Articolo metodologico

Valutazione dell'effetto dell'elettroagopuntura sul flusso sanguigno cerebrale nei topi APP/PS1 utilizzando la tecnica del laser speckle

DOI:

10.3791/69915

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13 febbraio 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un protocollo incentrato sull'imaging laser a contrasto di speckle per quantificare il flusso sanguigno cerebrale, combinato con il Morris Water Maze, per valutare gli effetti dell'elettroagopuntura nei topi APP/PS1 (modello AD), prezioso per la ricerca cerebrovascolare sull'AD.

Abstract

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Il morbo di Alzheimer (DA) è caratterizzato da un progressivo declino cognitivo e disfunzione cerebrovascolare, inclusa una riduzione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) e un compromisso delle unità neurovascolari. L'elettroagopuntura (EA) ha dimostrato potenziale nel migliorare le funzioni neurologiche, il suo meccanismo potrebbe essere correlato alla regolazione della CBF. L'imaging laser con speckle è un metodo a campo ampio per la valutazione in tempo reale del CBF e può valutare con precisione le variazioni nella perfusione sanguigna cerebrale. In questo esperimento, abbiamo osservato gli effetti dell'elettroagopuntura sulla CBF e sulle capacità cognitive nei topi modello AD (topi transgenici APP/PS1). La perfusione sanguigna dell'arteria cerebrale media e dei suoi vasi ramificati nei topi è stata osservata tramite imaging laser a speckle. La funzione cognitiva spaziale dei topi è stata valutata utilizzando il labirinto acquatico Morris. I risultati hanno mostrato che l'EA poteva migliorare la funzione cognitiva dei mouse APP/PS1, e la latenza di fuga è stata significativamente ridotta nel test del labirinto d'acqua di Morris (P<0.05). Inoltre, l'imaging laser a contrasto speckle (LSCI) ha confermato una significativa ipoperfusione cerebrale nei topi modello di DA rispetto ai controlli di tipo selvatico (P < 0,05) e, cosa importante, il trattamento con EA ha indotto un aumento statisticamente significativo della CBF (P < 0,05), invertendo l'ipopperfusione cerebrale nei topi con AD. L'imaging laser a speckle è una tecnica di visualizzazione per valutare i miglioramenti cerebrovascolari indotti dall'EA. Questi risultati supportano l'EA come potenziale terapia aggiuntiva per l'AD, mirando alla disfunzione cerebrovascolare.

Introduzione

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Il morbo di Alzheimer (DA) è un disturbo neurodegenerativo progressivo caratterizzato da un progressivo compromissione cognitiva e da un declino della memoria. Elabora le caratteristiche patologiche della deposizione di placche extracellulari beta-amiloide (Aβ), del groviglio neurofibrillare intracellulare (NFT) e della perditaneuronale 1. Sebbene queste caratteristiche classiche siano state il fulcro principale della ricerca terapeutica, le crescenti evidenze sottolineano il ruolo fondamentale della diminuzione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) nella patogenesi e progressione dell'AD2. La riduzione della CBF avviene nella fase iniziale dell'insorgenza dell'AD ed è associata alla gravità della disfunzionecognitiva 3. Pertanto, la strategia terapeutica per migliorare il danno cerebrovascolare è un modo efficace per alleviare i sintomi dell'AD e migliorare il decorso della malattia.

L'elettroagopuntura (EA), una tecnica moderna che integra l'agopuntura tradizionale con la stimolazione elettrica, ha dimostrato potenziale nel migliorare la funzione cognitiva nell'AD. Gli studi suggeriscono che l'EA possa esercitare i suoi effetti benefici attraverso molteplici meccanismi, come la riduzione della deposizione di Aβ, l'attenuazione della neuroinfiammazione e la promozione della plasticitàsinaptica 4. È in particolare che si specula sempre di più che gli effetti neuroprotettivi dell'EA possano essere strettamente legati alla sua capacità di modulare ilCBF 5. Tuttavia, le evidenze dirette e in tempo reale che dimostrano l'impatto dell'EA sull'emodinamica cerebrale nei modelli di AD rimangono limitate. La mancanza di tali prove ostacola una comprensione completa di come l'EA migliori la funzione cerebrale.

