Saggio MeRIP-qPCR per la rilevazione dei livelli di modifica m6A di RNA specifici nelle cellule dell'osteosarcoma

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

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Articolo metodologico

Saggio MeRIP-qPCR per la rilevazione dei livelli di modifica m⁶A di RNA specifici nelle cellule dell'osteosarcoma

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DOI:

10.3791/69880

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30 dicembre 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un approccio dettagliato per valutare i livelli di modifica di m^6Adi RNA specifico utilizzando MeRIP-qPCR.

Abstract

La modifica epitrastrastomica dell'RNA svolge un ruolo fondamentale nell'inizio e nello sviluppo di vari tumori, tra cui N 6-metiladenosina (m⁶A) è la modifica più diffusa e funzionalmente diversificata. Qui presentiamo un protocollo semplificato e riproducibile utilizzando MeRIP-qPCR per valutare i livelli di modifica di m^6Adi specifici trascrizioni nelle cellule osteosarcoma. In questo saggio è stato estratto l'RNA totale, seguito da incubazione con uno specifico anticorpo anti-m^6Acontro l'immunocattura dell'RNA della modifica m^6A. Successivamente, l'RNA veniva frammentato e l'arricchimento di frammenti di RNA modificati con m⁶A veniva ottenuto utilizzando sfere magnetiche di proteina G. L'RNA arricchito veniva rilasciato tramite digestione della proteinasi K e purificato da sfere che legavano l'RNA. Infine, l'RNA è stato sottoposto a trascrizione inversa e a reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR) per valutare i livelli di m⁶A nei geni candidati. I risultati hanno dimostrato che questo metodo distingue efficacemente le differenze di metilazione e fornisce uno strumento affidabile per esplorare i meccanismi funzionali della modifica di m^6Anelle cellule dell'osteosarcoma. In conclusione, MeRIP-qPCR offre un approccio semplice e altamente specifico per studiare la modifica di m^6Anelle cellule osteosarcoma. Questo protocollo ha un grande potenziale per chiarire le reti regolatorie di m^6Ae identificare nuovi bersagli terapeutici.

Introduzione

Le più recenti ricerche sull'epitrastrastoma rivelano che la modifica RNA^{N 6-metiladenosina} (m⁶A), la metilazione della posizione N⁶sull'adenosina, è la modifica chimica intrinseca più abbondante conosciuta dell'mRNA nelle cellule^{eucariotiche 1}. m⁶A è coinvolto in un'ampia gamma di processi biologici, tra cui la stabilità dell'mRNA, lo splicing, l'esportazione nucleare e l'efficienza di^{traduzione 2}. È importante sottolineare che le evidenze accumulate suggeriscono che la disregolazione della modifica di m⁶A contribuisce all'inizio e allo sviluppo di vari tumori, incluso l'osteosarcoma, un tumore osseo maligno altamente aggressivo che colpisce prevalentemente adolescenti e giovani^{adulti 3}.

Lo studio della modifica m^6Arichiede metodologie robuste e affidabili. Sono stati sviluppati diversi approcci per rilevare i livelli di modifica di m⁶A, tra cui m⁶A dot blot, m⁶A ELISA e MeRIP-seq. Il test dot blot m⁶A è semplice ed economico, ma soffre di sensibilità limitata e scarsa quantificazione. Fornisce il livello di^{modifica m 6}A dell'RNA totale, anziché il^{livello di modifica}m 6 A di uno specifico^{RNA 4}. m⁶A ELISA offre un rilevamento relativamente comodo e ad alto throughput; tuttavia, la reattività incrociata e la bassa accuratezza restano preoccupazioni importanti, e manca allo stesso modo della capacità di rivelare modifiche specifiche per trascrizione^{o sito 5}. MeRIP-seq consente la mappatura a livello di trascritoma di m⁶A; tuttavia, i suoi requisiti per un grande input di RNA, risoluzione relativamente bassa e dipendenza da anticorpi limitano la precisione e la riproducibilità^{MeRIP-seq 6}. Al contrario, MeRIP-qPCR combina immunoprecipitazione con PCR quantitativa, fornendo maggiore sensibilità e specificità per la rilevazione mirata di m^6Asu RNA⁷ specifico. Questo metodo consente una rilevazione sensibile e mirata dell'arricchimento differenziale di m6A nei geni candidati, rendendolo particolarmente adatto per studi di validazione nella ricerca sul cancro correlato a m6A. Questo metodo offre un'alternativa conveniente e accessibile per i laboratori che vogliono studiare meccanismi regolatori mediati da m6A.

Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato (Figura 1) per valutare i livelli di modifica m⁶A di c-Myc nelle cellule osteosarcoma usando MeRIP-qPCR come esempio. MeRIP-qPCR, basandosi sull'arricchimento basato su anticorpi di frammenti di RNA metilato, anch'esso abbinato a trascrizione inversa e PCR quantitativa, valuta la presenza e l'abbondanza relativa di m^6Asu RNA specifico. Abbiamo dimostrato che questo approccio distingueva efficacemente le differenze di metilazione di c-Myc e forniva una piattaforma affidabile per indagare il ruolo funzionale di^m6Anelle cellule osteosarcomate. Questo studio evidenzia il potenziale di MeRIP-qPCR come strumento pratico e specifico per la ricerca sulla modifica di m^6Anell'osteosarcoma e prepara il terreno per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici.

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Protocollo

1. Preparazione dell'RNA

NOTA: L'estrazione di RNA viene effettuata utilizzando un kit di estrazione RNA. Lavora all'interno di un armadietto di biosicurezza pulito quando maneggia cellule e reagenti RNA. Indossa l'attrezzatura di protezione individuale adeguata (camice da laboratorio, guanti, occhiali protettivi). Preraffredda la centrifuga a 4 °C prima di avviare.

Preparate le celle.
1. Rimuovi il substrato di coltura dalla teglia da 3,5 cm e lava delicatamente le cellule una volta con PBS già raffreddato. Aggiungi un volume appropriato di buffer di lisi RNA direttamente sulla piastra per lisare completamente le cellule e pipetta delicatamente per omogeneizzare.
2. Trasferire la sospensione della cella in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Centrifugare a 1000 × g per 5 minuti a 4 °C.
  NOTA: Assicurarsi che il rotore sia bilanciato e che il coperchio sia chiuso in modo sicuro.
4. Rimuovi con attenzione il tubo della microcentrifuga dopo la centrifugazione.
5. Aspira completamente il soprandanante usando una pipetta da 1 mL senza disturbare il pellet sul fondo.
  NOTA: Non toccare il pellet cellulare con la punta della pipetta.
Cellule di lisi.
1. Aggiungi 300 μL di tampone di lisi al pellet cellulare.
2. Mescola accuratamente invertendo il tubo 30 volte finché la soluzione non appare limpida e viscosa senza grumi visibili.
3. Incuba il tubo a temperatura ambiente per 2 minuti.
RNA precipitato.
1. Aggiungere 300 μL di etanolo al 100% al lisato (volume uguale di Lysis Buffer).
2. Pipetta delicatamente su e giù immediatamente (circa 8-10 volte) per mescolare completamente.
Esegui il legame della colonna di RNA.
1. Inserire una colonna di purificazione dell'RNA in un tubo di raccolta fornito da 2 mL.
2. Trasferisci l'intera miscela nella colonna di purificazione.
  NOTA: Evita di toccare la membrana bianca al centro.
3. Chiudi il tappo e centrifuga a 12.000 × g per 1 minuto.
4. Scartare il liquido inferiore e tamburellare delicatamente il tubo di raccolta capovolto sulla carta assorbente per rimuovere il liquido residuo.
5. Riportare la colonna di purificazione nel tubo di raccolta.
Lava le impurità.
1. Aggiungi 500 μL di Wash Buffer (acqua priva di nucleasi) alla colonna di purificazione.
  NOTA: Evita di toccare la membrana bianca al centro.
2. Centrifuga a 12.000 × g per 1 minuto e scarta il liquido inferiore.
3. Centrifuga di nuovo a 12.000 × g per 1 minuto per rimuovere il liquido residuo.
4. Trasferire la colonna di purificazione in un tubo pulito per microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Apri il tappo e lascia la colonna in piedi per 2 minuti a temperatura ambiente.
RNA eluto.
1. Inserire la colonna di purificazione in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
2. Aggiungi 25 μL di Elution Buffer direttamente al centro della membrana.
3. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
4. Centrifugare a 12.000 × g per 1 minuto per raccogliere l'RNA nel tubo inferiore.
5. Riapplicare l'eluato alla membrana e centrifugare nuovamente a 12.000 × g per 1 minuto per massimizzare la ressa.
  NOTA: Aggiungi sempre il buffer di eluzione direttamente al centro della membrana della colonna. Evita di aggiungerlo alla parete laterale, poiché questo potrebbe impedire la dissoluzione dell'RNA e ridurre notevolmente la ressa. Inoltre, non perforare la membrana con la punta della pipetta.
Misura la concentrazione di RNA.
1. Risciacquare la porta del campione dello spettrofotometro con 1,5 μL di Elution Buffer.
2. Usa 1,5 μL di Elution Buffer come blank. Conferma che la lettura sia vicina a zero.
3. Carica 1,5 μL di campione di RNA e misura la concentrazione.
4. Valutare la qualità dei campioni di RNA utilizzando uno spettrofotometro (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) e elettroforesi su gel di agarosio.

