Questo articolo presenta un modello ischemico di CKD utilizzando IRI renale unilaterale con nefrectomia controlaterale eseguita un giorno prima della raccolta del campione; questo protocollo consente la valutazione funzionale basata sul siero, la sopravvivenza elevata e la patologia riproducibile della MRC entro 28 e 42 giorni, fornendo una piattaforma versatile per studi meccanicistici e interventistici.
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Articolo metodologico
Modello murino di transizione da malattia renale acuta a cronica indotta da ischemia/lesione da reperfusione renale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'occlusione transitoria chirurgica del pedicolo renale induce lesione ischemia-reperfusione renale (IRI), un modello ampiamente utilizzato per studiare la lesione renale acuta (AKI) e la sua progressione verso malattia renale cronica (CKD) nei topi. Tuttavia, i protocolli convenzionali spesso o escludono la valutazione funzionale basata sul siero o portano a un'elevata mortalità. Sebbene i modelli IRI renali unilaterali e bilaterali esistenti sottolineino la riproducibilità, restano sfide nel raggiungere sia una gravità costante del danno sia una sopravvivenza a lungo termine adeguata allo studio della progressione della CKD. Qui presentiamo un protocollo di approccio dorsale che fornisce un modello robusto e riproducibile della transizione ischemica da AKI a CKD. L'approccio dorsale facilita un accesso diretto ai reni e minimizza la manipolazione intra-addominale. Utilizziamo IRI renale unilaterale combinata con nefrectomia controlaterale eseguita un giorno prima del prelievo di sangue e tessuti. Questo approccio offre due vantaggi principali: (1) riduce la variabilità evitando le incongruenze associate al danno bilaterale, e (2) raggiunge quasi il 100% di sopravvivenza mantenendo un danno costante, a differenza dei protocolli in cui la nefrectomia viene eseguita prima e associata a una mortalità più elevata. La valutazione funzionale viene effettuata tramite BUN e creatinina sierica, mentre la fibrosi interstiziale viene quantificata dai geni di deposizione di collagene basata su tricromo di Masson e dai geni marker CKD a 28 e 42 giorni dopo l'IRI renale. Insieme, queste letture forniscono una comprensione complementare del deficit funzionale e dello sviluppo della patologia tissutale. Questo protocollo stabilisce un modello affidabile e versatile della CKD ischemica nei topi per indagini meccanicistiche.
Introduzione
L'AKI è una complicanza comune nei pazienti ricoverati e rimane un importante problema di salute globale. Studi epidemiologici indicano che l'AKI si verifica in fino al 20% degli individui ricoverati e nel 30-60% dei pazienti in condizionicritiche 1,2. Sebbene alcuni pazienti recuperino la funzione renale, altri mostrano un recupero incompleto, predisponendoli allaCKD 3. La transizione da AKI a CKD è sempre più riconosciuta come un fattore determinante importante degli esiti a lungo termine ed è diventata un punto di riferimento della ricerca meccanicistica e terapeutica 4,5,6. Per studiare i meccanismi molecolari sottostanti e testare potenziali terapie, sono essenziali modelli animali riproducibili.
