Articolo di ricerca
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Questo protocollo consente l'integrazione del sequenziamento di nuova generazione e dell'immunofluorescenza multicolore per profilare l'adenocarcinoma polmonare. L'obiettivo è analizzare la relazione tra eterogeneità genomica e densità di cellule immunitarie infiltranti tumori. Questo approccio multidimensionale facilita una valutazione completa del microambiente tumorale per la valutazione prognostica post-operatoria.
La prognosi dell'adenocarcinoma polmonare (LUAD) viene tradizionalmente valutata tramite stadiazione tumore-linfonodo-metastasi (TNM), che non tiene conto dello stato immunitario del paziente. Questo protocollo integra profilazione genomica e analisi del microambiente immunitario per facilitare una valutazione prognostica postoperatoria più completa. Il metodo prevede un'analisi retrospettiva dei tessuti tumorali incorporati in paraffina utilizzando due tecniche principali. Per prima cosa, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) viene eseguito con un pannello personalizzato di 37 geni per identificare mutazioni nei geni driver e nelle varianti di rilevanza incerta. In secondo luogo, l'immunofluorescenza multiplex (mIF) viene utilizzata per colpire marcatori tra cui HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK. Ciò consente la quantificazione della distribuzione spaziale e della densità per specifiche sottopopolazioni di cellule immunitarie in varie regioni tumorali. Questo approccio integrato consente la valutazione simultanea dell'eterogeneità genomica e delle caratteristiche delle cellule immunitarie infiltranti tumori. I dati risultanti identificano combinazioni specifiche di profili mutazionali—come lo stato EGFR —e densità cellulari immunitarie. Queste combinazioni integrate permettono di studiare il loro impatto collettivo sulla sopravvivenza del paziente, offrendo un approccio promettente per lo sviluppo di futuri modelli prognostici del cancro polmonare. Questo protocollo dimostra un metodo robusto per caratterizzare le complesse caratteristiche biologiche del microambiente tumorale LUAD.
Il LUAD è il sottotipo più diffuso di cancro ai polmoni, eppure il tasso medio di sopravvivenza a 5 anni rimane basso, circa al 15%. La valutazione prognostica attuale si basa principalmente sul sistema di stadiazione TNM; tuttavia, questo metodo spesso trascura lo stato immunitario complessivo del paziente, il che può limitarne l'accuratezza predittiva. Le evidenze suggeriscono che sia l'eterogeneità genomica sia il microambiente tumorale (TME) svolgono ruoli critici nella tumorigenesi e nella progressione della malattiadel LUAD 2,3.
Negli ultimi anni, la transizione dal sequenziamento tradizionale di Sanger al NGS mirato ha permesso l'analisi simultanea ad alta sensibilità di più geni driver, come EGFR, TP53 e KRAS 4,5. Sebbene NGS fornisca una mappa ad alta risoluzione delle alterazioni genetiche, i dati genomici da soli non possono catturare le complesse interazioni cellulari e l'organizzazione spaziale all'interno del TME.
Per affrontare queste complessità, l'mIF offre vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di profilazione immunitaria. Mentre l'immunoistochimica a plex singolo (IHC) è limitata a un marcatore per sezione, il mIF consente la rilevazione simultanea di più marcatori proteici preservando l'architettura spaziale del tessuto. A differenza dell'IHC sequenziale, che può causare degradazione tissutale, o della citometria a flusso e del sequenziamento di RNA di massa, che comportano la perdita di localizzazione spaziale e risoluzione della singola cellula 6,7,8, il mIF combinato con l'annotazione delle regioni spaziali consente una caratterizzazione in situ e multiparametrica del paesaggioimmunitario 9.
Questo protocollo stabilisce un flusso di lavoro combinato che integra NGS mirato, mFI e valutazione della regione spaziale (che comprende l'intero tessuto, il confine tumorale e il nucleo tumorale). Un approccio così multidimensionale è necessario per indagare l'interazione tra alterazioni genomiche e densità cellulare immunitaria—una relazione che gli approcci monomodali spesso non riescono a catturare. Valutando queste caratteristiche integrate, questo protocollo fornisce una strategia complementare per caratterizzare le caratteristiche biologiche del LUAD e offre un quadro più solido per la stratificazione prognostica postoperatoria.
