Articolo metodologico

Metodo standardizzato per rilevare nanotubi in tunneling nelle cellule della pelle umana per applicazioni di ingegneria tissutale

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DOI:

10.3791/69883

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13 gennaio 2026

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

In questo articolo

Sommario

Qui viene mostrato un protocollo standardizzato per visualizzare nanotubi di tunneling tra cheratinociti epidermici umani e fibroblasti dermici utilizzando la marcatura a membrana e F-actin con imaging confocale z-stack, con co-colorazione opzionale α-tubulina, che consente la rilevazione riproducibile e la caratterizzazione del citoscheletro per applicazioni di ingegneria tissutale.

Abstract

I nanotubi tunneling (TNT) sono sottili condotti intercellulari a base di actina che permettono il trasferimento a lungo raggio di organelli e carichi di segnalazione. Sebbene ampiamente riportato in più tipi cellulari, la loro presenza nelle cellule della pelle umana non è stata ben descritta. Questo articolo descrive un protocollo standardizzato per rilevare e caratterizzare i TNT in vitro tra cheratinociti epidermici umani e fibroblasti dermici. Il metodo prevede la preparazione di una co-coltura di cellule primarie, fissazione delicata per preservare TNT fragili, marcatura a membrana con agglutinina germinale di grano, colorazione con F-actina con falloidina e imaging sistematico a z-stack tramite microscopia confocale invertita per distinguere i TNT sospesi sopra il substrato dai filopodi aderenti. L'immunocolorazione opzionale per la α-tubulina consente la valutazione dell'incorporazione dei microtubuli. I TNT sono definiti da tre caratteristiche: sottili protuberanze dritte che collegano due o più cellule, la presenza di F-actin e la continuità tra coppie cellulari nelle sezioni ottiche seriali. I risultati rappresentativi dimostrano TNT che collegano coppie dermal-dermali, epidermi-epidermiche e dermal-epidermiche, con composizione citoscheletrice variabile (F-actina da sola o F-actina più α-tubulina). I passaggi critici includono una fissazione delicata, l'uso di reagenti freschi e l'acquisizione di abbastanza z-plane per evitare una classificazione errata, mentre i reperti comuni includono la rottura del TNT e la colorazione incompleta. Insieme, questi passaggi ottimizzati permettono la rilevazione riproducibile del TNT nei sistemi cellulari della pelle e offrono una base metodologica per future indagini sulla comunicazione mediata dal TNT nella biologia e rigenerazione della pelle.

Introduzione

I nanotubi tunneling (TNT) sono canali a base di actina su scala nanometrica che consentono il trasferimento intercellulare diretto di organelli e molecole di segnalazione. Sono tipicamente lunghe 6-100 μm e diametro 50-500 nm, alcune raggiungono uno spessore fino a 700nm. A differenza delle protuberanze a membrana vuote, i TNT contengono filamenti citoscheletrici, più comunemente F-actin, che conferisce rigidità strutturale e supporta il trasporto mitocondriale 2,3,4. Nella coltura bidimensionale, i TNT sono definiti da tre caratteristiche: sottili (20-700 nm), sporgenti dritte sospese sopra il substrato che collegano due o più cellule; la presenza di filamenti di F-actina; e la possibilità di trasferire il carico.

Dalla loro prima identificazione nelle cellule PC-12 da parte di Rustom et al.5, i TNT sono stati studiati in molteplici sistemi, tra cui il sistemacardiovascolare 6,immunitario 7 erespiratorio 8, l'epitelio corneale9, i tumori10 e il sistemanervoso 11,12. Contribuiscono a processi fisiologici e patologici come la segnalazione immunitaria, l'apoptosi, il trasporto di materiali e l'angiogenesi 13,14,15. I TNT possono mediare il trasferimento a lungo raggio di carichi diversi, inclusi mitocondri, reticolo endoplasmatico, acidi nucleici, ioni e persino virus 5,16,17.

La pelle è un organo strutturalmente complesso, con epidermide e derme che si affidano a una comunicazione costante per l'omeostasi, la guarigione delle ferite e la rigenerazionedegli appendici 18,19,20. Sebbene i TNT siano stati descritti in molti tessuti, inclusi il sistema immunitario, il sistema neuronale e l'epiteliocorneale 7,9,12, la loro presenza nelle cellule della pelle umana non è stata riportata nella letteratura pubblicata. Basandoci sul quadro metodologico descritto da Sáenz-de-Santa-María et al.21, presentiamo un protocollo standardizzato e ottimizzato per rilevare i TNT tra cheratinociti epidermici e fibroblastidermici 22 utilizzando la colorazione a immunofluorescenza combinata con microscopia confocale invertita.