I progressi tecnologici nell'imaging ottico hanno fornito strumenti potenti per studiare l'emodinamica cerebrale. Come tecnica ottica rapida e a campo ampio, LSCI offre un'elevata risoluzione spaziotemporale per visualizzare le mappe del flusso sanguigno integrate a volume6, consentendo il monitoraggio in tempo reale delle dinamiche di perfusione indotte dall'elettroagopuntura. Sebbene l'esposizione al cranio sia necessaria per un accesso ottico ottimale, la LSCI evita la penetrazione invasiva dei tessuti. L'LSCI è stato introdotto negli anni '90 ed è stato ampiamente applicato nelle neuroscienze negli ultimi decenni7. Come tutte le tecniche di imaging, l'LSCI presenta limitazioni intrinseche: la sua profondità di penetrazione ottica è limitata, favorendo la vascolarizzazione corticale superficiale e limitando l'accesso alle regioni cerebrali profonde (ad esempio, ippocampo, gangli della base), e quantifica il flusso sanguigno relativo (unità di perfusione) piuttosto che i valori assoluti di CBF, con una precisione sottilmente influenzata dalla morfologia vascolare e dalla diffusione otticatissutale 8,9. Tuttavia, queste limitazioni non minano l'utilità della LSCI, ma ne definiscono l'applicazione specializzata nella valutazione in tempo reale del flusso corticale superficiale. Per il nostro studio focalizzato sui cambiamenti di perfusione corticale indotti dall'EA, LSCI fornisce dati affidabili e azionabili. In particolare, abbiamo stabilito un protocollo LSCI standardizzato con una delineazione mirata del ROI e parametri ottimizzati per quantificare il CBF nei topi APP/PS1, integrato dai test Morris Water Maze per collegare i miglioramenti cerebrovascolari agli esiti cognitivi.

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Protocollo

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Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino (BUCM20250708-005) ed è stato conforme a tutte le linee guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio in Cina.

1. Preparazione

  1. In questo esperimento sono stati utilizzati dodici maschi APP/PS1 di 6 mesi e sei maschi C57bl/6 di 6 mesi.
  2. Tutti i topi erano ospitati nel Centro di Sperimentazione Animale dell'Università di Medicina Cinese di Pechino, con tre topi per gabbia. Avevano libero accesso ad acqua potabile sterile e a una dieta standard a base di pellet.
  3. L'ambiente abitativo era mantenuto con un ciclo di 12 ore luce/scurezza, con la temperatura ambiente controllata a 23 ± 2 °C.

2. Raggruppamento e interventi degli animali

  1. Assegnare casualmente dodici maschi di topi APP/PS1 di 6 mesi (peso 27,88 g ± 0,48 g) a due gruppi sperimentali (n = 6/): il gruppo modello per la malattia di Alzheimer (AD) e il gruppo di trattamento per l'elettroagopuntura (EA).
  2. Utilizzare sei maschi di 6 mesi di topi C57BL/6 (peso 29,90 g ± 0,81 g) come gruppo di tipo selvatico (WT).
  3. Per i gruppi di controllo WT e modello AD, trattieni delicatamente i topi nei contenitori ben ventilati e non somministra interventi sperimentali.
  4. Per il gruppo di trattamento EA, si trattiene delicatamente i topi con lo stesso contenitore utilizzato per i gruppi WT di controllo e AD, limitando così i movimenti eccessivi garantendo una respirazione libera. In questa condizione di contenzione standardizzata, inserire gli aghi di agopuntura sterili usa e getta (0,25 mm × 13 mm) nei punti di agopuntura Baihui (GV20) e Yintang (GV29) (Figura 1A) sulla testa, diretti verso la regione nasale, con una profondità costante di 2-3 mm. Collegare rispettivamente i terminali positivo e negativo del dispositivo EA a questi due punti di agopuntura e fornire stimolazione per 15 minuti (Figura 1B). Configurare i parametri di stimolazione come un pattern d'onda denso a disperse, con un'intensità di 0,1 mA e una frequenza di 2 Hz.
  5. Somministrare gli interventi a ogni gruppo una volta ogni 48 ore, con ogni sessione della durata di 15 minuti, per una durata totale di 30 giorni.
    NOTA: Eseguire procedure di selezione, localizzazione e needling dei punti di agopuntura in conformità con T/CAAM 0002-2020: Nomi e località dei punti di agopuntura comunemente usati per animali da laboratorio Parte 3: Topi10, uno standard pubblicato dall'Associazione Cinese per l'Agopuntura e la Moxibustion il 15 maggio 2020.