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Questo studio retrospettivo è stato approvato dal Comitato di Etica Medica dell'Ospedale Kunming Yan'an (Approvazione n. 2021-140-01). È stato ottenuto il consenso informato da tutti i partecipanti.
Progettazione dello studio e raccolta dei campioni
È stata arruolata una coorte di 63 pazienti con LUAD patologicamente o istologicamente confermata, sottoposti a resezione chirurgica tra il 2015 e il 2021. I criteri di esclusione includevano la somministrazione di chemioterapia neoadiuvante, radioterapia o immunoterapia prima dell'intervento. Inoltre, i pazienti con neoplasie concomitanti, gravi comorbidità, scarsa qualità tissutale o cartelle cliniche incomplete sono stati esclusi dall'analisi. I blocchi tumorali fissati in paraffina fissata in formalina (FFPE) sono stati processati in sezioni da 1 mm per la deparaffinizzazione. Come illustrato nel flusso di lavoro (Figura 1), questi campioni sono stati sottoposti a un'analisi integrata utilizzando mIF e NGS mirati. Questo approccio combinato consente la valutazione simultanea delle alterazioni genomiche e delle caratteristiche del microambiente immunitario, fornendo un quadro multidimensionale per caratterizzare la biologia tumorale.
Follow-up
I farmaci mirati, l'immunoterapia e la progressione o la morte della malattia sono stati monitorati tramite un controllo telefonico, e sono state ottenute informazioni dettagliate riguardo allo stato di sopravvivenza dei pazienti, alla progressione o recidiva della malattia, ai trattamenti adiuvanti ricevuti dopo l'intervento chirurgico e a eventuali nuove comorbidità diagnosticate. Il tempo di follow-up è terminato a luglio 2023, e l'ultimo punto finale dell'osservazione è stato la progressione della malattia o la morte. La sopravvivenza complessiva era definita come il tempo dall'inizio dell'intervento fino alla morte del paziente. Non sono stati persi pazienti durante il follow-up. Il tempo minimo di follow-up era di 21 mesi.
Preparazione e sequenziamento della libreria NGS
Estrazione del DNA da sezioni di tessuto FFPE
Ottenere sezioni di tessuto FFPE (spessore 3–10 μm) da campioni patologici. Metti le sezioni in tubi microcentrifughe sterili. Aggiungi xilene a ogni tubo e incuba per 5–10 minuti a temperatura ambiente per rimuovere la paraffina. Centrifuga a 12.000 x g per 5 minuti e scartare con cura il surnadante. Ripeti il trattamento con xilene 1 volta per garantire una completa deparaffinizzazione. Lava il pellet in sequenza con etanolo al 100% due volte per rimuovere il residuo dello xilene. Asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente finché l'etanolo residuo non è completamente evaporato. Aggiungere il tampone di lisi appropriato e la proteinasi K (forniti nel kit di estrazione del DNA) e incubare a 56 °C per 1–3 ore (o per tutta la notte se necessario) finché il tessuto non sarà completamente lisato. Eseguire un'incubazione aggiuntiva a 90 °C per 1 ora per invertire la reticolazione della formalina. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit commerciale di estrazione del DNA FFPE (vedi Tabella dei Materiali) secondo le istruzioni del produttore. La qualità del DNA dai campioni di FFPE è spesso frammentata; pertanto, la qualità del DNA dovrebbe rispettare soglie minime di integrità (ad esempio, DIN ≥ 5) per garantire una preparazione efficace della biblioteca per NGS mirati.
Quantificazione e normalizzazione del DNA
Quantificare il DNA utilizzando un metodo fluorometrico per garantire una misurazione accurata delle concentrazioni. Normalizzare i campioni di DNA a una concentrazione finale di circa 5–10 ng/μL utilizzando il tampone Tris-HCl (pH 8,5). Eseguire gradualmente le fasi di diluizione se necessario per garantire accuratezza e stabilità della concentrazione di DNA.
Preparazione della biblioteca e arricchimento degli obiettivi
Preparare librerie di sequenziamento utilizzando NGS miri ibridi basati sulla cattura su DNA estratto dal tessutoFFPE 10. Eseguire l'arricchimento del bersaglio utilizzando un pannello di sonda personalizzato che copre le regioni esoniche di geni selezionati associati allo sviluppo tumorale. Valutare la qualità della libreria e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti utilizzando metodi standard (ad esempio, sistemi basati su elettroforesi), se necessario.
