Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNAN 6-metiladenosina

Suxia Guo; Junli Chang; Xiaobo Wang; Fulai Zhao; Peng Zhao; Binghan Yan; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69860

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Articolo metodologico

Test Dot Blot per Rilevare i Livelli Globali di Modifica dell'RNA^N 6-metiladenosina

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DOI:

10.3791/69860

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6 febbraio 2026

Suxia Guo^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Xiaobo Wang¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Binghan Yan¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare semi-quantitativamente i livelli globali di m⁶A utilizzando dot blot. L'RNA totale viene estratto, denaturato, maculato su una membrana di nylon, sondato con anticorpi anti-m⁶A e visualizzato tramite chemiluminescenza. L'intensità del segnale, quantificata dall'analisi in scala di grigi ImageJ, riflette l'abbondanza relativa di metilazione, fornendo un flusso di lavoro riproducibile per la ricerca.

Abstract

N 6-metiladenosina (m⁶A) è la modifica interna più abbondante nell'RNA messaggero eucariota (mRNA) e funge da regolatore chiave dell'espressione genica post-trascrizionale. I metodi per l'indagine della m⁶A possono essere applicati a molteplici livelli di risoluzione, inclusa la quantificazione globale, la rilevazione specifica dei nucleotidi e l'analisi di particolari trascrizioni di interesse. Tra questi, il saggio dot blot offre un approccio diretto, rapido ed economico per la valutazione semi-quantitativa dei livelli globali di modifica m⁶A. In questo saggio, le cellule vengono prima processate per estrarre l'RNA totale, che viene poi diluito e denaturato. I campioni di RNA sono punteggiati su una membrana di nylon, sondati con un anticorpo anti-m⁶A e visualizzati tramite chemiluminescenza, con l'intensità del segnale che indica l'abbondanza relativa di metilazione. Infine, la quantificazione e il confronto delle intensità dei segnali vengono effettuati misurando i valori in scala di grigi con ImageJ. Rispetto ai metodi basati su sequenziamento o spettrometria di massa, il dot blot richiede una strumentazione minima e competenze tecniche, rendendolo particolarmente adatto per screening di routine, studi funzionali preliminari e analisi comparative. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato e riproducibile per implementare il saggio blot m⁶A in applicazioni sia di ricerca di base che traslazionali.

Introduzione

N 6-metiladenosina (m⁶A) è la modifica interna più diffusa nell'RNA messaggero eucariota (mRNA) e svolge un ruolo essenziale nella regolazione post-trascrizionale, inclusa la stabilità dell'RNA, lo splicing, la degradazione, la traduzione e^{l'esportazione} ^1,2,3. La disregolazione della modifica m⁶A è stata implicata in diversi processi fisiologici e patologici, tra cui l'iniziazione, la progressione e la metastasi^tumorale ^4,5. Nell'osteosarcoma, sono stati osservati livelli elevati di m⁶A sia nelle linee cellulari che nei tessuti, suggerendo un ruolo della metilazione aberrante dell'RNA nella biologia^{delle malattie} ^6,7. Pertanto, la valutazione sistematica dell'abbondanza globale di m⁶A, insieme ai suoi cambiamenti nei trascrizioni associati all'osteosarcoma e nelle vie regolatorie, è essenziale per chiarire i meccanismi biologici e le implicazioni cliniche della metilazione dell'RNA nell'osteosarcoma.

Sono disponibili diversi metodi analitici per studiare le modifiche^m⁶A ^8,9. I saggi basati su cromatografia liquida-spettrometria di massa/spettrometria di massa (LC-MS/MS⁾¹⁰ e i saggi basati su immunosorbente legato a enzimi (^{ELISA) 11} sono entrambi utilizzati per misurare i livelli globali di m⁶A. Il primo offre un'elevata sensibilità ma richiede attrezzature e competenze specializzate, mentre il secondo fornisce^{relativi m}6 A level e contribuisce a un costo superiore rispetto al saggio dot blot. MeRIP-qPCR consente una valutazione mirata di trascritti specifici, ma è fortemente influenzata dall'efficienza^{dell'immunoprecipitazione 12}. ^{MeRIP-seq 13}, m⁶A-seq¹⁴ e m⁶A-SAC-seq¹⁵ sono approcci basati sul sequenziamento, che possono mappare con precisione i siti di metilazione m⁶A; tuttavia, sono costose e richiedono un'ampia analisi bioinformatica.