3. Test MWM

NOTA: 24 ore dopo il periodo di intervento di 30 giorni, tutti i topi dei tre gruppi sperimentali sono sottoposti al test Morris Water Maze (MWM), che includeva sia la prova della piattaforma nascosta (navigazione del luogo) sia la prova con lasonda 11,12. Implementare un periodo di acclimatazione di 1 giorno prima dei test formali per minimizzare lo stress, permettendo ai topi di abituarsi alla sala sperimentale, all'apparato MWM e alle procedure di manipolazione.

  1. Procedure preparatorie
    1. Posizionare l'apparato MWM e il relativo sistema di acquisizione/elaborazione del segnale in una sala sperimentale attenuata dal suono. Mantenere la temperatura ambiente dell'ambiente di prova a circa 25 °C e standardizzare le condizioni di illuminazione come segue: montare quattro lampade LED da 60 W sopra i quattro quadranti del labirinto a un'altezza sufficiente a evitare la cattura da parte della telecamera a soffitto. Tende opache circondavano l'intera area di test per bloccare interferenze ambientali esterne e impedire che segnali spaziali involontari influenzassero la navigazione dei topi.
    2. Posizionare un serbatoio bianco circolare (90 cm di diametro × 50 cm di altezza) al centro dell'impianto MWM. Collega una videocamera montata a soffitto a un sistema di tracciamento automatico e a un registratore per una cattura continua dei dati durante i test.
    3. Dividere il serbatoio in quattro regioni uguali, indicate a nord (N), sud (S), est (E) e ovest (W), e ulteriormente segmentare in quattro quadranti congruenti, inclusi nord-est (NE), nord-ovest (NW), sud-ovest (SW) e sud-est (SE).
    4. Fissare forme visive distinte (quadrato, triangolo e cerchio) alla parete esterna di ciascun quadrante, posizionate all'interno della linea di vista dei topi per fungere da punti di riferimento spaziali.
    5. Riempire il serbatoio con 30 cm d'acqua mantenuta a 24 ± 1 °C con un riscaldatore elettrico; Aggiungi pigmento commestibile bianco per rendere l'acqua opaca.
  2. Prova con piattaforma nascosta
    1. Fissare una piattaforma sommersa nel quadrante sud-est per tutta la durata di questa prova.
    2. Rilascia casualmente ogni mouse nella piscina da tre quadranti alternativi (NE, NW, SO), con l'orientamento iniziale rivolto verso la parete del serbatoio per coerenza.
    3. Consentire a ogni mouse un massimo di 60 secondi per localizzare la piattaforma nascosta in modo indipendente.
    4. Registra la latenza di fuga (il tempo dal rilascio all'ascesa della piattaforma) per ogni prova per valutare l'apprendimento spaziale.
      NOTA: Ogni topo ha completato tre prove al giorno per cinque giorni consecutivi. Se un topo non trovava la piattaforma entro 60 secondi, veniva guidato delicatamente verso la piattaforma e lasciato rimanere lì per 10 secondi per rafforzare la memoria spaziale prima di concludere la prova.
  3. Processo a sonda
    1. Rimuovi la piattaforma.
    2. Lascia andare ogni topo una volta nella piscina rivolta verso la parete della vasca e permette 60 secondi di nuoto senza vincoli.
    3. Registrare le misure chiave di risultato: velocità media di nuoto e numero di attraversamenti sulla posizione precedente della banchina.
  4. Cura post-test
    1. Dopo ogni sessione MWM, asciuga accuratamente i topi con asciugamani morbidi e scaldali delicatamente con un riscaldatore elettrico per prevenire l'ipotermia.