Pooling e sequenziamento delle librerie
Quantifica ogni libreria utilizzando un saggio fluorometrico. Pool librerie a concentrazioni equimolari secondo i requisiti del kit di sequenziamento. Caricare librerie pool sulla piattaforma di sequenziamento Illumina ed eseguire il sequenziamento con un pattern di sequenziamento a due estremità da 150 bp.
Elaborazione dei dati e rilevamento di varianti
Le letture di sequenziamento grezzo sono state processate utilizzando pipeline bioinformatiche standard, inclusi il taglio degli adattatori, il filtraggio della qualità e l'allineamento al genoma di riferimento umano (GRCh37/hg19). Le metriche di controllo qualità erano le seguenti: Q20 > 85%, profondità media di sequenziamento > 2500x, tasso di on-target > 65% e penalità base Fold 80 ≤ 2. Controllo qualità e allineamento: I dati grezzi di FASTQ sono stati sottoposti a controllo qualità utilizzando FastQC e Trim Galore (o Trimmomatic) per rimuovere la contaminazione da adattatori e sequenze di bassa qualità. Le letture pulite sono state allineate al genoma di riferimento umano GRCh37 (hg19) utilizzando l'allineatore Burrows-Wheeler (BWA). Elaborazione post-allineamento: Ordinamento, marcatura duplicata e ricalibrazione del punteggio di qualità base (BQSR) sono stati eseguiti utilizzando Picard e il Genome Analysis Toolkit (GATK) per minimizzare le chiamate falsamente positive. Chiamata variante: Polimorfismi a singolo nucleotide germinale (SNP) e InDels sono stati rilevati tramite BWA MEM (0.7.16a - r1181). Gli SNV somatici e gli InDels sono stati identificati tramite un approccio consensuale utilizzando Mutect2 e VarScan2. Le mutazioni a bassa frequenza sono state ulteriormente valutate utilizzando il modello statistico di Freebayes (v 1.3.2). Annotazione e filtraggio: Le varianti sono state annotate usando ANNOVAR, integrando dati da gnomAD, ClinVar e COSMIC. Le varianti germinali sono state distinte dalle mutazioni somatiche filtrando gli SNP di popolazione ad alta frequenza e valutando le frequenze alleliche varianti (VAF). Soglie VAF: Un cutoff VAF del ≥5% è stato utilizzato per eventi clonali (ad esempio ROS1 e ALK), mentre una soglia dell'1% è stata applicata alle mutazioni geniche (ad esempio, EGFR) per garantire il rilevamento di alterazioni a bassa frequenza, reso possibile dall'elevata profondità media di sequenziamento di >500x. Le mutazioni germinali sono state distinte da quelle somatiche utilizzando i dati del 1000 Genomes Project (1000G) e un database locale di base di individui Han sani stabilito nel nostro laboratorio. La valutazione della patogenicità delle varianti somatiche rilevate è stata effettuata secondo il framework AMP/ASCO/CAP 11, che affina la valutazione delle evidenze per le varianti somatiche attraverso un approccio a livelli basato sulle evidenze. Le varianti patogene/probabilmente patogene (P/LP) vengono mantenute, con la loro classificazione basata su criteri di Tier I/II che richiedono evidenza A/B (APPROVAZIONE FDA, studi clinici) o C/D (studi preclinici/casi) per la classificazione. Il Tier III (VUS) manca di evidenze concludenti, mentre il Tier IV indica varianti benigne attraverso la frequenza della popolazione (ad esempio, gnomAD) o studi funzionali; queste mutazioni sono escluse dalle analisi successive. La valutazione della patogenicità delle varianti della linea germinale rilevate è stata effettuata secondo le linee guida ACMG/AMP 12. In questo studio sono state registrate varianti di patogeno (P), probabile patogeno (LP) e significato incerto (VUS). Solo varianti ad alta fiducia che superano i criteri di controllo qualità sono state incluse nelle analisi a valle (QUAL ≥1; profondità di copertura >10 per la mutazione della linea germinale e profondità di copertura >500x per mutazione somatica)
Preparazione del campione da tessuto FFPE
Preparazione delle sezioni a paraffina
Taglia i blocchi di tessuto FFPE in sezioni spesse 3 μm usando un microtomo. Fai galleggiare le sezioni su un bagno d'acqua a 40–45 °C per appiattire il tessuto. Monta le sezioni su vetri adesivi al microscopio e asciuga a temperatura ambiente. Posizionare i vetri in un forno di asciugatura a 65 °C per 1 ora per garantire una solida adesione delle sezioni di tessuto alle vetrine e per sciogliere la paraffina in eccesso.
