Effetti terapeutici dei granuli antispasmodici Gualou Guizhi sulla spasticità e la PANoptosi in un modello ratto di lesione del midollo spinale

Sommario

Questo studio valuta gli effetti dei Granuli Antispasmodici Gualou Guizhi (GLGZ) sulla spasticità indotta da lesioni del midollo spinale (LME) utilizzando metodi comportamentali, biomeccanici, di imaging e istologici, ed esplora i meccanismi correlati alla PANoptosi.

Abstract

La spasticità muscolare dopo una lesione del midollo spinale (LMS) influisce gravemente sulla qualità della vita, con trattamenti efficaci limitati. I Granuli Antispasmodici Gualou Guizhi (GLGZ), una formulazione di medicina tradizionale cinese (MTC) sviluppata in ospedale, possono alleviare gli spasmi. Questo studio mirava a valutare l'efficacia del GLGZ nella spasticità indotta da LM e la sua associazione con la PANoptosi (una nuova morte cellulare programmata che coinvolge apoptosi, necroptosi e piroptosi).

Sono stati utilizzati maschi di ratti Sprague-Dawley dal peso 180-200 g. La LMI è stata indotta tramite il metodo di caduta di peso di Allen. I ratti modello vinti sono stati assegnati casualmente a un gruppo modello o a uno dei gruppi di dosaggio GLGZ: alto, medio o basso. I ratti finti hanno subito laminectomia senza lesioni al midollo spinale. Gli interventi duravano 4 settimane. Dopo l'intervento, la funzione motoria degli arti è stata valutata utilizzando la scala di Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). La rigidità del muscolo femorale è stata valutata tramite elastografia a onda di taglio a ultrasuoni (SWE), mentre l'integrità del midollo spinale è stata determinata tramite risonanza magnetica (MRI). Sono state eseguite colorazioni di ematossilina-eosina (HE), Nissl e Luxol fast blue per osservare alterazioni istopatologiche. La colorazione immunofluorescenza multiplex è stata utilizzata per etichettare proteine a puntiche associate all'apoptosi contenenti una CARD (ASC, verde), Caspasi-8 (arancione) e serina/treonina-proteina chinasi 3 (RIPK3, giallo) interagendo con recettori per valutare la PANoptosi.

GLGZ ha migliorato i punteggi BBB dipendendo dalla dose: sham (21,00 ± 0,00), modello (5,8 ± 1,1), alta dose (10,6 ± 1,3), media dose (8,5 ± 1,2), bassa dose (7,1 ± 1,0). SWE ha mostrato una ridotta rigidità muscolare: modello (6,68 ± 0,74 m/s), alta dose (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), media dose (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), bassa dose (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) rispetto al modello. Rispetto al gruppo modello (3,65 ± 1,03 mm²), GLGZ ha ridotto in modo dipendente dalla dose la dimensione della lesione del midollo spinale in tutti i gruppi dosologici (tutti P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² ad alta dose, 1,94 ± 0,67 mm² a dosi medie, 2,50 ± 0,79 mm² nel gruppo a bassa dose. L'istologia ha rivelato che il GLGZ preservava i neuroni e favoriva la riparazione della mielina. GLGZ ha ridotto in modo dipendente dalla dose l'espressione di ASC, Caspasi-8 e RIPK3.

Introduzione

Lo spasmo muscolare è una complicanza comune della lesione del midollo spinale (LME), che influisce gravemente sulla qualità della vita dei pazienti. Il suo processo patologico include lesioni meccaniche iniziali, infiammazione secondaria, stress ossidativo, apoptosi e rigenerazione nervosa compromessa, tra gli^{altri 1,2}. I trattamenti attuali (decompressione chirurgica, farmacoterapia, riabilitazione) hanno un'efficacia limitata, con farmaci a lungo termine che causano effetti collaterali come^{la resistenza ai farmaci 3}. Pertanto, esplorare nuovi meccanismi e trattamenti è fondamentale.

Studi recenti hanno identificato la panoptosi, una morte cellulare programmata che integra apoptosi (dipendente dalla caspasi), la necroptosi (dipendente da RIPK3/MLKL) e la piroptosi (caspasi-8/GSDMD-dipendente⁾⁴ come meccanismo patologico chiave di lesione secondaria nelle LM. Attivazione anomala di (ASC, caspasi-8 e RIPK3) induce perdita neuronale e formazione di cicatrici gliali, esasperando la spasticità⁵. Raggiungere la PANoptosi è quindi emerso come una strategia promettente per interrompere la cascata di lesioni secondarie^{della SCI 4}.