L'occlusione transitoria chirurgica del pedicolo renale (arteria e vena) induce IRI renale, uno dei modelli più ampiamente utilizzati per lo studio dell'AKI nei topi. Questa procedura causa una lesione epiteliale tubolare acuta e una risposta infiammatoria che può evolvere in fibrosi interstizialecronica 7,8. Tuttavia, i protocolli IRI renali convenzionali presentano diverse sfide. L'IRI renale unilaterale è associata a una mortalità minima ed è ampiamente impiegata per indagini a lungotermine 9; tuttavia, la valutazione della funzione renale (ad esempio, chimica sierica, analisi delle urine o tasso di filtrazione glomerulare) non è fattibile. L'IRI renale bilaterale o i modelli che combinano IRI renale unilaterale con nefrrectomia controlaterale simultanea o precoce sono associati a un aumento della mortalità, limitandone l'uso per studi cronici. Sebbene variazioni robuste di questi modelli siano state recentementeindagate 10, la loro applicazione in contesti di studio cronico richiede un'attenta considerazione. Inoltre, alcuni protocolli utilizzano una laparotomia ventrale della linea mediana, che richiede la manipolazione degli organi intra-addominali per esporre il pedicolo renale. Questo può aumentare l'invasività chirurgica e la complessità tecnica. Skrypnyk et al. hanno riportato che la nefrectomia controlaterale eseguita 8 giorni dopo l'ischemia unilaterale consente la valutazione sierologica della funzione renale dopo la lesione, mantenendo un alto tasso disopravvivenza 11. Questo protocollo fornisce un insieme sistematico di procedure ottimizzate per valutare la progressione dall'AKI alla CKD in un periodo fino a 42 giorni.
Questo studio dimostra un modello ischemico AKI-CKD utilizzando IRI renale unilaterale, seguito da una nefrectomia controlaterale ritardata eseguita un giorno prima del prelievo di reni e campioni di sangue. In passato abbiamo adottato procedure simili come modello AKI in molteplicipubblicazioni 12, 13, 14, 15. Abbiamo esteso con successo questo approccio per studiare la transizione da AKI a CKD, in cui, entro i giorni 28 e 42, sono evidenti chiari segni di CKD (Figura 1 per lo schema). Questo approccio garantisce un'eccellente sopravvivenza, induce un fenotipo altamente fibrotico nei reni danneggiati e consente la valutazione della funzione renale utilizzando il sangue raccolto. Pertanto, questo approccio è particolarmente utile per studi che richiedono una valutazione sierologica (a differenza dell'IRI renale unilaterale sola) e un tasso di sopravvivenza migliorato (rispetto all'IRI renale bilaterale). È stato utilizzato un approccio a fianco dorsale per accedere direttamente al rene. Rispetto alla laparotomia ventrale della linea mediana, questo approccio minimizza la manipolazione intra-addominale e confina la manipolazione chirurgica ai tessuti renali e periilari, migliorando così la consistenza procedurale.
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Protocollo
Gli esperimenti con animali condotti in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Pittsburgh (IACUC; Protocollo n. 23103811), in conformità con le linee guida istituzionali. Un gruppo di controllo per chirurgia fittizia può essere incluso, se opportuno, e tipicamente subisce un'esposizione chirurgica senza clampaggio vascolare o nefrectomia controlaterale. Consulta la sezione Materiali per informazioni dettagliate sugli strumenti e le attrezzature utilizzate. Gli oggetti appuntissimi, inclusi aghi, bisturi e clipglie, devono essere smaltiti in contenitori appositi per oggetti appuntiti. I rifiuti biologici, inclusi tessuti e cadaveri, devono essere gestiti e smaltiti in conformità con i protocolli istituzionali per i rifiuti biologici. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione degli animali e allestimento chirurgico
- Autoclave di tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso. Quando si effettuano interventi chirurgici su più animali, rimuovi sangue e detriti dagli strumenti tra una procedura e l'altra, poi sterilizzali per 10-15 secondi usando uno sterilizzante a perle calde. Lascia raffreddare gli strumenti prima di riutilizzarli.
- Installa un cuscinetto riscaldante che fa circolare l'acqua e posiziona una lampada a infrarossi sopra il campo operatorio.
- Inserire il topo in una camera di induzione anestesica e indurre l'anestesia con isoflurano (1,5%-2% in ossigeno, 1-2 L/min) (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Quando il topo sembra aver perso conoscenza, confermare la profondità anestetica adeguata eseguendo un pizzicamento all'alza dei piedi per verificare la perdita dei riflessi.
- Trasferire il topo sul pad chirurgico riscaldato e mantenere l'anestesia tramite un cono nasale.
