 10 sono stati esclusi da ulteriori analisi a causa della loro elevata eterogeneità, mentre 34.843 SNP che soddisfacquero i criteri sono stati mantenuti come IV validi.

Animali e progettazione sperimentale

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con le Misure di Gestione degli Animali da Laboratorio della Provincia di Ningxia e approvati dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare della Regione Autonoma Hui di Ningxia, Università Medica di Ningxia. I topi maschi BALB/c (8 settimane, grado SPF) sono stati acquistati dalla Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pechino, Cina). I topi sono stati acclimatati per una settimana in un ambiente controllato (temperatura 23 ± 1°C, umidità 60 ± 10%), con libero accesso a cibo e acqua standard, e un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Dopo l'acclimatazione, è stato stabilito un modello di lesione del tendine murino. Dopo un'incisione longitudinale della pelle, il tendine d'Achille sinistro è stato esposto e una transsezione trasversale standardizzata a spessore completo è stata eseguita al punto centrale del tendine utilizzando forbici microchirurgiche. Il tendine è stato immediatamente riparato con suture 6-0 non assorbibili sotto uno stereomicroscopio. Immediatamente dopo l'intervento, sono state eseguite immagini a raggi X per verificare il successo dell'istituzione del modello murino ATI. Contemporaneamente, sono state acquisite immagini a raggi X per il gruppo di controllo in condizioni anestetiche identiche, fungendo da controllovuoto 28. Tutte le procedure sono state eseguite sotto anestesia generale indotta da iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (50 mg·kg-1), e l'analgesia post-operatoria è stata somministrata con buprenorfina (0,05 mg·kg-1, sottocutanea) ogni 12 ore per 48 oree 29. Dopo l'induzione con successo del modello, i topi sono stati assegnati casualmente ai seguenti gruppi: gruppi di controllo, modello e di trattamento che hanno ricevuto Dih a dosi basse (10 mg·kg-1, LD-Hyd), medie (30 mg·kg-1, MD-Hyd) e alte (50 mg·kg-1, HD-Hyd). Calcolo della dimensione del campione: Sulla base di dati preliminari che mostrano un miglioramento del 40% nei punteggi di guarigione con il trattamento dei metaboliti (SD = 15%), è stato determinato che n = 6 topi per gruppo fornirebbero l'80% di potenza per rilevare questa differenza a α = 0,05 (a due code). La randomizzazione è stata effettuata utilizzando numeri casuali generati al computer da un investigatore cieco rispetto all'allocazione di gruppi. Le procedure sperimentali e le valutazioni degli esiti sono state condotte da ricercatori accechi ai compitidi gruppo 30.

Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)

Al settimo giorno post-trattamento, i topi sono stati eutanasiati sotto anestesia profonda indotta da iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (100 mg·kg-1), garantendo la completa perdita dei riflessi prima della raccolta dei tessuti, in conseguenza. Il tessuto tendineale d'Achille lesionato, compresa una piccola porzione del tessuto molle circostante, è stato prelevato e lavorato con cura. Un pezzo di pelle2 di 15 mm centrato sul tendine d'Achille è stato espulso. I campioni di pelle sono stati fissati in una soluzione di paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 48 ore, seguiti da disidratazione, inglobazione della paraffina e sezionamento di 5 μm. Le caratteristiche strutturali della pelle della ferita, la formazione del tessuto di granulazione e l'infiltrazione cellulare infiammatoria sono state valutate tramite colorazione H&E. Per la valutazione istologica, le sezioni sono state deparaffinizzate in xilene (2 × 10 minuti), reidratate tramite etanolo graduato (100%, 95%, 85% e 75%, 5 minuti ciascuna) e risciacquate in acqua distillata. I vetrini sono stati colorati con ematossilina Harris per 5 minuti, risciacquati con acqua del rubinetto corrente per 5 minuti, differenziati in alcol acido all'1% per 10 secondi e bluati in acqua ammoniaca allo 0,2% per 30 secondi. Dopo il lavaggio, le sezioni sono state controcolorate con lo 0,5% di eosina per 2 minuti, seguite da disidratazione, pulizia e montaggio. Affidabilità della valutazione istologica: Per garantire l'accuratezza delle misurazioni, il 20% dei campioni selezionati casualmente è stato valutato indipendentemente da due osservatori ciechi. L'affidabilità tra valutatori è stata valutata utilizzando il coefficiente di correlazione intraclasse (ICC). L'ICC per l'organizzazione del collagene è stata 0,89 (IC 95%: 0,81-0,94), per la degenerazione tissutale 0,92 (IC 95%: 0,86-0,96) e per l'infiltrazione infiammatoria cellulare 0,87 (IC 95%: 0,78-0,93), indicando un'eccellente affidabilità. L'affidabilità intra-valutatore è stata valutata facendo riassegnare il 15% dei campioni a un osservatore dopo un intervallo di due settimane, ottenendo valori ICC > 0,85 per tutti i parametri31.