Il saggio blot di punti m⁶A offre un metodo semplice, rapido ed economico per determinare i livelli globali di modifica di m⁶A nell'RNA. Come immunosaggio semi-quantitativo, il suo principale vantaggio risiede nel generare una visione complessiva dell'abbondanza di m⁶A senza la necessità di apparecchiature specializzate o analisi bioinformatiche complesse. Questo rende il test blot di punti m⁶A uno strumento prezioso per lo screening di routine, la validazione funzionale preliminare e la ricerca clinica, oltre a un complemento pratico agli approcci avanzati basati su sequenziamento e spettrometria di massa. L'attuale protocollo offre un flusso di lavoro dettagliato passo dopo passo, garantendo la rilevazione riproducibile e un'ampia applicabilità.

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Protocollo

NOTA: Il protocollo è organizzato in tre sezioni: preparazione dell'RNA, test dot blot e quantificazione. La Tabella dei Materiali riassume i materiali richiesti, la Tabella Supplementare 1 dettaglia le formulazioni dei reagenti e la Figura 1 illustra il flusso di lavoro sperimentale.

1. Preparazione dell'RNA

Preparazione cellulare
1. Rimuovere le cellule 143B con knockdown stabile SNHG21 (shSNHG21), cellule di controllo negative (shCtrl) e cellule trattate con 3-deazaadenosina (3-DAA; [100 μM, 24 h]) e acido meclofenamico (MA; [100 μM, 24 h]) dall'incubatore a 37 °C.
2. Verifica che la confluenza cellulare sia circa all'80-90% e che le cellule siano in buone condizioni al microscopio.
3. Rimuovi il mezzo di coltura, poi risciacqua le cellule due volte con 1 mL di PBS.
4. Rimuovi PBS, poi aggiungi 1 mL di tripsina per piatto da 6 cm.
5. Scuoti delicatamente per distribuire la tripsina in modo uniforme e incuba per 1 minuto.
6. Rimuovi la tripsina, poi aggiungi 1 mL di mezzo contenente il 10% di FBS per interrompere la digestione.
7. Pipetta la sospensione cellulare più volte per disperdere le cellule.
8. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga privo di RNasi da 1,5 mL.
  NOTA: Etichetta il tubo prima di usarlo. I passaggi 1.1.3 fino a 1.1.8 devono essere eseguiti in condizioni sterili.
9. Centrifuga a 1000 × g per 3 minuti, poi rimuovi completamente il soprantantante.
Estrazione di RNA
NOTA: L'estrazione di RNA viene effettuata utilizzando il kit di purificazione EZ-press.
1. Aggiungi 600 μL di tampone di lisi (presente nel kit di purificazione RNA) al pellet e al vortice per lisare completamente le cellule, lasciando che riposi per 5 minuti.
  NOTA: Circa 2 × 10⁶ cellule sono utilizzate per l'isolamento dell'RNA.
2. Aggiungi un volume uguale di etanolo al 100% e vortice in modo accurato.
3. Aggiungere 600 μL della miscela su una colonna di rotazione assemblata con un tubo di raccolta.
  NOTA: Assemblare la colonna di rotazione e il tubo di raccolta prima dell'uso, e etichettare il tubo prima dell'uso.
4. Centrifugare a 12.000 × g per 1 minuto e scartare il liquido nel tubo di raccolta.
  NOTA: Evitare il contatto tra il fondo della colonna e il liquido o l'operatore.
5. Ripeti i passaggi sopra 1.2.3-1.2.4 per la miscela rimanente.
6. Aggiungi 500 μL di tampone di lavaggio (presente nel kit di purificazione RNA) a ogni colonna di spin, lascia riposare a temperatura ambiente per 1 minuto.
7. Centrifugare a 12.000 × g per 1 minuto e scartare il liquido nel tubo di raccolta.
8. Centrifuga nuovamente la colonna vuota a 12.000 × g per 1 minuto per rimuovere il liquido residuo.
9. Trasferisci la colonna di rotazione in un nuovo tubo senza RNase da 1,5 mL, apri il coperchio e asciuga all'aria per 2 minuti.
  NOTA: Etichetta il tubo prima di usarlo.
10. Aggiungi 25-50 μL di tampone di eluzione (acqua senza enzimi) al centro della colonna di spin.
11. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
12. Centrifugare a 12.000 × g per 1 minuto per eludere l'RNA.
13. Scartare la colonna di spin e mettere l'RNA sul ghiaccio.
  NOTA: Conservare l'RNA a -80 °C fino all'uso.
Diluizione dell'RNA
1. Misurazione della concentrazione di RNA nelle cellule 143B shSNHG21, nelle cellule 143B shCtrl e nelle cellule trattate con 3-DAA e MA utilizzando uno spettrofotometro DS-11.
2. Prepara 1 μg di RNA totale da ciascuna linea cellulare.
3. Diluire serialmente l'RNA a 400 ng, 200 ng e 100 ng con acqua trattata con pirocarbonato dietilico (DEPC).
  NOTA: Regolare il gradiente di concentrazione secondo necessità.
Denaturazione dell'RNA
1. Riscaldare i campioni di RNA diluito a 95 °C per 3 minuti.
2. Trasferisci immediatamente i campioni sul ghiaccio per raffreddarli.
  NOTA: L'RNA denaturato può essere conservato a 4 °C per un massimo di 1 settimana.