Rispetto agli approcci alternativi di rilevamento TNT, questo protocollo offre un equilibrio pratico tra sensibilità e accessibilità. L'imaging a cellule vive può catturare la dinamica del TNT, ma è limitato dalla fototossicità e dalla natura di breve durata deiTNT 1,23. La microscopia elettronica fornisce dettagli ultrastrutturali ma spesso non preserva lunghe distagini di TNT ed è non pratica per l'analisi di routine delle cellule primarie dellapelle 24,25. I sistemi nanotubari basati su reporter permettono il tracciamento in tempo reale ma richiedono manipolazione genetica, che è tipicamente inefficiente nei cheratinociti primari e neifibroblasti 24,26. Al contrario, l'attuale protocollo utilizza immunofluorescenza standard e microscopia confocale, permettendo la rilevazione riproducibile di TNT attraverso colture cellulari della pelle preparate indipendentemente mantenendo la compatibilità con cellule primarie fragili.

Questo metodo è particolarmente adatto per l'analisi a campioni fissi, dove la composizione del citoscheletro e la prevalenza di TNT sono di interesse. Poiché i TNT sono altamente fragili, i passaggi di fissazione e gestione rimangono limitazioni chiave, e l'approccio non può catturare dinamiche TNT in tempo reale. Tuttavia, per i laboratori che lavorano con cellule cutaine umane primarie, questo flusso di lavoro standardizzato offre un modo accessibile e coerente per visualizzare i TNT e supporta studi a valle delle loro potenziali funzioni nell'ingegneria e nella rigenerazione dei tessuti.

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Protocollo

Tutte le cellule cutanee utilizzate in questo studio erano precedentemente cellule primarie congelate, isolate da tessuti cutanei umani ottenuti come campioni di prepuzio scartati da procedure di circoncisione, e completamentede-identificate 22. L'acquisizione di campioni di pelle umana è stata effettuata presso il Dipartimento di Urologia dell'Ospedale Popolare Affiliato dell'Università di Ningbo, e il protocollo dello studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale (Protocollo n. 2024104; data di approvazione: 30 ottobre 2024).