- Somministrare Ethiqa XR (buprenorfina a rilascio prolungato; 3,25 mg/kg, s.c.) per l'analgesia postoperatoria.
- Metti il topo in posizione prona sul tappeto chirurgico. Fissa gli arti con del nastro adesivo se necessario per minimizzare i movimenti.
- Rasi i peli dorsali intorno al sito dell'incisione previsto usando una tosa.
- Applicare una pomata oftalmica sugli occhi per evitare la secchezza durante la procedura.
- Inserisci una sonda rettale, fissala con del nastro adesivo e collegala a un termometro per un monitoraggio continuo.
- Disinfettare l'area chirurgica alternando 10% di povidone-iodio e 70% etanolo, quindi coprire l'area con una panpina sterile.
2. IRI renale unilaterale
- Fai un'incisione cutanea dorsale mediana (3-4 cm) che copre il livello renale.
- Separare la pelle dagli strati sottocutanei usando forbici separanti i tessuti.
- Identifica la posizione renale palpando attraverso la pelle.
- Al livello in cui si visualizza il rene, circa 1 cm lateralmente alla colonna vertebrale sul lato sinistro, si effettua un'incisione muscolare longitudinale di 1-1,5 cm.
NOTA: Se l'incisione è troppo lunga, il rene potrebbe scivolare nuovamente nella cavità addominale, complicando la manipolazione successiva. Un'incisione cutanea minima può mantenere il rene esteriorizzato. - Esternalizzare delicatamente il rene attraverso l'incisione dorsale. Se una membrana sottile ostacola l'accesso, sezionala in modo diretto.
- Durante la stabilizzazione del rene con pinze non seghettate, sezionare in modo diretto il grasso periilare e il tessuto connettivo attorno al pedicolo renale superiore e inferiore per creare un "canale" per il posizionamento di una pinza vascolare.
- Conferma che la temperatura corporea centrale sia sufficientemente alta (36,8-37,2 °C) prima di indurre l'ischemia. Applicare una pinza vascolare non traumatica attraversando l'arteria renale e la vena come un fascio.
NOTA: Assicurarsi che i vasi siano centrati nelle ganasce della pinza e compressi con una pressione costante. Applica la pinza in una posizione uniforme sull'hilo. Orientare la pinza perpendicolarmente all'asse del recipiente. Questa particolare pinza può essere riutilizzata per circa 10 procedure animali. - Tira la pelle per coprire il rene e mantenerlo il più vicino possibile alla temperatura corporea centrale.
- Mantenere la temperatura corporea centrale tra 36,8 e 37,2 °C durante l'ischemia impostando la pompa di calore a 38-39 °C (regolare se necessario) e accendere/spegnere la lampada a infrarossi per mantenere la temperatura corporea target (regolando la distanza della lampada secondo necessità).
NOTA: Questo sistema di riscaldamento a "sandwich", composto da una borsa riscaldante che fa circolare l'acqua e una lampada a infrarossi, mantiene efficacemente la temperatura corporea centrale entro il range ristretto di 36,8-37,2 °C. Annota la temperatura corporea centrale ogni minuto per assicurarti che sia mantenuta tra 36,8 e 37,2 °C. - Dopo 30 minuti del periodo ischemico, rimuovere la pinza e riportare il rene con un cotton fibb alla cavità addominale.
NOTA: Conferma che l'intero rene appare uniformemente pallido prima della declamp. Dopo aver rimosso la pinza, confermare il successo della reperfusione. Se la reperfusione è marcatamente ritardata, ad esempio 30 secondi o più, ciò può indicare una reperfusione incompleta e si dovrebbe considerare l'esclusione dell'animale dalle analisi successive. La suscettibilità all'IRI renale e la successiva gravità della MRC sono significativamente influenzate dall'età, dal sesso e dallo stirpe di fondo. Condurre un esperimento pilota per determinare la durata ottimale dell'ischemia è essenziale per ogni disegno di studio. - Chiudi lo strato muscolare con punti assorbibili 5-0 e poi la pelle con clip per ferite (ad esempio, 9 mm).