2. Immunoprecipitazione con RNA metilato (MeRIP)

Preparazione della miscela di immunocattura
1. Procura un nuovo tubo PCR da 0,2 mL.
2. Aggiungi i componenti come elencato nella Tabella 1 (esempio di una reazione).
Immunocattura
1. Chiudi bene il tappo del tubo. Posiziona il tubo PCR su un rotatore o su uno shaker rotante.
2. Incubare a temperatura ambiente per 90 minuti.
  NOTA: Assicurati che la soluzione venga miscelata in modo continuo e delicato.
Scissione dell'RNA
1. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 μL di Potenziatore della Digestione Nucleare (NDE) e 2 μL di Miscela di Enzimi di Clessaggio (CEM) in ogni provetta.
2. Mescola delicatamente pipettando su e giù 5-6 volte.
3. Incubare a temperatura ambiente per 4 minuti.
4. Preparazione del controllo dell'RNA di ingresso
  1. Per garantire la coerenza tra immunoprecipitazione (IP) e campioni di input, processare una porzione di RNA in parallelo come controllo di input.
  2. Trasferire 1 μg di RNA totale (10% in input) da ciascun campione in un tubo PCR separato. Aggiungere 20 μL di buffer di cattura immunitaria (ICB), 1,5 μL di NDE, 1 μL di CEM, e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
Arricchimento magnetico e lavaggio
1. Metti il tubo PCR su un supporto magnetico.
2. Lascia riposare il tubo per 2 minuti finché la soluzione non diventa chiara e le sfere si catturano sulla parete del tubo.
3. Aspira con cura e scarta il sovrantato senza disturbare le perline.
4. Tieni il tubo su un supporto magnetico e aggiungi 150 μL di Wash Buffer (WB).
5. Rimuovi il tubo dal supporto magnetico e inclinalo delicatamente a testa in giù per sospendere completamente le sfere.
6. Riporta il tubo al supporto magnetico. Aspetta 1-2 minuti finché la soluzione si risolve, poi scarta il soprandatante.
7. Ripeti il passaggio di lavaggio tre volte.
8. Lava nuovamente le sfere con 150 μL di Protein Digestion Buffer (PDB) usando lo stesso metodo.
Rilascio e recupero di RNA arricchito
1. Prepara la soluzione di digestione proteica mescolando proteinasi K e PDB in un rapporto 1:9. (Per ogni reazione, preparare 20 μL: 2 μL di proteinasi K + 18 μL di PDB).
2. Rimuovi il tubo dal supporto magnetico dopo il lavaggio finale.
3. Aggiungi 20 μL di soluzione lavorativa per la digestione proteica appena preparata al pellet di perle e mescola delicatamente.
4. Inserisci il tubo PCR in un termociclatore e incuba a 55 °C per 15 minuti.
5. Rimetti il tubo PCR sul supporto magnetico. Aspetta che la soluzione si risolva (circa 2 minuti).
6. Trasferire con cura l'intero soprandanzante (circa 20 μL) su un nuovo tubo PCR da 0,2 mL.
  NOTA: L'RNA ora è presente nel soprantantante. Scarta le perline.
Purificazione dell'RNA
1. Aggiungere 20 μL di Soluzione di Purificazione dell'RNA (RPS) a ogni tubo campione, tubo di controllo negativo e tubo di ingresso.
2. Aggiungi 160 μL di etanolo al 100%.
3. Sfere di legame di RNA vortice per risospenderle.
4. Aggiungi 2 μL di sfere di legame di RNA resalto a ciascun tubo.
5. Mescola accuratamente su e giù almeno 10 volte.
6. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per permettere il legame dell'RNA.
7. Metti il tubo sul supporto magnetico. Aspetta che la soluzione si risolva (circa 2 minuti).
8. Scartate con cura il soprantantante senza disturbare le perline.
9. Tieni il tubo su un supporto magnetico e aggiungi 150 μL di etanolo al 90% appena preparato. Incubare per 30 secondi.
10. Scartate l'etanolo al 90%. Ripeti il lavaggio al 90% etanolo un'altra volta (due lavaggi in totale).
11. Rimuovi il tubo dal supporto magnetico.
12. Aggiungi 13 μL di Elution Buffer alle perline essiccate.
13. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per eluire l'RNA.
14. Metti il tubo di nuovo sul supporto magnetico. Aspetta che la soluzione si risolva (circa 2 minuti).
15. Trasferire con cura l'intero soprandanante (circa 13 μL) in un nuovo tubo PCR senza RNasi.
16. Usare immediatamente o conservare l'RNA a -20 °C.