4. Imaging con contrasto di macchie laser

  1. Seleziona casualmente tre topi da ogni gruppo e monitora il loro CBF in tempo reale e in campo completo utilizzando il sistema LSCI.
  2. Preparazione animale: eseguire tutte le operazioni sugli animali sotto anestesia. Anestetizzare i topi con iniezione intraperitoneale al 1,25% di tribromoetanolo (0,02 mL/g) per garantire una respirazione spontanea continua e posizionarli su una piastra operatoria orizzontale. Posizionare i topi anestetizzati su una borsa termica termostatica mantenuta a 37 °C per stabilizzare la temperatura corporea centrale. Rasi il cuoio capelluto e seziona con cura i muscoli/meningi sottostanti per esporre il cranio; Mantenere la superficie cranica esposta umida con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% per tutta la procedura per prevenire la disidratazione.
  3. Configurazione di imaging: Posizionare la testa di scansione del sistema perpendicolare alla finestra cranica esposta a una distanza fissa di 20 cm. Abilita le funzioni di automessa a fuoco e auto-guadagno per ottimizzare la nitidezza e il contrasto dell'immagine, mantenendo automaticamente i valori di guadagno all'interno di un intervallo di 140-160 in tutti gli esperimenti. Configurare parametri di imaging standardizzati aggiuntivi come segue: tempo di esposizione = 20 ms, costante di tempo = 1,0 s, modalità operativa = Temporale, filtro = 250 fotogrammi, intervallo campione = 5000 ms e risoluzione dell'immagine = 1032 × 772.
  4. Acquisizione dati: acquisire immagini speckle continue a una frequenza di campionamento di 25 Hz e sincronizzare la raccolta con i parametri temporali e di filtro preconfigurati.
  5. Analisi ROI: Utilizzare il software di analisi per definire le regioni di interesse (ROI) sulla corteccia prefrontale, prendendo di mira specificamente i territori dell'arteria cerebrale anteriore e media all'interno di quest'area corticale. Delinea i ROI su queste regioni vascolari ed estrae i valori medi di flusso (espressi in unità di perfusione) da ciascun ROI per un confronto statistico successivo.

5. Analisi statistica

  1. Esegui analisi statistiche utilizzando SPSS 27.0.
  2. Sono stati analizzati le differenze tra i gruppi nella piattaforma nascosta, i risultati delle prove e il CBF utilizzando il test t dello studente. Definisci la significanza statistica come P < 0,05 e fissa alta significanza statistica a P < 0,01.

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Risultati

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Effetti dell'EA sull'apprendimento spaziale e sulla memoria nei topi modello AD

I risultati del test del labirinto d'acqua di Morris sono mostrati nella Figura 2. La Figura 2A mostra la latenza di escape durante il test della piattaforma nascosta su cinque giorni. La latenza di fuga del gruppo AD mostrava una tendenza fluttuante, mentre i gruppi WT ed EA diminuirono costantemente. La ...

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Discussione

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Il presente studio dimostra che un intervento a lungo termine dell'EA nei punti di agopuntu Baihui (GV20) e Yintang (GV29) migliora significativamente i deficit di apprendimento spaziale nei topi transgenici APP/PS1, come dimostrato dalla latenza di fuga ridotta nel test della piattaforma nascosta Morris Water Maze. Questa scoperta è coerente con rapporti precedenti secondo cui l'EA migliora la funzione cognitiva in vari modelli di AD tramite meccanismi come la riduzione della deposizion...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal Progetto di Coltivazione della Ricerca Scientifica della Scuola di Agopuntura-Moxibustion e Tuina, Università di Medicina Cinese di Pechino.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago per agopuntura(Beijing Zhongyan Taihe Medicine Company, Ltd., Cina0,25 mm e tempi; 13 mmAgo per agopuntura
Sistema di imaging a contrasto con specchi laserGene& Io Scientifico. Ltd.MoorFLPI-2
Contenitore per topiCentro Attrezzature del Laboratorio HengtaiHT-A2
TribromoetanoloNanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd. M2910Anestesia

Riferimenti

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Imaging a contrasto di speckle laserMalattia di AlzheimerDisfunzione cerebrovascolareFunzione cognitivaLabirinto acquatico di MorrisUnit neurovascolareIperperfusione cerebrale

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