Questo protocollo sperimentale fornisce un metodo stabile, economico ed efficiente che combina il knockdown dell'inncRNA con saggi formatori di colonie per quantificare l'effetto dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma.
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Articolo metodologico
Test di formazione di colonie che rileva la capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma knockdown di RNA LncRNA
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'espressione aberrante degli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) influenza profondamente la proliferazione cellulare delle cellule osteosarcoma, suggerendo che possano fungere da potenziali bersagli terapeutici. Tuttavia, gli studi funzionali sugli lncRNA rimangono in gran parte teorici e limitati a poche validazioni. Gli saggi di formazione di colonie, che riflettono specificamente il destino finale della proliferazione delle singole cellule, sono considerati lo standard d'oro per valutare il potenziale proliferativo a lungo termine. Qui, questo protocollo ha stabilito un protocollo sperimentale affidabile utilizzando saggi di formazione di colonie nelle cellule di knockdown di lncRNA per valutare l'effetto dell'inNCRNA sulla capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma. Questo protocollo sperimentale fornisce un saggio stabile, conveniente ed efficiente per valutare gli effetti regolatori dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma. Questo approccio non è solo adatto alla ricerca sulle cellule osteosarcoma, ma serve anche come strumento praticabile per la capacità proliferativa cellulare regolata da RNA in altri tumori. Questo studio includeva un protocollo di rilevamento dettagliato di saggi per knockdown di lncRNA e formazione di colonie, con un esempio del knockdown del gene ospite di RNA nucleolare piccolo 6 (SNHG6) nelle cellule osteosarcoma (143B). I risultati sperimentali hanno confermato un'efficace soppressione dell'espressione di SNHG6, accompagnata da una marcata riduzione sia del numero che della dimensione delle colonie. Questi risultati suggeriscono che SNHG6 è essenziale per sostenere il potenziale proliferativo a lungo termine delle cellule osteosarcoma (143B).
Introduzione
Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA), definiti come trascritti più lunghi di 200 nucleotidi senza potenziale codificante proteico, sono emersi negli ultimi anni come importanti regolatori di diversi processibiologici 1,2. Svolgono ruoli fondamentali nell'inizio e nello sviluppo di vari tumori, tra cui osteosarcoma, cancro alla prostata e cancro ai polmoni 3,4,5. Nell'osteosarcoma, l'accumulo di evidenze suggerisce che l'espressione aberrante di RNA lungo non codificante (lncRNA) abbia un'influenza profonda sulla proliferazione cellulare. Ad esempio, silenziare lncRNA POU3F3 ha soppresso significativamente la proliferazione e promosso l'apoptosi delle cellule osteosarcoma (MG63 e U2OS)6. Analogamente, il knockdown dell'inncRNA HOXA-AS3 ha ridotto la formazione di colonie e inibito la crescita nelle cellule U2OS e SW13537. Dato che la proliferazione incontrollata è un tratto distintivo della biologia del cancro e un determinante importante delle strategie terapeutiche, chiarire la proliferazione cellulare regolata da LNCRNA nei tumori, in particolare nell'osteosarcoma, rimane di grande importanza e necessità.
Sebbene esistano diversi approcci per valutare la proliferazione cellulare, ciascuno comporta limitazioni intrinseche. I test colorimetrici o metabolici, come CCK-8 e MTT, sono comodi, rapidi e ad alta produttività. Tuttavia, forniscono principalmente letture a breve termine e sono facilmente confuse dalle fluttuazioni metaboliche, presentando rischi aggiuntivi di interferenze ottiche o fotochimiche dai reagentiutilizzati. I metodi basati sulla sintesi del DNA, inclusi BrdU ed EdU, offrono maggiore specificità pur limitandosi ad analisi istantanee dell'ingresso in fase S senza riflettere esiti proliferativi a lungotermine 9,10. Analogamente, l'immunocolorazione per marcatori di proliferazione, come Ki-67, indica solo un'attività istantanea del ciclo cellulare e non prevede la capacitàclonogenica 10. I sistemi di monitoraggio in tempo reale, come RTCA, consentono l'analisi continua della curva di crescita con alta riproducibilità, tuttavia il loro elevato costo e la limitazione alla valutazione a breve o medio termine ne riduconola praticità 11. Al contrario, il saggio clonogenico cattura in modo unico la capacità di una singola cellula di subire una proliferazione illimitata e formare colonie visibili, riflettendo così direttamente il suo destino finale. Nonostante sia laborioso e richieda molto tempo, il saggio clonogenico rimane lo standard d'oro per valutare il potenziale proliferativo a lungo termine, offrendo intuizioni irraggiungibili con saghi a breve termine osurrogati 12.
Qui, questo articolo include un protocollo dettagliato di rilevamento per il knockdown dell'RNA e i saggi sulla formazione di colonie, con un esempio di knockdown di SNHG6 nelle cellule osteosarcoma 143B. Questo approccio non è applicabile solo alla ricerca sull'osteosarcoma, ma funge anche da strumento praticabile per indagare la proliferazione mediata da LNCRNA in altri tumori.
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Protocollo
I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Trasfezione di plasmidi
- Seme 5 × 105 cellule 143B per ciotola di coltura da 10 cm (in totale due piattole), coltivare le cellule in mezzo completo (DMEM + FBS 10%) a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Prepara i reagenti di trasfezione 24 ore dopo, inclusi plasmidi (shNC e shSNHG6), PEI e Opti-MEM.
