Costruzione di organoidi delle ghiandole salivari a partire dalle piccole ghiandole salivari umane

Sommario

Questo protocollo genera organoidi delle ghiandole salivari minori umane attraverso l'auto-organizzazione delle cellule staminali delle ghiandole salivari minori umane (hMSG-SC) e delle cellule staminali mesenchimali delle ghiandole salivari minori umane (hMSG-MSC) all'interno di un sistema matrigel 3D.

Abstract

Questo studio descrive un protocollo per costruire organoidi umani delle ghiandole salivari minori (hMSG) al fine di stabilire un modello riproducibile per la ricerca sulla rigenerazione dei tessuti. Le cellule staminali/progenitrici delle ghiandole salivari (hMSG-SC) e le cellule staminali mesenchimali (hMSG-MSC) sono state isolate da tessuti delle ghiandole salivari minori pediatriche, espanse e co-seminate in un sistema tridimensionale (3D) basato su Matrigel. L'auto-organizzazione portò alla formazione di organoidi con strutture simili a quelle del ducto-acinaro, ricapitolando l'eterogeneità cellulare nativa in modo più efficace rispetto ai modelli solo epiteliali. L'attuale protocollo enfatizza condizioni di coltura ottimizzate per preservare i fenotipi cellulari e passaggi standardizzati per il passaggio, la miscelazione dei rapporti e la gestione di Matrigel (una matrice commerciale per basamento), migliorando così la riproducibilità. È importante sottolineare che la presenza di cellule mesenchimali fornisce un microambiente di supporto che favorisce la sopravvivenza, la proliferazione e la morfogenesi epiteliali, superando le limitazioni della bassa efficienza e della struttura incompleta. Questo approccio consente una generazione costante di organoidi delle ghiandole salivare e offre un modello solido per studiare lo sviluppo, il ripristino funzionale e i meccanismi delle malattie, supportando al contempo potenziali applicazioni traslazionali nelle terapie rigenerative.

Introduzione

Le ghiandole salivali sono ghiandole esocrine essenziali nella cavità orale, responsabili della secrezione della saliva per mantenere l'umidità orale, favorire la digestione e fornire difesa^{antimicrobica 1}. La disfunzione di queste ghiandole, come nella sindrome di Sjögren o nei danni post-radiazioni, può portare a gravi problemi di salute orale, e attualmente mancano trattamenti rigenerativi^{efficaci 2}. La tecnologia organoide, un metodo emergente per costruire sostituti cellulari che imitano la struttura e la funzione di tessuti e organi in un sistema di coltura tridimensionale (3D), offre uno strumento promettente per la ricerca sulla rigenerazione delle ghiandole^{salivari 3}.

Negli ultimi anni, sistemi di coltura organoide delle ghiandole salivare per topi e umani sono stati stabiliti^{con successo 4,5}. Vari tipi di cellule staminali, tra cui le cellule staminali/progenitrici^{delle ghiandole salivari 4,5}, le cellule staminali^{pluripotenti 6,7} e le cellule staminali derivate dall'epitelio come le cellule staminali follicoli^{dentali 8}, sono stati utilizzati per generare questi organoidi. Tuttavia, rimangono diverse sfide tecniche. Le cellule epiteliali epiteliali primarie delle ghiandole salivari umane (hSG-epiS/PCs) mostrano una proliferazione limitata e una bassa sopravvivenza in vitro, il che limita l'efficienza nella formazione degli organoidi e la^{riproducibilità 9}. Inoltre, gli organoidi derivati esclusivamente da cellule epiteliali spesso mancano di eterogeneità multicellulare e non riescono a riprodurre pienamente l'architettura ramificata e l'organizzazione funzionale acinar-duttale delle ghiandole^{native 10}.

In questo contesto, questo studio mira a stabilire un metodo standardizzato per la costruzione di organoidi delle ghiandole salivare minori umane. Per prima cosa, abbiamo isolato cellule staminali (hMSG-SC) e cellule staminali mesenchimali (hMSG-MSC) da tessuti minori delle ghiandole salivari^umane 11,12,13. Gli organoidi sono stati successivamente avviati tramite un meccanismo autoassemblante co-seed di hMSG-SC e hMSG-MSC in Matrigel. Questo metodo fornisce una piattaforma riproducibile per la coltura organoide delle ghiandole salivare e pone una base importante per future ricerche nella rigenerazione delle ghiandole salivare e nella modellizzazione delle malattie.