Analisi del western blot

L'espressione proteica è stata analizzata tramite Western blot. La quantificazione delle proteine è stata effettuata utilizzando il kit di analisi della concentrazione di proteine BCA. Quantità uguali di proteine sono state separate tramite elettroforesi gel dodecil solfato di sodio e poliacrilammide al 10% (SDS-PAGE) e trasferite a una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata bloccata per 1 ora con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata con Tris contenente lo 0,1% Tween-20 a temperatura ambiente. Le membrane sono state incubate durante la notte a 4°C con anticorpi primari per VEGFA (1:1000, ab46154), TGF-β1 (1:1000, 21898-1-AP), IL-6 (1:1000, 26404-1-AP) e TNF-α (1:1000, 17590-1-AP). Dopo tre lavaggi con PBS, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari (1:5000) per 90 minuti a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando il kit di substrato chemiluminescence ECL (vedi Tabella dei Materiali per dettagli) seguendo il protocollo del produttore e analizzate con il software ImageJ (versione 1.8; Istituti Nazionali di Salute). GAPDH (10494-1-AP) fu utilizzato come controllo di carico.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software R Studio. I pacchetti TwoSampleMR e ieugwasr R sono stati impiegati per estrarre i dati di esposizione e selezionare IV validi, inclusi aggregamenti (r² < 0,001, dimensione della finestra = 10.000 kb), armonizzazione degli alleli e calcolo della statistica F (F = β²_exposure/SE²_exposure). Per le analisi MR e reverse MR, abbiamo utilizzato i pacchetti VariantAnnotation, gwasglue e TwoSampleMR, che hanno facilitato test robusti di inferenza causale e sensibilità. È stato condotto uno studio RM su due campioni per indagare i tratti correlati ai metaboliti plasmatici. Sono stati impiegati cinque approcci analitici distinti: Ponderazione a Varianza Inversa (IVW), MR-Egger, Mediana Ponderata (WM), Modalità Semplice e Modalità Pesata. I risultati primari sono stati determinati utilizzando il metodo IVW, con significatività statistica stabilita a P < 0,01. Il metodo IVW assegna pesi per minimizzare l'impatto della variazione, fornendo stime dell'effetto più precise. La regressione MR-Egger è stata utilizzata per valutare la pleiotropia (il fenomeno in cui i geni influenzano più caratteristiche), con la pleiotropia orizzontale valutata dal valore P dell'intercetta (P > 0,05) e l'eterogeneità testata usando il metodo IVW combinato con la statistica Q di MR-Egger. Non è stata osservata eterogeneità significativa quando P > 0,05. La correzione con test multipli è stata applicata utilizzando il metodo del tasso di false scoperte (FDR) di Benjamini-Hochberg, con FDR < 0,05 considerato significativo. L'eterogeneità è stata quantificata utilizzando la statistica Q di Cochran e la statistica I2 ,dove I 2 > 50% indicava un'eterogeneità sostanziale. Per i valori di I2 , sono stati calcolati intervalli di confidenza al 95% seguendo il metodo descritto da Ioannidis et al. Le analisi di sensibilità sono state effettuate rimuovendo sequenzialmente ogni SNP per valutare l'influenza delle singole varianti sui risultati complessivi.