2. Dot blot

Spotting di RNA
1. Taglia la membrana in nylon caricata positivamente alla dimensione desiderata.
2. Disegna le linee di riferimento e etichetta la membrana con il nome del campione.
3. Mescola l'RNA accuratamente tramite vortex delicati o pipettazioni.
4. Puntare 1-2 μL di ogni campione di RNA sulle posizioni designate sulla membrana.
  NOTA: Usa sempre le punte delle pipette senza RNasi. Evita il contatto diretto tra la punta della pipetta e la membrana. Permettere all'RNA di diffondersi naturalmente sulla membrana. Usa una nuova punta per pipetta per ogni campione. Non superare i 2 μL per punto per prevenire diffusioni irregolari.
Reticolazione dell'RNA
1. Asciuga la membrana all'aria per 3 minuti.
2. Eseguire il reticolamento dell'RNA irradiando la membrana in un reticolatore UV a 254 nm, 120 mJ/cm².
  NOTA: Incubare la membrana a 37 °C per 30 minuti come opzione alternativa.
3. Lava la membrana con 10 mL di 1x TBST su una piattaforma oscillante per 5 minuti per rimuovere l'RNA non legato.
Blocco a membrana
1. Prepara una soluzione BSA al 5%.
  NOTA: Prepara questa soluzione fresca prima dell'uso.
2. Incubare la membrana nella soluzione bloccante a temperatura ambiente per 2 ore.
Incubazione degli anticorpi
1. Incubare la membrana con anticorpo anti-m⁶A durante la notte a 4 °C.
  NOTA: Diluire l'anticorpo 1:1000 in una soluzione al 5% di BSA prima dell'uso. Incubare la membrana su una piattaforma oscillante con un lieve scuotimento (50 giri/min).
2. Lava la membrana tre volte con 10 mL di 1x TBST su una piattaforma a dondolo per 10 minuti.
3. Incubare la membrana con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) per 1 ora a temperatura ambiente.
  NOTA: Diluire l'anticorpo 1:1000 in una soluzione al 5% di BSA prima dell'uso.
4. Lava la membrana tre volte con 10 mL di 1x TBST su una piattaforma a dondolo per 10 minuti.
Rilevamento della chemiluminescenza
1. Applica uniformemente il substrato HRP chemiluminescente a gocce sulla membrana.
  NOTA: Incubare la membrana con il substrato per 1 minuto a temperatura ambiente con un leggero dondolo.
2. Rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging chemiluminescense.
3. Utilizzare una funzione di auto-esposizione nel sistema di imaging chemiluminescense come pre-scansione iniziale.
  NOTA: Accettare l'auto-tempo solo se il segnale più luminoso è saturo inferiore al 65%; altrimenti, dimezzare l'esposizione e riacquisire finché il segnale di picco non scende entro il 30-60%.
Colorazione con blu di metilene (MB)
1. Incubare la membrana nella soluzione di colorazione MB per 1 minuto.
2. Lava la membrana tre volte con 10 mL di 1x TBST su una piattaforma oscillante per 5 minuti, e immaginela come controllo di carico.
  NOTA: Tingere la stessa membrana utilizzata per la chemiluminescenza. Evita di disturbare i sedimenti nella soluzione di colorazione. Indossa indumenti protettivi e mascherina, perché il MB è difficile da togliere.
3. Rimuovere la membrana con MB-blot dopo l'imaging utilizzando una soluzione contenente SDS all'1% su una piattaforma oscillante per 15 minuti per facilitare la documentazione o una potenziale ri-sondaggio.