Protocollo

Campioni di ghiandola salivariare minore umana (hMSG) sono stati prelevati da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia al labbro presso il Dipartimento di Chirurgia Plastica e Ricostruttiva del Shanghai Ninth People's Hospital, Scuola di Medicina dell'Università Shanghai Jiao Tong. I pazienti (n > 10) avevano un'età compresa tra 3 e 10 anni, senza una storia di disturbi delle ghiandole o malattie autoimmuni. Tutti i tessuti sono stati prelevati da piccole ghiandole salivari ridondanti e istologicamente normali, espulse durante la riparazione del labbro leporino, che fornisce una fonte eticamente approvata e ottimale di tessuto vitale per l'isolamento delle cellule staminali/progenitrici. Il consenso informato è stato ottenuto preoperatoriamente e lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico del Nono Ospedale Popolare di Shanghai (Approvazione n.2018-56). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Raccolta di tessuto delle ghiandole salivare minori umane

1. Immediatamente dopo l'escissione, immergi i tessuti delle ghiandole salivari nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con antibiotici e manteni a 4 °C fino a ulteriori lavorazioni (entro 6 ore).

2. Isolamento cellulare dai tessuti delle ghiandole salivare minori umane

1. Garantire condizioni sterili preparando un kit chirurgico autoclavato ed eseguendo tutte le procedure all'interno di un armadietto di biosicurezza (BSC di Classe II).
2. Trasferire il tessuto esportato in una teglia di coltura contenente la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco e lavare accuratamente. Durante il lavaggio, usa delle pinze per rimuovere con cura qualsiasi tessuto connettivo e residui di sangue, assicurandoti che il tessuto delle ghiandole salivari sia completamente pulito.
3. Aggiungi 1 mL di mezzo senza siero per prevenire la disidratazione dei tessuti. Trita il tessuto in pezzi non più grandi di 0,5 mm³ usando forbici oftalmiche sterili.
4. Utilizzando pinze sterili, distribuire uniformemente i pezzi di tessuto sul fondo di una fiaschetta di coltura T-25.
5. Aggiungi 10 mL di materiale colturale alla fiaschetta di coltura.
   NOTA: Per la coltura di cellule staminali epiteliali (hMSG-SC), il principale mezzo di coltura utilizzato è il Mezzo Cheratinocitico (KM), contenente 5 μg/mL di albumina sirica bovina, 50 μg/mL estratto ipofisario bovino, 5 μg/mL transferrina, 3,75 μg/mL di insulina, 3 ng/mL fattore di crescita fibroblastica 2, 1 ng/mL fattore di crescita epidermica, 500 ng/mL epinefrina, 0,5 μg/mL di idrocortisone, ^10-8 M prostaglandine_{E 2} e 30 nM_{T 3}. Per la coltura di cellule staminali mesenchimali (hMSG-MSC), il mezzo di coltura primario è costituito da DMEM/F12 integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), 1% Penicillina-Streptomicina (5.000 U/mL) e integratore GlutaMAX all'1%.
6. Posizionare la fiaschetta T-25 verticalmente in un incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ , per 4-5 ore. In posizione verticale, il mezzo non entra in contatto con il tessuto tritato, permettendo agli expianti di depositarsi e di aderire saldamente alla superficie inferiore.
7. Dopo 4-5 ore, si sposta la fiaschetta in posizione orizzontale in modo che il mezzo di coltura copra completamente i pezzi di tessuto attaccati e supporti la crescita cellulare.
8. Sostituisci metà del mezzo al quarto giorno e poi sostituisci il mezzo ogni 3 giorni finché non compaiono le colonie cellulari. Quando si osserva un'inibizione della crescita cellulare, procedere con il passaggio.

3. Passaggio cellulare

1. Cellule del passaggio quando le colonie cellulari primarie mostrano inibizione della crescita o quando la confluenza cellulare raggiunge l'80%-90%.
2. Aspira il mezzo di coltura e lava le cellule una volta con PBS.
3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare a 37°C, 5% CO₂ per 4 minuti per le cellule epiteliali e 1,5 minuti per le cellule mesenchimali, rispettivamente.
4. Neutralizza la tripsina aggiungendo 5 mL di mezzo DMEM preriscaldato integrato con il 10% di FBS. Pipetta delicatamente le cellule per garantire una corretta dissociazione, poi trasferisci la sospensione cellulare in un tubo centrifuga e centrifuga a 300 × g per 5 minuti.
5. Scartare il sovrantante e risospendere gli hMSG-SC nel mezzo KM, e risospendere gli hMSG-MSC nel Mezzo Staminale Mesenchimale (MSCM).
6. Seminare le cellule risospese in fiaschette di coltura T-25 con un rapporto 1:3, poi incubare a 37 °C, 5% di_CO2 per una continua espansione.