Per valutare l'affidabilità delle misurazioni, sono state effettuate analisi test-retest su misure chiave di risultato (quantificazione WB e punteggio istologico) utilizzando i coefficienti di correlazione intraclasse (ICC). L'ICC è stato impiegato per valutare l'affidabilità inter-valutatore e intra-valutatore della quantificazione e della valutazione istologica del Western Blot (WB). I criteri sono stati interpretati come segue: sotto 0,50 (scarso), tra 0,50 e 0,75 (moderato), tra 0,75 e 0,90 (buono) e sopra 0,90 (eccellente)32. Tre ricercatori indipendenti hanno arbitrato ciecamente lo stesso set di campioni in due momenti temporali separati da una settimana. Gli ICC per la quantificazione Western blot di IL-6, TNF-α, VEGFA e TGF-β variavano da 0,87 a 0,93, indicando un'eccellente affidabilità. Gli ICC per la valutazione istologica sono stati 0,85 per l'organizzazione del collagene e 0,82 per la valutazione della neovascolarizzazione.

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Risultati

Relazione causale tra 1.400 metaboliti plasmamici e ATI

È stata effettuata un'analisi RM completa di 1.400 metaboliti plasmatici, per valutarne gli effetti causali sull'ATI. L'analisi primaria ha utilizzato l'approccio IVW, con controlli rigorosi per LD e potenziali confondenti, per identificare i metaboliti che influenzano significativamente la progressione e il recupero dell'ATI. La Figura 1 mostra le associazioni causali tra 144 metaboliti plas...

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Discussione

Questo studio ha condotto un'analisi completa della risonanza magnetica per esplorare le relazioni causali tra 1.400 metaboliti plasmamici e ATI. Diciannove metaboliti plasmatici, identificati come significativamente associati alla progressione e guarigione dell'ATI, con Dih e Hyd che emergono come fattori chiave che influenzano gli esiti dell'ATI. Esperimenti in vivo successivi hanno confermato il ruolo benefico di questi metaboliti nella promozione della guarigione dei tendini...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Ricerca Applicativa Clinica sulla Valutazione della Flora Intestinale e il Trattamento a Passi delle Ulcere Croniche nel Piede Diabetico, Yinchuan Science and Technology Innovation Project (2024SF005). Ricerca applicativa sugli effetti di diversi metodi chirurgici sull'apporto sanguigno del tessuto peritendale e sulla riparazione biomeccanica della rottura acuta del tendine d'Achille chiuso nell'ambito del programma Ningxia Key Research and Development (2019BEG3036).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5,6-DiidrotiminaReagente696-04-8Reagente
Kit per il test proteico BCAReagenteP0012Reagente
Kit di substrato per la chemiluminescenza ECLReagenteP0018SReagente
Anticorpi GAPDHAnticorpi10494-1-APAnticorpi
Kit per la colorazione di ematossilina ed eosinaReagenteG1120Reagente
IdrossiasparaginaReagenteH1126Reagente
Anticorpo IL-6Anticorpi26404-1-APAnticorpi
ImageJSoftwareVersione 1.8Software
Membrana di nitrocellulosaConsumabiliHATF08130Consumabili
ParaformaldeideReagenteP0099-3LReagente
RStudioSoftwareVersione 4.5.2Software
Kit di preparazione gel SDS-PAGEReagenteP0012ACReagente
Pentobarbital SodioAnestetico200-323-9Anestetico
TGF-& beta; 1 AnticorpoAnticorpi21898-1-APAnticorpi
TNF-α AnticorpiAnticorpi17590-1-APAnticorpi
Anticorpo VEGFAAnticorpiAB46154Anticorpi
Sistema a raggi XStrumentoMX-20Strumento

Riferimenti

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