La medicina tradizionale cinese (MTC) ha attirato l'attenzione per le malattie neurologiche grazie agli effetti multi-bersaglio (ad esempio, antiinfiammatori, stress antiossidante⁾⁶. I Granuli Antispasmodici Gualou Guizhi (GLGZ) derivano dalla Sinossi della Camera d'Oro di Zhang Zhongjing ed sono stati ottimizzati come preparazione^{ospedaliera 7}. I suoi componenti includono Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube e^{ginger 8}. Studi preliminari hanno dimostrato che il GLGZ allevia gli spasmi dopo un danno al sistema nervoso centrale regolando i neurotrasmettitori e inibendo l'infiammazione⁹. Tuttavia, i suoi effetti sulla spasticità indotta dalla LM e sulla possibile associazione con la PANoptosi rimangono non chiariti.

A differenza dei farmaci convenzionali a singolo bersaglio, la natura multicomponente del GLGZ si allinea con la complessa rete patologica della LME — affrontando simultaneamente infiammazione, perdita neuronale, danni alla mielina e potenzialmente PANoptosi. Questo studio ipotizza che il GLGZ mitighi la spasticità muscolare nei ratti con LM promuovendo la riparazione patologica del midollo spinale (riduzione dell'infiammazione, preservazione dei neuroni, riparazione della mielina) e inibizione della PANoptosi. Verificando questa ipotesi, miriamo a fornire prove sperimentali per il GLGZ come terapia promettente che integra il sollievo dei sintomi e la riparazione patologica centrale della LME.

Protocollo

Modellazione animale
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Fujian (Approvazione n. FJPSPH-IAEC2024114) e condotta in conformità con le linee guida per il benessere animale. I maschi di ratti Sprague-Dawley del peso 180-200 g sono stati alloggiati in condizioni controllate a 22-26°C e umidità del 40-70%. La LM è stata indotta con il metodo Allen di drop^{di peso 10}: anestesia inalazione di isoflurano al 3-4%, incisione mediana a T10, esposizione dei segmenti T9-T11, laminectomia (dura mater intatta) e impatto (punta di 2 mm, velocità 0,5 m/s, profondità 1,3 mm, durata 1 s). I ratti finti sono stati sottoposti a laminectomia senza impatto. Criteri di inclusione: punteggio BBB < 8 a 24 ore dall'intervento; Criteri di esclusione: infezione, transezione del midollo spinale. Cura post-operatoria: analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg s.c., ogni 12 ore per 3 giorni), espressione vescica (ogni 6 ore per 1 settimana) e cura delle ferite sterili. I ratti modello riusciti sono stati assegnati casualmente a un gruppo modello, e gruppi GLGZ ad alto (2,32 g/kg, n = 10), medio (1,16 g/kg, n = 10), a bassa dose (0,58 g/kg, n = 10).

Analisi della funzione motoria
La registrazione di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) è stata eseguita alla cieca. I ratti sono stati osservati in un campo aperto per 5 minuti, valutando il movimento delle articolazioni dell'arto posteriore, il carico di peso, l'andatura e la coordinazione.

Elastografia a onda di taglio per misurare la rigidità del retto femorale
È stato utilizzato un sistema a ultrasuoni Doppler con una sonda a array lineare (18L6). I ratti venivano posti in posizione di reclinazione laterale (muscolo rilassato). L'SWE veniva eseguita con la sonda posizionata a un angolo di 90° rispetto al muscolo, a una profondità di 1-2 cm. La regione di interesse (ROI) è stata impostata a 0,5 × 0,5 cm, e sono stati acquisiti dieci fotogrammi per ogni misura. Il valore finale di rigidità rappresentava la media di tre misurazioni valide. Fu registrata la velocità dell'onda di taglio (SWV); Il controllo qualità verde indicava immagini^{valide 11}.

Esame MRI
La risonanza magnetica è stata eseguita utilizzando uno scanner 7.0T con una sequenza grassocompressa ponderata T2 e una bobina specifica per animali. I parametri di acquisizione erano i seguenti: tempo di ripetizione (TR) 3.800 ms, tempo di eco (TE) 72 ms, spessore della sezione 1 mm, dimensione voxel 0,1 × 0,1 × 1 mm, matrice 256 × 256, campo visivo (FOV) 25,6 × 25,6 mm, quattro medie del segnale e gating respiratorio. L'area della lesione è stata misurata utilizzando un software di elaborazione delle immagini.

Colorazione istologica
La colorazione con HE è stata eseguita tramite deparaffinizzazione sequenziale, reidratazione, colorazione con ematossilina per 5 minuti, risciacquo in acqua corrente, differenziazione in acido cloridrico-etanolo all'1% per 30 secondi, colorazione con eosina per 2 minuti, disidratazione, pulizia e montaggio. Come checkpoint visivo, le sezioni colorate mostravano nuclei blu e citoplasma rosso.

La colorazione con Nissl è stata effettuata tramite deparaffinizzazione, reidratazione, incubazione in blu di toluidina allo 0,1% a 50-60 °C per 30 minuti, seguita da risciacquo con acqua distillata, differenziazione con etanolo, disidratazione, pulizia e montaggio. Come checkpoint visivo, i corpi blu scuro di Nissl furono chiaramente osservati nel gruppo finto.