1. Identificazione di TNT nei cheratinoviti epidermici e fibroblasti dermici primari della pelle umana

  1. Preparazione della soluzione
    1. Prepara la soluzione fissativa 1 (200 μL) aggiungendo 4% di PFA (100 μL), 2,5% glutaraldeide (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) e 1x PBS (56 μL). Prepara fresco e preriscalda a 37 °C prima dell'uso.
    2. Prepara la soluzione fissativa 2 (200 μL) aggiungendo 8% di PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Prepara fresco e preriscalda a 37 °C prima dell'uso.
    3. Prepara la soluzione fissativa 3 (200 μL) aggiungendo 8% di PFA (100 μL), 2,5% glutaraldeide (4 μL), 1x PBS (96 μL). Prepara fresco e preriscalda a 37 °C prima dell'uso.
  2. Coltura cellulare
    1. Scongelare e coltivare cheratinociti epidermici umani e fibroblasti dermici in vasche da 60 mm utilizzando il terreno di crescita appropriato. Integrare le colture di cheratinociti con Y-27632 a una concentrazione finale di 5 μM durante la rianimazione. Mantenere le colture a 37 °C in un incubatore umidificato finché le cellule non raggiungono l'~80% di confluenza.
    2. Rimuovere il mezzo e lavare brevemente le cellule con 1 mL di 1x PBS (usato per mantenere il pH fisiologico e l'osmolarità durante il lavaggio). Aspira il PBS.
    3. Aggiungi 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%, distribuisci uniformemente e incuba a 37 °C per 1,5-2,5 minuti.
    4. Sospendi delicatamente le cellule tramite pipetazione. Aggiungi 2 mL di mezzo di crescita, trasferisci in un tubo da 15 mL e centrifuga a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 1-2 mL di substrato. Contare le celle usando un contatore automatico.
    6. Seminare 12.000 fibroblasti dermici o 20.000 cheratinoviti in ciascun pozzo di una lamina a 8 pozzi in un volume finale di 400 μL. Dopo la semina, agita bene la camera per distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare per ~24 ore a 37 °C.
    7. Dopo circa 24 ore di incubazione, osservare la confluenza cellulare al microscopio. Se raggiunge ~80%, procedi ai passaggi di fissazione successivi.
  3. Fissazione
    1. Quando le colture raggiungono l'~80% di confluenza, aggiungi delicatamente diverse gocce di Soluzione Fissativa 1 direttamente al pozzo della camera per prefissare le cellule. Incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. Assicurati che il fissativo si distribuisca uniformemente senza disturbare le cellule.
      ATTENZIONE: Maneggiare con attenzione per evitare interruzioni dei TNT. Poiché le soluzioni fissative contengono componenti tossici come PFA e glutaraldeide, indossa sempre guanti protettivi, indumenti protettivi e mascherina, e maneggiali in una cappa elettrica. Assicurati di lavarti accuratamente le mani dopo. Raccogliere separatamente i rifiuti fissativi di PFA e glutaraldeide in contenitori etichettati per lo smaltimento di sostanze chimiche pericolose.
    2. Aspirare il prefissativo e sostituirlo con 140 μL di Soluzione Fissativa 1 fresca, assicurandosi che l'intero pozzo sia coperto. Incubare per 15 minuti a 37 °C.
    3. Rimuovere la Soluzione Fissativa 1 e aggiungere 140 μL di Soluzione Fissativa 2. Incubare per 15 minuti a 37 °C. Assicurati che la soluzione copra completamente le cellule per mantenere una fissazione uniforme.
    4. Rimuovere il fissativo, poi aggiungere 140 μL di 100 mM di NH₄Cl per smorzare gli aldeidi residui. Incubare per 10-30 minuti a temperatura ambiente.
    5. Risciacqua i campioni 3 volte con 1 PBS per 30 secondi ciascuno a temperatura ambiente, pipettando delicatamente lungo la parete della camera per evitare di lavare via le cellule o rompere le TNT.
  4. Colorazione di membrana e citoscheletro
    1. Incubare cellule con 140 μL di 1:300 (v/v) WGA (Aglutinina del Germo di Gramento)-Alexa Fluor, che etichetta glicoproteine della membrana plasmatica per la visualizzazione dei TNT derivati dalla membrana, in 1x PBS per 20 minuti al buio a temperatura ambiente.
      NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti in un ambiente buio.
    2. Lava 3 volte con 1 PBS (30 secondi ciascuno). Incubare con 140 μL di coniugato di falloidina diluito 1:250 (v/v) in 1% di BSA per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
    3. Lava 3 volte con 1 PBS (30 secondi ciascuno). Incubare con 140 μL di soluzione DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
    4. Lava 3 volte con 1× di PBS. Aggiungi 2-3 gocce di substrato da montaggio, incuba per 20 minuti a temperatura ambiente e conserva almeno 20 minuti a 4 °C al buio fino all'immagini.
  5. Imaging
    1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale rovesciato con obiettivo 40x. Seleziona campi casuali e raccogli Z-stack (10-20 livelli) dal basso verso l'alto delle celle. I parametri specifici del microscopio utilizzati per l'acquisizione dell'immagine sono elencati di seguito:
      Microscopio laser a scansione confocale: ZEISS LSM 900
      Linee laser: Traccia 1 (561 nm, 4,0%), Traccia 2 (488 nm, 16,0%), Traccia 3 (405 nm, 60,0%)
      Guadagno del rivelatore: 525 V
      Dimensione Z-step: 20 sezioni ottiche (profondità totale: 5,32 μm)

2. Co-coltura di cellule epidermiche e dermiche

  1. Preparare cheratinoviti e fibroblasti come nei passaggi 1.2.1-1.2.5.
  2. Semina 10.000 cheratinociti e 6.000 fibroblasti per pozzo da camera in 400 μL di mezzo. Dopo la semina, agita bene la camera per distribuire le cellule in modo uniforme. Incubare per 24 ore a 37 °C.
  3. Dopo circa 24 ore di incubazione, osservare la confluenza cellulare al microscopio. Se raggiunge ~80%, procedi ai passaggi di fissazione successivi.
  4. Fissare e colorare le membrane come descritto nei passaggi 1.3-1.4.
  5. Permeabilizzare le cellule con 0,1% di Triton X-100, per consentire l'accesso degli anticorpi ai bersagli intracellulari, per 3 minuti a temperatura ambiente, poi lavare 3 volte con 1 PBS.
    NOTA: Il Triton X-100 allo 0,1% deve essere preparato fresco prima dell'uso.
    ATTENZIONE: Il Triton X-100, dannoso per la vita acquatica, deve essere smaltito come rifiuto chimico e mai gettato nello scarico.
  6. Bloccare con 140 μL di BSA al 2% in PBS per ridurre il legame anticorpale non specifico per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: il 2% di BSA va preparato fresco prima dell'uso.
  7. Incubare durante la notte a 4 °C con anticorpi anti-citocheratina 5 diluiti 1:200 (v/v) in BSA al 2%.
  8. Lavare 3 volte con 1 PBS, poi incubare con un anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 594 per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio.
  9. Lava 3 volte con 1× di PBS. Colorare i nuclei con DAPI e immagine come nei passaggi 1.4.5-1.5.2.