Deparaffinizzazione e reidratazione
Metti i vetrini in una grigliera per la tintura e immergile nella soluzione di pulizia I per 5 minuti. Trasferire le vetrine sequenzialmente alla soluzione di pulizia II e alla soluzione di pulizia III, ciascuna da 5 minuti, per sciogliere completamente la paraffina. Trasferisci i vetri al 100% di etanolo per 3 minuti per rimuovere il residuo del reagente di eliminazione. Reidratare le sezioni del tessuto tramite una serie di etanolo graduato: etanolo al 95% per 3 minuti e 80% etanolo per 3 minuti. Risciacquo 2 volte in acqua distillata, lasciando 3 minuti tra un lavaggio e l'altro. Xilene ed etanolo utilizzati durante la deparaffinizzazione venivano gestiti in una cappa chimica a causa della loro volatilità e tossicità. Tutte le soluzioni di rifiuti contenenti solventi organici sono state raccolte separatamente e smaltite secondo le linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
Partizione con colorazione HE
Colorazione con ematossilina ed eosina
Immergi i vetri dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione in soluzione di ematossilina per 5–10 minuti a temperatura ambiente. Risciacquo i vetri sotto acqua del rubinetto corrente per 5 minuti. Differenziare i vetri in alcol di acido cloridrico all'1% per alcuni secondi (3–10 s). Sciacquare immediatamente con acqua corrente del rubinetto. Nuclei blu immergendo i vetri nell'acqua del rubinetto o in una soluzione blu per 5 minuti. Immergi i vetri in soluzione di eosina per 1–3 minuti a temperatura ambiente. Risciacqua brevemente con acqua distillata se necessario.
Disidratazione e pulizia
Il disidratato passa attraverso etanolo classificato: etanolo all'80% per 1 minuto; 95% etanolo per 1 minuto, e 100% etanolo 2 volte per 1 minuto. Trasparire le vetrine nello xilene I–II, 2–5 min ciascuna.
Montaggio
Applica una goccia di balsamo neutro. Metti con cura una copertura per evitare bolle d'aria. Lascia asciugare i vetri a temperatura ambiente prima dell'imaging.
Colorazione immunofluorescenza multiplex delle sezioni tissutali FFPE
È stata eseguita una colorazione immunofluorescenza multiplex sequenziale per rilevare molteplici marcatori immunitari e tumorali sulla stessa sezione tissutale. Questo approccio consente la visualizzazione in situ di popolazioni cellulari diverse preservando il contestospaziale 13. Recupero di antigeni: Riempi un barattolo di colorazione con un buffer per il recupero di antigeni. Metti il barattolo in un forno a microonde e riscalda a potenza alta per 3-5 minuti finché la soluzione non inizia a bollire. Trasferire con cura i vetri dopo la deparaffinizzazione e la reidratazione nel tampone riscaldato di prelievo, assicurando che le sezioni del tessuto siano completamente sommerse. Il calore scorre a bassa potenza a microonde per 15 minuti per permettere una smascheratura efficace degli antigeni. Dopo il riscaldamento, lascia raffreddare i vetri naturalmente a temperatura ambiente per 30 minuti. Trasferire i vetri in acqua ghiacciata per 5 minuti per fermare il processo di prelievo dell'antigene.
Lavaggio e preparazione della barriera idrofobica
Risciacquo 1 volta con acqua distillata per rimuovere residui di cuscione di recupero. Usa una penna barriera idrofobica per tracciare un cerchio intorno a ogni sezione di tessuto. Sciacquare di nuovo brevemente con acqua distillata. Lava i vetri 2 volte con il tampone TBST. Dopo ogni lavaggio, posiziona i vetri orizzontalmente per 3 minuti per garantire una rimozione completa del tampone.