La colorazione Luxol fast blue-cresyl violet è stata eseguita tramite deparaffinizzazione, reidratazione, incubazione in Luxol fast blue a 60 °C per 2 ore, risciacquo con etanolo al 95%, differenziazione nel carbonato di litio per 30 s, seguita da differenziazione al 70% con etanolo, controcolorazione cresyl viola per 10 minuti, disidratazione, pulizia e montaggio. La concentrazione operativa di viola cresyl era dello 0,1%. Come checkpoint visivo, nel gruppo sfinto è stata osservata mielina blu scuro.

La colorazione multiplex per immunofluorescenza è stata eseguita a partire dalla deparaffinizzazione, reidratazione e recupero di antigeni utilizzando tampone di citrato (pH 6,0) a 95 °C per 20 minuti. Le sezioni sono state trattate con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti, seguite da un blocco con BSA al 5% a 37 °C per 1 ora. Gli anticorpi primari sono stati incubati durante la notte a 4 °C (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Dopo il lavaggio con PBS-T (0,1% Tween-20, 3 x 5 min), le sezioni sono state incubate con anticorpi secondari marcati con HRP (1:1000) a 37 °C per 1 ora. Successivamente è stata applicata la marcatura con fluorocromo: YTR520 Plus per ASC, TYR570 Plus per Caspase8 e TYR690 Plus per RIPK3 (30 min), seguita da colorazione nucleare DAPI per 5 minuti. Sono state montate vetrine e l'imaging è stato effettuato utilizzando un microscopio a fluorescenza impostato a 500 ms di esposizione, guadagno 1,0, ingrandimento ×200, con set di filtri corrispondenti ai rispettivi fluorochromi.

Per lo xilene ed l'etanolo, tutte le operazioni venivano eseguite in una cappa a fumi, e durante l'uso venivano indossati guanti e occhiali protettivi. Per i reagenti che colorano, il contatto diretto con la pelle era strettamente evitato. Tutti i reagenti di rifiuti venivano smaltiti in contenitori designati per rifiuti pericolosi. Per i materiali a rischio biologico, è stata effettuata una sterilizzazione accurata con autoclave prima dello smaltimento finale per prevenire una potenziale contaminazione biologica.

Analisi statistica
Per confronti di gruppo è stata utilizzata un'ANOVA unidirezionale con test post-hoc LSD. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Punteggio BBB
Il punteggio BBB del gruppo fittizio era 21,00 ± 0,00, significativamente superiore rispetto al modello (5,8 ± 1,1, P < 0,001). GLGZ aumenta a dose dei punteggi BBB: alta dose (10,6 ± 1,3, P < 0,001), media dose (8,5 ± 1,2, P = 0,003), bassa dose (7,1 ± 1,0, P = 0,028) rispetto al modello (Figura 1).

Analisi dell'elastografia a onda di taglio della rigidità del retto femorale
L...

Discussione

Questo studio ha valutato sistematicamente gli effetti migliorativi del GLGZ sulla spasticità muscolare nei ratti con LM ed ha esplorato la sua relazione con la neuroprotezione e la PANoptosi. I risultati indicarono che il GLGZ potrebbe migliorare i punteggi BBB e ridurre la rigidità muscolare nei ratti con lezioni con LM in modo doso-dipendente. Lo studio ha inoltre rilevato che il meccanismo d'azione del GLGZ potrebbe essere correlato alla neuroprotezione, alla riparazione della mielin...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo anidro	240403A1		Disidratazione
Etanolo anidro	241101A1		Colorazione
agente di rivestimento attenuato antifluorescenza (contenente DAPI) e nbsp;	MA0221		Colorazione a immunofluorescenza
Anticorpi ASC	Bs-6741R		Analisi PANoptosi (1:300)
Anticorpo Caspasi-8	13423-1-AP		Analisi PANoptosi (1:400)
Microscopio a fluorescenza	NIKON		ECLIPSECi-L
Scanner digitale per vetri completamente automatico	GCell-60		Scanner a diapositive
kit di ematossilina-eosina	R23718		Colorazione con ematossilina-eosina (HE)
Software per l'analisi delle immagini	NIH		ImageJ 1.53k
Luxol Fast Blue	R23193		Colorazione Luxol Fast Blue-Cresyl Violet
MRI Scanner	Bruker		7.0T
Kit per la colorazione a fluorescenza multipla	240522		Colorazione a immunofluorescenza
Kit per la colorazione mieloide	G3245		Colorazione mieloide
Neutrale  balsam	MB9899		Montaggio dopo la tintura
Kit di colorazione Nissl	R23093		Colorazione Nissl
Anticorpo RIPK3	Bs-3551R		Analisi PANoptosi (1:400)
SPSS 22.0			software di analisi statistica
Ratti Sprague-Dawley	Azienda biotecnologica Hangyi a Fuzhou
Acido tartarico, tripolifosfato di sodio	10019418		Colorazione
Sistema a ultrasuoni	SIEMENS Acuson		Sonda a array lineare (18L6)
xilene	240904A2		Colorazione