3. Identificazione dei componenti del citoscheletro dei TNT

  1. Coltura cellulare
    1. Coltivare e fissare le cellule come nei passaggi 1.2-1.3. Permeabilizza con il 0,1% di Triton X-100 per 3 minuti a temperatura ambiente, poi lava con 1x PBS.
    2. Blocca con 2% di BSA per 20 minuti a temperatura ambiente. Incubare durante la notte a 4 °C con anticorpo anti-α-tubulina.
    3. Lava 3 volte con 1 PBS e incuba con anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor per 1-2 ore a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: I passaggi successivi devono essere eseguiti in un ambiente buio.
    4. Lava 3 volte con 1 PBS. Etichettare la F-actina con falloidina e immagine come nei passaggi 1.4.3-1.5
  2. Co-coltura delle cellule
    1. Prepara le co-colture come nei passaggi 2.1-2.2. Risolvi con una soluzione fissativa 3 per 15 minuti a temperatura ambiente.
    2. Sostituisci con 140 μL di 100 mM NH4Cl e incuba per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Lava 3 volte con 1 PBS.
    3. Per prima cosa, identificare le cellule epidermiche eseguendo permeabilizzazione, blocco e immunocolorazione CK5 esattamente come descritto nei passaggi 2.4-2.8.
    4. Successivamente, esegui l'immunocolorazione α-tubulina seguendo i passaggi 3.1.2-3.1.4.
    5. Infine, colorare la F-actina con la falloidina e procedere con l'imaging come descritto nei passaggi 1.4.2-1.5.2.

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Risultati

Utilizzando questo protocollo standardizzato, i nanotubi a tunneling (TNT) sono stati identificati con successo nelle cellule della pelle umana sia in condizioni di coltura singola che di co-coltura. Per validare la specificità degli anticorpi, sono state effettuate sia colorazioni di controllo positive che negative per tutti gli anticorpi prima delle analisi sperimentali, come mostrato nella Figura Supplementare 1, Figura Supplementare 2, Figura Supplementare 3 e