NOTA: Vortice e assicurati che tutti siano bilanciati alla temperatura ambiente prima dell'uso. - Estrai quattro tubi microcentrifughe da 1,5 mL, etichetta i plasmidi (shNC e shSNHG6) e PEI (due tubi) usando una penna marcatore.
- Aggiungi 500 μL di Opti-MEM a ogni provetta.
- Aggiungere 10 μg di plasmidi al tubo plasmidico (shNC o shSNHG6) e aggiungere 30 μL di PEI (1μg/μL) a ciascun tubo PEI.
- Mescola delicatamente su e giù, incuba a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Unisci il tubo plasmidico e il tubo PEI, mescola delicatamente e incuba la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Estrai 143 cellule B dall'incubatore e aspira delicatamente il mezzo di coltura. Aggiungi 7 mL di medium senza siero a ogni piatto. Etichetta le piattole per indicare i plasmidi da aggiungere (143B shNC o 143B shSNHG6).
- Aggiungi la miscela di trasfezione già preparata a goccia al corrispondente piatto di coltura.
NOTA: Aggiungi la miscela lentamente, usando una pipetta in movimento circolare, e distribuiscila uniformemente dal bordo esterno verso il centro della piatta. Incubare a 37 °C in un incubatore con il 5% di CO2. - Scartare il sovrantato 8-12 ore dopo e aggiungere 10 mL di mezzo DMEM completo a ciascun piatto da 10 cm di coltura. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Osservare al microscopio a fluorescenza a 72 ore dopo che il sovrantantante è stato scartato e sostituito con un mezzo DMEM completo.
2. Saggio sulla formazione della colonia
- Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura da 10 cm (shNC e shSNHG6), aggiungere 1,5 mL di tripsina-EDTA per digerire le cellule, pipettare delicatamente per staccarle e poi aggiungere 5 mL di mezzo intero per interrompere la digestione.
- Trasferire la sospensione della cella in un tubo microcentrifuga da 15 mL.
- Rimuovi 20 μL di sospensione cellulare e conti i numeri delle celle.
NOTA: Il conteggio delle celle deve essere eseguito più volte per garantire che i numeri delle celle nel gruppo shNC e nel gruppo shSNHG6 siano coerenti. Qui raccogliamo 3 × 105 celle per la verifica RT-PCR dell'efficienza di knockdown SNHG6. - Semina 2 × 103 celle per pozzo in una piastra a 6 pozzi. Aggiungere un mezzo DMEM completo a un volume finale di 2 mL e coltivare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
NOTA: Sostituisci il mezzo con un mezzo DMEM nuovo e completo a giorni alterni. - Monitora la formazione della colonia quotidianamente.
NOTA: Interrompere la coltura quando la maggior parte delle colonie nel gruppo di controllo (shNC) contiene ≥50 cellule, oppure dopo 10-14 giorni di incubazione, a seconda di quale caso avvenga per primo. - Togli le celle dall'incubatrice e scarta il soprantantante.
- Lava due volte le celle con 1 mL di PBS per pozzo e elimina il PBS dopo ogni lavaggio.
- Fissare le celle con 1 mL di soluzione al 10% di formalina per 15 minuti, poi scartare la soluzione al 10% di formalina.
- Lava due volte le celle con 1 mL di PBS per pozzo e elimina il PBS dopo ogni lavaggio.
- Colorare le cellule con 1 mL di soluzione di colorazione al 0,5% di viola cristallina per 10-30 minuti, poi scartare la soluzione di colorazione.
- Lava delicatamente le cellule con acqua del rubinetto che scorre lentamente.
- Asciuga le celle all'aria a temperatura ambiente.
- Scatta immagini usando una fotocamera.
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Risultati
Per valutare l'effetto dell'LNRa SNHG6 sulla capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma, abbiamo istituito con successo un sistema di knockdown mediato dal plasmide e eseguito saggi di formazione di colonie. Il flusso di lavoro sperimentale includeva la trasfezione plasmidiale di cellule 143B e il test di formazione della colonia (Figura 1).
L'efficienza di trasfezione delle cellule 143B è stata confermata tramite microscop...
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Discussione
Attaccare terapeuticamente gli LNa associati al cancro, oltre a sfruttare la loro utilità diagnostica come biomarcatori, rappresenta un approccio emergente nella gestione del cancro. Definire il ruolo degli LNa nella patogenesi dell'osteosarcoma è fondamentale per avanzare la diagnosi, la terapia e la prognosi.
Devono essere seguiti passi critici per garantire il successo di questo saggio. Innanzitutto, stabilire una sospensione a singola cellula è un prerequi...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro fu finanziato da sovvenzioni della National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 e 82205145).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MICROTUBI da 1,5 mL | Merck | AXYMCT150C | |
| Formalina tamponata al 10% di neutro | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 μ L Extended Graduate Blue Tips | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| Laboratorio di piatti di coltura cellulare da 100mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| Tubo centrifuga da 15 mL | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| Piastra di coltura cellulare a 6 pozzi | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 703001 | |
| Incubatore CO2 | Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd. | 300583057 | |
| Viola Cristallino | TCI Shanghai | C0428 | |
| Mezzo DMEM | WISENT CORPORATION | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - Qualità superiore | WISENT CORPORATION | 086-150 | |
| Penna di marca | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| Buffer PBS (polvere secca) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Poliscienze | 24765 | |
| Punte per pipette | Merck | AXYT200Y | |
| Enzima TrypLE Express | Gibco | 12604021 | |
| Tripsina/EDTA | Gibco | R001100 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