Bloccaggio
Applica un tampone bloccante per coprire completamente la sezione del tessuto (~100 μL per vetrina). Incubare i vetri in una camera umidificata a temperatura ambiente per 15 minuti.
Incubazione primaria degli anticorpi
Rimuovi il buffer di blocco battendo delicatamente il bordo del slide sulla carta assorbente. Gli anticorpi primari contro HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK sono stati applicati a diluizioni operative ottimizzate che variavano da 1:100 a 1:400. Applicare ~100 μL di soluzione primaria diluita per anticorpi su ogni sezione tissutale. Incubare le vetrine in una camera umidificata: 37 °C per 1 ora, o 4 °C durante la notte per aumentare la sensibilità.
Lavaggio
Lava i vetri 3 volte con TBST buffer, 3 minuti per ogni lavaggio. Posiziona i lancioni orizzontalmente dopo ogni lavaggio per permettere il drenaggio del tampone.
Incubazione secondaria degli anticorpi
Preparare la soluzione secondaria di anticorpi diluendo 1:3 nel tampone TBST. Applicare circa 100 μL di soluzione secondaria di anticorpi su ciascuna vetrina. Incubare i vetri a 37 °C per 10 minuti in una camera umidificata. Lava i vetri 3 volte con TBST, 3 minuti per ogni lavaggio.
Amplificazione del segnale fluorescente
Diluire il reagente di amplificazione fluorescente 1:100 nel buffer di amplificazione. Applicare 100 μL di reagente diluito su ciascuna lamina. Incubare le vetrine a temperatura ambiente per 10 minuti al buio per prevenire il fotosbiancamento. Lava i vetri 3 volte con TBST, 3 minuti per ogni lavaggio.
Recupero di antigeni tra marcatori
Esegui il recupero antigenico a microonde come descritto. Dopo il riscaldamento, si raffreddano i diavolo in sequenza: 5 minuti in acqua tiepida e 5 minuti in acqua ghiacciata.
Colorazione sequenziale di ulteriori marcatori
Ripetere i passaggi di incubazione degli anticorpi primari e secondari per ogni ulteriore marcatore anticorpale. Assicurarsi che il prelievo dell'antigene venga eseguito dopo aver colorato ogni marcatore prima di passare al successivo anticorpo.
Controcolorazione nucleare
Lava i vetri 1 volta con il tampone TBST. Applica una tinta nucleare DAPI. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti al buio. Lava i vetri 3 volte con acqua distillata. Determinazione dell'endpoint: I nuclei dovrebbero apparire chiaramente colorati sotto microscopia a fluorescenza.
Colorazione finale solo con il marcatore finale
Applicare soluzione di biotina diluita 1:200 in tampone di amplificazione, incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lava i vetri 3 volte con il tampone TBST. Esegui il prelievo dell'antigene come descritto. Lava i vetri 3 volte con il tampone TBST. Applica il reagente endogeno che blocca la biotina, incuba a 37 °C per 30 minuti. Applica il colorante 1:100 in TBST e incuba 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Lava i vetri 1 volta con TBST e lascia svuotare per 3 minuti.
Montaggio
Aggiungi una goccia di Antifade Mounting Medium sulla sezione di tessuto. Metti con cura un biglietto sopra lo scivolo. Lascia asciugare i vetrini prima dell'imaging.
Acquisizione di immagini delle sezioni H&E e mIF
Sono state acquisite immagini a vetrina intera (WSI) di sezioni di tessuto con colorazione H&E e mIF con FFPE utilizzando uno scanner per vetrine. La scansione in campo chiaro veniva eseguita per le sezioni H&E, mentre la scansione a fluorescenza veniva utilizzata per le sezioni mIF. Obiettivo: ingrandimento 20x per la scansione panoramica; Ingrandimento 40x per immagini regionali ad alta risoluzione. Impostazioni di eccitazione ed emissione: ottimizzate per ogni fluoroforio secondo le specifiche del produttore. Tempo di esposizione e guadagno: Regolati automaticamente dal software di imaging per garantire un'intensità del segnale adeguata senza saturazione.