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Discussione

Un passaggio fondamentale in questo protocollo è la conservazione dei TNT durante la fissazione e la colorazione, poiché queste strutture sono estremamente fragili e facilmente disturbabili. Una gestione delicata durante la fissazione, il tempismo appropriato e l'uso di nuovi fissativi sono essenziali per mantenere l'integrità del TNT. L'uso dell'imaging confocale a Z-stack è altrettanto importante per distinguere i TNT sospesi sopra il substrato dai filopodi o altre protuberanze aderent...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82273554). Gli autori riconoscono il Laboratorio di Ingegneria dei Biomateriali e della Rigenerazione Tissutale presso l'Ospedale di Stomatologia di Ningbo per il supporto continuo e ringraziano sia i membri attuali che passati del team per le preziose discussioni. Gli autori ringraziano inoltre l'insegnante Feng Li del Centro di Ricerca e Esperimenti del Hangzhou Medical College per il generoso supporto e il forte sostegno nel facilitare l'accesso al microscopio confocale.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubo da 15 mLKIRGENKG2611Sterili, RNasi/Dnasi e pirogeni
37 & deg; Incubatore CThermo Scientific51032877L'incubatore a CO2 a 37 gradi offre un ambiente ideale in vitro.
Tracciatore di Actina Rossa-RhodaminaBeyotimeC2207sLa sonda Red-Rhodamine Actin-Tracker è una falloidina marcata con il colorante fluorescente Rhodamine, con una lunghezza d'onda massima di eccitazione di 540nm e una lunghezza d'onda massima di emissione di 565nm.
Alexa Coniugato Fluor dell'agglutinina germinale del grano (WGA)Sonde molecolariW11261  Alexa Fluor 488 Coniugato
Anticorpo anti-alfa tubulinaAbcamab7291Anticorpo anti-alfa tubulina - Loading Control (ab7291) è un anticorpo monoclonale di topo che rileva la alfa tubulina. Adatto per umani, topoli, ratti.
Anticorpi anti-citocheratina 5  Abcamab52635Anticorpo Anti-Citocheratina 5 - Il marcatore del citoscheletro (ab52635) è un anticorpo monoclonale del coniglio che rileva la citocheratina 5. Adatto per umani, topoli, ratti.
Aqua-Poly/MountPoliscienze18606Mezzo di montaggio idrosolubile e non fluorescente formulato per il montaggio di sezioni da soluzioni acquose. Utile per tecniche immunofluorescenti poiché valorizza e trattiene le colorazioni fluorescenti.
Contatore automatico delle celleCountstarIC1000Contatore automatico per un conteggio rapido e preciso delle celle
Centrifuga da bancoBIORIDGETD5Centrifuga da banco per una separazione rapida ed efficiente dei campioni in ambito di laboratorio
Cabinet di sicurezza biologicaThermo Scientific1379L'Armadietto di Sicurezza Biologica è un dispositivo di contenimento sterile che protegge operatori, campioni e ambienti da rischi biologici filtrando patogeni trasportati dall'aria e prevenendo la contaminazione incrociata durante lavori microbiologici.
Albumina sierica bovina (BSA)YOBIBIOU5010-10gLa BSA è una globulina nel siero bovino contenente 583 residui di amminoacidi con un peso molecolare di 66,430 kDa e un punto isoelettrico di 4,7
Piatto per coltura cellulare (60X15 mm)eppendorf30701119Coltura tissutale trattata Sterile, priva di pirogi rilevabili, RNasi e DNasi, DNA.
Camera Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NProgettato per immagini ad alta risoluzione come la microscopia confocale.
Soluzione di colorazione DAPIBeyotimeC1006-10 mLLa Soluzione di Colorazione DAPI è adatta per la colorazione nucleare di tutte le cellule e i tessuti comuni.
Capra Anti-Topo IgG H & L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660Capra Anti-Topo IgG H & L (Alexa Fluor 405) è un anticorpo secondario con una lunghezza d'onda massima di assorbimento di 401nm e una lunghezza d'onda massima di emissione di 421nm.
Capre Anti-Coniglio IgG H & L coniugata ad Alexa Fluor 405Abcamab175652Capre Anti-Coniglio IgG H & L (Alexa Fluor 405) è un anticorpo secondario con una lunghezza d'onda massima di assorbimento di 401nm e una lunghezza d'onda massima di emissione di 421nm.
Capre Anti-Coniglio IgG H & L coniugata ad Alexa Fluor 594Abcamab150080Capre anti-coniglio IgG & H & L (Alexa Fluor 594) è un anticorpo secondario con una lunghezza d'onda massima di assorbimento di 590nm e una lunghezza d'onda massima di emissione di 617nm.
Microscopio a fluorescenza confocale invertitaLeicaTCS SP8 XIl microscopio confocale laser Leica SP8 X offre immagini ad alta risoluzione senza pari con avanzate capacità di rilevamento della fluorescenza e analisi delle cellule vive.
Microscopio a fluorescenza confocale invertitaAndorBC43L'Andor BC43 è un microscopio confocale compatto e ad alta velocità che offre immagini 10 volte più veloci rispetto ai sistemi tradizionali con capacità di imaging 2D/3D a un solo clic
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Cloruro di ammonio come composto polare per regolare il pH.
Coniugati con Falloidini Oregon GreenTM488Life TechnologiesO7466Colore: Verde. Intervallo di lunghezze d'onda di eccitazione: 496/520.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500La sua funzione è mantenere il pH del mezzo entro l'intervallo fisiologico e mantenere l'equilibrio della pressione osmotica sia all'interno che all'esterno della cellula.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlÈ un tensioattivo non ionico versatile utilizzato per ripristinare componenti della membrana in condizioni di denaturazione lievi.
Soluzione tripsina-EDTAGIBCO25300054Grazie alla sua forza digestiva, la tripsina è ampiamente utilizzata per la dissociazione cellulare, il passaggio di colture cellulari di routine e la dissociazione dei tessuti primari.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 è un inibitore ATP-competitivo attivo per via orale di ROCK-I e ROCK-II

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