3. Quantificazione

Misurazione del valore in scala di grigi
1. Importa l'immagine nel software ImageJ.
2. Converti l'immagine in formato a 8 bit usando il Tipo > Immagine > 8 bit.
3. Sottrai il background con il processo > sottrai il background.
  NOTA: Raggio: 50,0 pixel, controlla sfondo chiaro.
4. Usa lo strumento Rettangolo per selezionare l'area di analisi.
5. Definisci le corsie in sequenza con Analizza > Gels > seleziona la prima corsia.
6. Genera profili di intensità usando Analizza > Geli > traccia le corsie e misura i picchi.
7. Misurare rispettivamente i valori in scala di grigi di m⁶A e MB.
Copia i dati in una tabella per l'analisi.
Confrontare le intensità dei segnali per valutare i livelli globali di modifica di m⁶A.

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Risultati

Per validare rigorosamente la performance del saggio dot blot e per esaminare il ruolo di SNHG21 nella regolazione dei livelli globali di m^6A , 143 cellule B sono state sottoposte a perturbazioni farmacologiche che sopprimono o aumentano la metilazione di m^6A e monitorano l'abbondanza di m^6A in entrambe le direzioni.

Quantificazione da macchia a punti dell'abbondanza globale m⁶ A
Abbiamo innanzitutto valutato la c...

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Discussione

In questo studio, il knockdown di SNHG21 nelle cellule osteosarcoma 143B ha portato a una riduzione dell'intensità del segnale m⁶A, dimostrando il valore di questo saggio per valutare se le modifiche genetiche influenzano la metilazione dell'RNA. Inoltre, questo saggio funge da strumento per molteplici applicazioni, tra cui: 1) Studi funzionali e validazione meccanicistica: Questo saggio può essere utilizzato per uno screening preliminare rapido per determinare se i livelli globali di m⁶...

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Dichiarazioni

Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro fu sostenuto da sovvenzioni della National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 e 82474535). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3-deazaadenosina (3-DAA)	MCE	HY-W013332A	1 mg
Anticorpo monoclonale anti-m6A	Proteintech	68055-1-IG	50 & mu; L
Albumina sierica bovina (BSA, Frazione V)	BioFroxx	4240GR100	100 g
Sistema di imaging ChemiDoc MP	BIO RAD	12003154
DMEM Alto Glucosio	WISENT	319-005-CL	500 mL
Spettrofotometro DS-11	DeNOVIX	DS-11
Kit di purificazione RNA EZ-press	EZB	B0004DP	100 Preparazioni
FBS - Qualità superiore	WISENT	086-150	500 mL
IgG Anti-Topo per Capra (H+L) coniugato con HRP	Beyotime	A0216	1 mL
Substrato chemiluminescente occidentale HRP di Immobilon	Millipore	WBKLS0500	2 e volte; 250 mL
Acido meclofenamico (MA)	MCE	HY-117275	1 mg
Soluzione di colorazione al blu di metilene	Solarbio	G1300	0,1%, 100 mL
Membrana di trasferimento in nylon	LABSELECT	TM-NY-XS-45	7.4 e volte; 8,5 cm, 0,45 μ m, 10 PEZZI/BAG
PBS buffer (polvere secca pronta all'uso)	biosharp	BL601A	pH: 7,2-7,4, 2 L/borsa
Dodecile solfato di sodio (SDS)	Sigma	L5750-500G	500 g
Polvere premiscelata tampone TBS	Sangon	A510025-0001	1EA (243,9 g di polvere)
Enzima TrypLE Express	Gibco	12604-021	1 volte, 500 mL
Preadolescente-20	Sangon	A600560-0500	500 mL
Crosslinker UV	UVP	CL-1000

Riferimenti

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