NOTA: Rimuovere le clip per la ferita 10 giorni dopo l'intervento. - Interrompere l'anestesia isoflurana e lasciare che il topo si riprenda in una gabbia pulita. Se l'animale si è ripreso dall'anestesia e non mostra segni di disagio o ipotermia, riporta la gabbia nella sala di manutenzione. Gli animali vengono monitorati per dolore o disagio dopo l'intervento e vengono somministrate dosi aggiuntive di Ethiqa XR secondo necessità. Gli endpoint umani sono stabiliti secondo le linee guida istituzionali IACUC per minimizzare il disagio animale.
NOTA: Ethiqa XR fornisce analgesia fino a 3 giorni. Somministrare una dose aggiuntiva se gli animali mostrano segni di dolore o disagio 72 ore dopo la dose iniziale.
3. Nefrectomia controlaterale
- Segui il passo 1, quello di preparazione degli animali.
- Esegui un'incisione cutanea come descritto nei passaggi 2.1 e 2.2.
- Al livello in cui si visualizza il rene destro, circa 1 cm laterale alla colonna vertebrale sul lato destro, si effettua un'incisione muscolare longitudinale di 1-1,5 cm.
- Mentre si tiene il rene con pinze non seghettate, si disseziona in modo diretto il grasso periilare e il tessuto connettivo per esporre il pedicolo renale.
- Separare con cura la ghiandola surrenale dal rene, lasciando intatta la ghiandola surrenale ed evitando danni ai suoi vasi.
- Legare il pedicolo renale con una clip legante (dimensione della clip: piccola) e suture di seta 4-0, poi transectare i vasi sul lato renale. Successivamente, si trasetta l'uretere e si rimuove il rene.
- Chiudi l'incisione come descritto nel passo 2.11.
4. Raccolta di sangue e tessuto renale
- Indurre anestesia nei topi con isoflurano (1,5%-2% di ossigeno, 1-2 L/min) e confermare la profondità anestetica con pizzicolio del dito per verificare la perdita dei riflessi.
- Posiziona il topo in posizione supina, poi fai un'incisione mediana e rimuovi il diaframma.
- Espone con cura il cuore e inserisci un ago da 23-G attaccato a una siringa da 3 mL nel ventricolo sinistro.
- Preleva il sangue lentamente (600-1.000 μL).
- Rimuovere l'ago per prevenire l'emolisi e trasferire il sangue nel tubo di raccolta.
- Rimuovere il rene sinistro e sezionarlo usando un bisturi (lama montata su un manico) secondo i requisiti dello studio.
- Eseguire l'eutanasia rimuovendo il cuore sotto anestesia (seguendo i protocolli approvati dall'istituzione).
- Processare i tessuti sezionati secondo i requisiti dello studio (ad esempio, fissazione, congelamento rapido).
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Risultati
Il cambiamento caratteristico del colore renale osservato durante l'intervento chirurgico ha confermato l'induzione di ischemia renale uniforme seguita da una reperfusione positiva. L'ischemia di successo è indicata da un cambiamento del colore renale da nero a viola scuro, con un miglioramento successivo dopo la rimozione di una pinza vascolare, confermando la reperfusione. Se l'ischemia renale non viene indotta con successo, il rene mostra solo un cambiamento minimo di colore e la lesi...
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Discussione
Questo protocollo fornisce un modello riproducibile indotto dall'IRI renale della transizione da AKI a CKD, caratterizzato da disfunzione renale sostenuta e fibrosi interstiziale progressiva, ampiamente considerate caratteristiche distintive dellaCKD 17,18. L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è un modello di CKD ampiamente utilizzato, che induce nefropatia ostruttiva e favorisce principalmente la fibrosi tramite ost...