Controllo qualità mIF e valutazione dell'immagine
Per garantire l'affidabilità dei risultati dell'mIF, è stato implementato un rigoroso protocollo QC prima della classificazione dei tessuti e della quantificazione cellulare utilizzando il sistema di patologia digitale HALO. Rimozione di artefatti e definizione dell'area valutabile: Le immagini a diapositiva intera (WSI) sono state esaminate meticolosamente per escludere manualmente regioni contenenti pieghe tissutoriali, artefatti di colorazione e segnali di fondo non specifici. Questo passaggio era essenziale per prevenire segnali falsi positivi e garantire l'accuratezza dell'analisi spaziale. Dopo questo screening, una media dell'80% (intervallo: 50%–95%) dell'area tissutale su tutti i campioni è stata designata come regione mIF valutabile. Verifica patologica e partizionamento: Per delimitare accuratamente i compartimenti tumorali e stromali, le sezioni mIF sono state incrociate con sezioni seriali adiacenti colorate con H&E. Le annotazioni sono state esaminate indipendentemente da due patologi esperti, con eventuali discrepanze risolte per consenso. I campioni con un'area tissutale tumorale inferiore al 30% sono stati esclusi dallo studio per mantenere la rigore analitica. Validazione post-quantificazione: Dopo la fenotipizzazione e quantificazione automatica delle cellule, la distribuzione spaziale e i modelli di espressione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie sono stati rivalutati dai patologi. Questa revisione ha garantito che i dati quantitativi digitali fossero coerenti con le caratteristiche istomorfologiche sottostanti, garantendo così affidabilità e accuratezza dei risultati.
Analisi patologica digitale e annotazione regionale
Le immagini panoramiche scansionate sono state importate nella piattaforma digitale di analisi delle immagini patologiche per l'elaborazione. Il plugin HALO AI Nuclei Seg-Plugin veniva utilizzato per segmentare e identificare le cellule. Utilizzando la colorazione H&E come riferimento, le seguenti regioni di interesse (ROI) sono state annotate manualmente: Regione tumorale intera (WSIT); Confine tumorale (TB); Nucleo tumorale (TC). La rilevazione del segnale positivo è stata determinata sulla base delle soglie di intensità di fluorescenza e della localizzazione subcellulare attesa di ciascun marcatore. Questo approccio specifico per compartimento è stato applicato per minimizzare le interferenze di fondo e migliorare l'accuratezza dell'identificazione delle cellule immunitarie. La densità delle cellule immunitarie è stata quantificata come il numero di cellule marcatori positive per regione tumorale selezionata. Allineare le immagini mIF con le corrispondenti annotazioni derivate da H&E basate sulla morfologia tissutale. I pazienti sono stati stratificati in gruppi ad alta densità e bassa densità in base al valore mediano della densità cellulare immunitaria per ciascun marcatore.
Analisi statistica
Per l'analisi veniva utilizzato il software SPSS 17.0. I dati normalmente distribuiti sono stati espressi come media ± deviazione standard, mentre i dati quantitativi non normalmente distribuiti sono stati espressi come mediana (intervallo quantile 25%-75%). La correlazione tra ogni tipo di mutazione genica, densità cellulare immunitaria e caratteristiche cliniche è stata analizzata dal modello di regressione dei rischi proporzionali di Cox utilizzando il modello delle linee vitali del python. A seconda della dimensione del campione e se i dati rispettavano la distribuzione normale, per il confronto tra variabili continue veniva utilizzato il test di Student o il test Mann-Whitney U. Il test del rango segnato di Wilcoxon è stato utilizzato per il confronto delle variabili di rango. Il test chi-quadrato o test esatto di Fisher è stato selezionato per l'analisi delle variabili categoriche non ordinate in base alla dimensione del campione e alla frequenza teorica. Il test di Spearman o test di Pearson veniva utilizzato per l'analisi di correlazione. Il tasso complessivo di sopravvivenza dei pazienti è stato ottenuto con il metodo Kaplan-Meier, e per i test è stato utilizzato il test Log-rank. Le curve di sopravvivenza venivano disegnate utilizzando il linguaggio R basato sul software RStudio. Il valore p <0,10 è stato considerato statisticamente significativo.
