Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNAN 6-metiladenosina

Suxia Guo; Junli Chang; Xiaobo Wang; Fulai Zhao; Peng Zhao; Binghan Yan; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69860

Articolo metodologico

Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNA^N 6-metiladenosina

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DOI:

10.3791/69860

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6 febbraio 2026

Suxia Guo^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Xiaobo Wang¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Binghan Yan¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare semi-quantitativamente i livelli globali di m⁶A utilizzando dot blot. L'RNA totale viene estratto, denaturato, maculato su una membrana di nylon, sondato con anticorpi anti-m⁶A e visualizzato tramite chemiluminescenza. L'intensità del segnale, quantificata dall'analisi in scala di grigi ImageJ, riflette l'abbondanza relativa di metilazione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per la ricerca.

Abstract

N 6-metiladenosina (m⁶A) è la modifica interna più abbondante nell'RNA messaggero eucariota (mRNA) e funge da regolatore chiave dell'espressione genica post-trascrizionale. I metodi per l'indagine della m⁶A possono essere applicati a molteplici livelli di risoluzione, inclusa la quantificazione globale, la rilevazione specifica dei nucleotidi e l'analisi di particolari trascrizioni di interesse. Tra questi, il saggio dot blot offre un approccio diretto, rapido ed economico per la valutazione semi-quantitativa dei livelli globali di modifica m⁶A. In questo saggio, le cellule vengono prima processate per estrarre l'RNA totale, che viene poi diluito e denaturato. I campioni di RNA sono punteggiati su una membrana di nylon, sondati con un anticorpo anti-m⁶A e visualizzati tramite chemiluminescenza, con l'intensità del segnale che indica l'abbondanza relativa di metilazione. Infine, la quantificazione e il confronto delle intensità dei segnali vengono effettuati misurando i valori in scala di grigi con ImageJ. Rispetto ai metodi basati su sequenziamento o spettrometria di massa, il dot blot richiede una strumentazione minima e competenze tecniche, rendendolo particolarmente adatto per screening di routine, studi funzionali preliminari e analisi comparative. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato e riproducibile per implementare il saggio blot m⁶A in applicazioni sia di ricerca di base che traslazionali.

Introduzione

N 6-metiladenosina (m⁶A) è la modifica interna più diffusa nell'RNA messaggero eucariota (mRNA) e svolge un ruolo essenziale nella regolazione post-trascrizionale, inclusa la stabilità dell'RNA, lo splicing, la degradazione, la traduzione e^{l'esportazione} ^1,2,3. La disregolazione della modifica m⁶A è stata implicata in diversi processi fisiologici e patologici, tra cui l'iniziazione, la progressione e la metastasi^tumorale ^4,5. Nell'osteosarcoma, sono stati osservati livelli ....