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal NIDDK K01-DK133635; Premio UPMC VMI P3HVB; Premio della Fondazione Samuel ed Emma Winters; UPMC CHP RAC Grant per avvio; Premio dei finanziatori della UPMC CHP Foundation Children's Trust; Programma di Opportunità dell'Alleanza per le Risorse Renali George M. O'Brien (OKRA OPP) (a TC), NIDDK R01-DK121758; DK134346; R25-DK119180 (verso SSL), NIDDK R01-DK125015; R01-DK137410 (a JH), e Carolyn e Mark Snyder e la Famiglia Snyder (a JH e SSL). Ringraziamo il Laboratorio Centrale di Istologia UPMC CHP per l'assistenza nell'istologia e l'imaging scansionato, e i Laboratori Diagnostici Veterinari della Kansas State University per il supporto nella chimica sirica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtro gas anestesitico | A.M. Bickford | F-AIR | |
| Camera di induzione per anestesia, riscaldamento | Prodotti AIMS Lab | WCS8 | |
| Tubo di raccolta del sangue | BD Microtainer | 365967 | |
| Etanolo | Decon Labs | 2701 | |
| Ethiqa XR (buprenorfina a rilascio prolungato) | Salute Animale Fidelis | NDC 86084-100-30 | |
| Pomata per gli occhi | AKORN | NDC 17478-062-35 | |
| Compresse di garza, sterili e nbsp; | Dynarex | 3353 | |
| Tagliacapelli per piccoli animali | WAHL | CLP-9868 | |
| Lampada termica, infrarossi | Strumenti Physitemp | HL-1 | |
| Pompa di calore per la circolazione dell'acqua calda | BrainTree Scientific | HTP-1500 | |
| Sistema di calore/anestesia per piccoli animali, Versaflex | BrainTree Scientific | EZ-7150 | |
| Tende chirurgiche che trattengono il calore | Braintree Scientific | SPDR-MPS | |
| Sterilizzatore a perline calde | Simon Keller | Steri 250 | |
| Soluzione di isoflurano | Covetrus | 29405 | |
| Applicatore di clip di legatura | BLECK | 533140 | |
| Clip di legatura | BLECK | 533837 | |
| Microsonda per la temperatura rettale | Fisitempa | RETIR-3 | |
| Termometro a microsonda | Fisitempa | BAT-12 | |
| Microscopio, ottico | Leica | DM2500 | |
| Microscopio, scanner a scorrimento | Leica | Scanner diapositiva Aperio CS2 | |
| Mouse (FVB/NJ) | Laboratorio Jackson | 001800 | |
| Ago (23G) | BD | 305145 | |
| Povidone iodice swabsticks | Dynarex | 1201 | |
| Lame del bisturi | Strumenti scientifici di qualità | 10020-00 | |
| Manico di bisturi | Strumenti scientifici di qualità | 10060-13 | |
| Pinze chirurgiche, non seghette | Strumento chirurgico Roboz | RS-5228 | |
| Pinze chirurgiche, seghetta | Strumenti scientifici di qualità | 11051-10 | |
| Pinze chirurgiche, dentate | Strumenti scientifici di qualità | 11019-12 | |
| Guanti chirurgici | CTI | SPGF750 | |
| Forbici separatorie di tessuto chirurgico | Strumenti scientifici di qualità | 14072-10 | |
| Sutura, Acido Poliglicolico (PGA)/assorbibile (5-0) | Dynarex | 9131 | |
| Sutura, seta (4-0) | Oasi | MV-683-V | |
| Siringa (3ml) | BD | 309628 | |
| Tende per asciugamani, sterili | Dynarex | 4410 | |
| Pinza vascolare che applica pinze | Strumenti scientifici di qualità | 15057-14 | |
| Pinza vascolare, non traumatica | Strumenti scientifici di qualità | 18055-03 | |
| Applicatore di clip per ferite | Strumenti scientifici di qualità | 12020-09 | |
| Clip per ferite | Strumenti scientifici di qualità | 12022-09 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