3. RT-qPCR

Trascrive inversamente l'RNA arricchito con m⁶A in cDNA
1. Utilizzare RNA purificato da^{gruppi m 6}A-IP, Input o IgG per la trascrizione inversa.
2. Imposta la reazione di trascrizione inversa (RT).
  NOTA: Garantire un input uguale di RNA su tutti i gruppi per consentire un confronto affidabile nell'analisi qPCR a valle.
Amplificazione qPCR
1. Prepara le reazioni qPCR utilizzando la chimica verde SYBR. Aggiungere 10 μL di SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL di primer diretto (10 μM), 0,5 μL di primer inverso (10 μM), 7 μL di_{ddH 2}O e 2 μL di cDNA in ciascun tubo, miscelare accuratamente e centrifugare brevemente prima di caricare nello strumento qPCR.
  NOTA: Impostare tre pozzi replicati per ogni campione di cDNA (Input, IgG, m⁶A-IP). Consulta la Tabella 2 per l'elenco dei primer.
2. Esegui il programma qPCR.
  1. Eseguire le reazioni qPCR su un ciclatore termico in tempo reale utilizzando il seguente programma: impostare la denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi; eseguire 40 cicli che consistono in denaturazione a 95 °C per 15 secondi, ricottura a 58 °C per 10 secondi ed estensione a 72 °C per 30 secondi.
  2. Dopo l'amplificazione, si effettua un'analisi della curva di fusione impostando la denaturazione a 95 °C per 15 secondi, raffreddando a 60 °C per 1 minuto, e poi aumentando gradualmente la temperatura a 95 °C a una velocità di rampa di 0,5 °C/s con acquisizione continua di fluorescenza per confermare la specificità dei prodotti amplificati.
Analisi dei dati
1. Analizzare i valori di Ct dei gruppi target e di controllo.
2. Calcola l'arricchimento utilizzando uno dei seguenti metodi:
  1. Metodi 1: % Metodo di input
    %Input = 2^{[Ct(Input)−Ct(IP)]}× DF × 100%
    NOTA: Ct (Input) e Ct (IP) rappresentano rispettivamente i valori di soglia ciclistica dei campioni di Input e IP, e il fattore di diluizione (DF) è il reciproco della frazione di input usata per la qPCR (ad esempio, se il 10% dell'RNA totale è stato usato come input, allora DF = 10).
  2. Metodi 2: Metodo Ct comparativo (metodo 2^^-ΔΔCt )
    _{ΔCt campione}=_{Ct IP}−_{Ct IgG}
    Ct=ΔCt_{trattato−ΔCt controllo}, Fold=2^−ΔΔCt.
    NOTA: Mantieni costanti quantità di input di RNA, impostazione della reazione ed efficienza del primer su tutti i campioni.

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Risultati

Qui forniamo un risultato rappresentativo dell'analisi MeRIP-qPCR, il^{livello di modifica}m 6A di c-Myc nelle cellule hFOB1.19 e 143B. Come mostrato nella Figura 2, l'arricchimento c-Myc con anticorpo anti-m⁶A è stato significativamente più elevato rispetto al controllo IgG, che mostrava solo livelli di fondo, suggerendo che l'anticorpo anti-m⁶A sia efficace che specifico. Abbiamo inoltre osservato che il livello di modifica di...

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Discussione

MeRIP-qPCR è emerso come uno strumento prezioso per studiare le modifiche dell'RNA m^6Acon ampie applicazioni. È particolarmente utile per validare i risultati del sequenziamento ad alta produttività e localizzare i siti di modifica con precisione all'interno di specifiche regioni dei geni target durante studi meccanicistici. Inoltre, questo metodo può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare grazie al suo costo relativamente bass...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 e 82205145).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100% etanolo	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., America	1158566
143B	ATCC, America	ATCC CRL-8303TM
2 e volte; SYBR Green qPCR Mix	Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., Cina	FS-Q1002
Denovix DS-11	Denovix	DS-11	Spettrofotometro
Mezzo DMEM	WISENT CORPORATION, Cina	319-005-CL
DMEM/F-12 medio	Gibco, America	11320033
EpiQuik CUT& Kit di arricchimento RNA RUN m6A (MeRIP)	Epigentek, America	P-9018-24
Siero bovino fetale	WISENT CORPORATION, Cina	086-150
hFOB1.19	Banca Cellulare dell'Accademia Cinese delle Scienze, Cina	GNHu14
Kit per il test di metilazione dell'RNA m⁶A	Abcam, Inghilterra	ab185912
Kit di trascrizione inversa microRNA	EZBioscience-EZB, America	A0010CGQ
Sistema in tempo reale	BIO-RAD, America	CFX96
Kit di estrazione totale di RNA	EZBioscience-EZB, America	B0004DP
Enzima TrypLE Express	Gibco, America	12604021

Riferimenti

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Ristampe e permessi

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Immunoprecipitazione dell RNA N6 metiladenosina Estrazione dell RNA Sferule di Proteina G Arricchimento con anticorpi PCR con trascrizione inversa Frammentazione dell RNA

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