4. Auto-organizzazione degli hMSG-MSC e degli hMSG-SC per la costruzione di organoidi

1. Scongela Matrigel sul ghiaccio per 3-4 ore.
2. Preriscalda una piastra da 24 pozzi a 37 °C in un incubatore e pre-raffredda le punte della pipetta a 4 °C per una maneggiamento preciso.
3. Aggiungi 450 μL di PBS sterile pre-raffreddato a 1 mL di Matrigel completamente scongelato.
4. Mescola delicatamente con punte di pipetta pre-raffreddate e distribuisci 350 μL di Matrigel diluito per pozzo nella piastra preriscaldata a 24 pozzi, assicurandosi che non si formino bolle.
5. Inclina delicatamente la piastra per garantire un rivestimento uniforme con il Matrigel.
6. Inserire il piatto in un incubatore a 37 °C e 5% di_CO2 per 20-30 minuti per permettere alla Matrigel di solidificarsi. Evita di asciugare troppo il Matrigel.
7. Coltiva hMSG-MSC e hMSG-SC nei passaggi 3-5 separatamente fino a raggiungere una confluenza dell'80%-90%. Digerire le cellule con 0,25% di Tripsina-EDTA, neutralizzare con mezzo intero e contare i numeri cellulari utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro.
8. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere in un mezzo di coltura fresco.
9. Mescola hMSG-MSC e hMSG-SC in un rapporto 1:1.
10. Seminare le cellule in piastre a 24 pozzi rivestite di Matrigel a una concentrazione totale di 2 x 10⁵ cellule per pozzo.
11. Aggiungere 1 mL di mezzo per la coltura organoide (MSCM:KM = 1:1) a ogni pozzo.
12. Incubare a 37 °C, 5% di_CO2 e cambiare il substrato ogni 3 giorni.
13. Subcoltura degli organoidi ogni 7 giorni con un rapporto di 1:2 a 1:4, e risospende in mezzo di congelamento cellulare per la conservazione a -80 °C.

5. Statistica e riproducibilità

1. Analizza tutti i dati utilizzando software statistici e grafici e presenta come media ± deviazione standard (SD). I test t di Student a due code non accoppiati sono stati utilizzati per confronti tra due gruppi. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
   NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti indipendentemente almeno tre volte con risultati simili, e tutte le analisi statistiche si sono basate su almeno tre esperimenti o campioni indipendenti.

Risultati

Gli espianti di tessuto salivari minori umani coltivati in fiaschette T25 hanno mostrato una chiara estensione cellulare intorno ai blocchi tissutali dopo circa 5 giorni. Nel mezzo di coltura di cellule staminali ricco di siero, le cellule hanno mostrato una morfologia a forma di fuso caratteristica degli hMSG-MSC (Figura 1A,B). L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che queste cellule hanno espresso alti livelli di marcatori delle cellule staminali mesenchimatici, ...

Discussione

Questo protocollo consente la costruzione efficace di organoidi delle ghiandole salivari minori umane attraverso l'isolamento e la coltura di hMSG-SC e hMSG-MSC. La formazione degli organoidi dipende da un'attenta preparazione degli eximpianti tissutori, dal mantenimento di condizioni di coltura distinte per le cellule epiteliali e mesenchimatici e da una corretta co-semina di entrambi i tipi cellulari su Matrigel. Rapporti cellulari appropriati e densità di semina sono fondamentali per ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM)	Gibco	C11885500BT
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200056
Dulbecco' s Eagle Medium Modificato (DMEM)/F12	Gibco	C11330500BT
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10270106
GlutaMAX	Gibco	35050061
Mezzo cheratinocitario	Sciencell	2101
Matrigel	BD	356230
Mezzo Cellulare Mesenchimale (MSCM)	Sciencell	7501
Penicillina/Streptomicina	Gibco	15140122
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	C20012500BT