Applicabilità pratica e limitazioni
Per un'implementazione affidabile di questo flusso di lavoro integrato, i blocchi di tessuto FFPE devono rispettare rigorosi standard di qualità, inclusa una cellularità tumorale ideale del ≥30% e l'assenza di necrosi estesa o artefatti tissutali significativi. Il successo tecnico dell'mIF dipende fortemente dalla conservazione dei tessuti; Fattori come sovrafissazione, danni eccessivi o alta autofluorescenza di fondo possono portare a una penetrazione inadeguata degli anticorpi e a un'intensità del segnale subottimale. Inoltre, dovrebbero essere considerate diverse limitazioni intrinseche di questo studio. Innanzitutto, l'analisi si basa su una coorte retrospettiva e monocentrica di 63 pazienti, il che potrebbe limitare il potere statistico e l'ampia generalizzazione dei risultati ad altre popolazioni. In secondo luogo, l'ambito della valutazione è limitato a un pannello NGS fisso di 37 geni e a un insieme specifico di marcatori immunitari (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK; Tabella supplementare 1). Come indicato nelle fonti, sebbene questo approccio combinato fornisca un quadro più solido per la stratificazione prognostica, sono necessari studi prospettici più ampi e multicentrici per convalidare ulteriormente queste associazioni e affinare l'utilità predittiva dei biomarcatori identificati.
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Caratteristiche cliniche dei pazienti con adenocarcinoma polmonare
In questo studio sono stati raccolti in totale 63 pazienti diagnosticati con LUAD e sottopostia trattamento chirurgico nel nostro ospedale dal 2015 al 2021 e che soddisfacevano i criteri di inclusione. Le caratteristiche cliniche dei pazienti inclusi sono mostrate nella Tabella 1. Tra i pazienti arruolati, l'età mediana era di 60 anni (47-73 anni), inclusi 30/63 pazienti masch...
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Profilazione integrata genomica e immunologica a risoluzione spaziale del LUAD
Questo studio dimostra un flusso di lavoro integrato che combina NGS mirati e mIF per caratterizzare il paesaggio multidimensionale del LUAD. I nostri risultati genomici sono in linea con la letteratura precedente, in particolare riguardo alle variazioni etniche nelle frequenze delle mutazioni. Il tasso osservato di mutazione EGFR (circa 40%-60%) è coerente con le frequenze riporta...
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Gli autori dichiarano che non si trattengono relazioni commerciali o finanziarie che possano essere considerate un potenziale conflitto di interessi.
Questo lavoro è stato supportato dal Progetto del Piano Medico e Scientifico e Tecnologico della Provincia di Zhejiang (2022KY1237); il Progetto Fondo di Ricerca Scientifica del Dipartimento dell'Istruzione dello Yunnan (2025Y0387); Il Programma Chiave di Ricerca e Sviluppo dello Yunnan (202403AC100002).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA Multiplex IHC Kit | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Mezzo di montaggio antifade | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lot0525A17 | Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| CD163 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| CD206 | Abcam, Inc | Gatto # 5307-1 | RRID:AB_10896526; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| CD68 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Panel Genetico del Cancro personalizzato | TWIST Co., Ltd. | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; | |
| Buffe di deparaffinizzazione | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | Estrazione del DNA per colorazione HE; Colorazione immunofluorescenza multiplex da sezioni di tessuto FFPE |
| Dynabead M-270 streptavidina | Thermo Co., Ltd. | 65602 | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; |
| Fluorometro | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; |
| Piattaforma digitale di analisi delle immagini patologiche HALO | Indica Labs, Inc., Albuquerque | Versione 3.6.4134 | Colorazione HE e analisi della colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Kit per la colorazione dell'ematossilina-eosina | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | Macchiatura HE |
| HiPure FFPE DNA Kit | Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | Estrazione del DNA da sezioni di tessuto FFPE |
| HLA-DR | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Sequencer di DNA Illumina | Illumina, Inc | 550DX | Sequenziamento |
| Balsamo neutro | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | Macchiatura HE |
| Panck | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| PD-L1 | Sistemi R e D | Catalogo # AF1019 | RRID:AB_354540; Colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Buffer TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | Colorazione HE e colorazione immunofluorescenza multiplex |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; | |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme Co., Ltd. | N411 | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; |
| Libreria uniersal DNA VAHTS Kit preparazione per illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; |
| Sistema di imaging a vetrata intera | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 versione 3.3 | Colorazione HE e analisi della colorazione immunofluorescenza multiplex |
| Kit di ibridazione e lavaggio xGen | IDT Co., Ltd. | 1080577 | Preparazione della Biblioteca NGS & nbsp; |
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