Idrogel di poliacrilammide ZrOH per campionamento spazialmente risolto di carboxilati emessi dalle radici che crescono nel terreno

Summary

In questo protocollo, dettagliamo l'uso di idrogel di idrossido di zirconio di poliacrilamide (idrogel ZrOH) come metodo non distruttivo e in situ per campionare carbossilati espulsi dalle radici da radici intatte cresciute nel terreno in diverse fasi di sviluppo delle colture. Descrive inoltre la successiva mappatura localizzata e quantificazione di questi carbossilati tramite Cromatografia Ionica-Spettrometria di Massa (IC-MS).

Abstract

Il campionamento e la quantificazione affidabile degli essudati radicali da radici vegetali coltivate nel terreno non disturbate restano una sfida. Abbiamo ulteriormente sviluppato un metodo non distruttivo per il campionamento, la mappatura 2D e la quantificazione di sette carbossilati (aconato, citrato, fumarato, lattato, malato, ossalato, succinato) emessi dalle radici coltivate in rhizobox. Il metodo descritto qui impiega idrogel di poliacrilamide zirconio idrossido (ZrOH hydrogels) che assorbono tutti i carbossiliati testati e possono essere eluiti con un'efficienza che varia dal 95,3% ± 3,12% al 111% ± 1,99%. Gli idrogel ZrOH hanno un'elevata capacità di legame per i carbossilati, fino a 1,82 μmol ^cm-2, a seconda del pH della soluzione e delle specie di carbossili, una concentrazione superiore a quella solitamente disponibile nella rizosfera. Inoltre, i carbossiliati legati sugli idrogel ZrOH rimangono stabili e possono essere conservati per diverse settimane a 4 °C prima dell'analisi. Per l'applicazione, le piante vengono coltivate in rizobox riempiti di terreno che permettono un facile accesso con il minimo disturbo del sistema radicale. Per campionare i carbossiliati rilasciati dalle radici, gli idrogel ZrOH vengono applicati con cura nella regione di interesse per 24 ore. Dopo il recupero degli idrogel ZrOH, questi vengono tagliati a scopo di mappatura e i pezzi di gel vengono eluati per un'analisi successiva di carbossili (ad esempio, tramite Cromatografia Ionica - Spettrometria di Massa). I nostri risultati indicano che gli idrogel ZrOH sono efficaci per catturare e determinare le concentrazioni di carbossili nella rizosfera. La novità di questo metodo risiede nella sua capacità di campionare essudati radicali da radici vegetali intatte cresciute nel suolo, oltre alla possibilità di campionamento risolto nel tempo, rispetto ai metodi tradizionali (approccio ibrido suolo-idroponico) che sono spesso distruttivi e permettono solo un campionamento monolocale. Soprattutto, consente la generazione di immagini 2D quantitative, ad alta risoluzione e su scala millimetrica, facilitando la visualizzazione dell'essudazione carbossilata lungo l'asse radicale e la sua distribuzione spaziale all'interno della rizosfera. Inoltre, questo metodo facilita il campionamento degli essudati radicali in varie fasi di crescita durante il ciclo di crescita.

Introduction

Le radici delle piante emettono vari composti nella rizosfera, modellando le loro proprietà fisiche, chimiche e^biologiche. Quando le piante sono esposte a condizioni di stress abiotiche e biotiche, l'essudazione radicale è particolarmente innescata. Gli essudati radicali possono, infatti, influenzare la disponibilità e la mobilitazione di nutrienti/metalli, le comunità e l'attività microbica, la stabilità degli aggregati del suolo e le difese delle piante contro i patogeni direttamente o^{indirettamente 1,2,3}. Tra gli essudati radicali più importanti ci sono i carbossilati dovuti al loro ruolo nella solubilizzazione dei nutrienti (inclusi fosforo (P), ferro (Fe), rame (Cu) e zinco (Zn)), tolleranza ai metalli pesanti e potenziamento di microrganismi benefici nella^rizosfera 2,3,4,5.

In particolare, i carbossilati esudati includono citrato, lattato, ossalato, malato, succinato e^{fumarato 6,7,8}. Ad esempio, il citrato svolge un ruolo vitale nell'acquisizione di P mobilitando P legato a Fe o a ossidi di alluminio (Al) (idr)^{ossidi 7,9}. Tuttavia, campionare e quantificare accuratamente gli essudati radicali delle piante coltivate in terreno rimane una sfida sperimentale, principalmente a causa della difficoltà nell'accedere fisicamente a sistemi radicali non disturbati nel terreno e nell'ottenere campioni di essudati^{radicali 10,11}. Inoltre, i composti esudati subiscono rapidamente una degradazione microbica (entro pochi minuti o ore⁾¹² e si adsorbono fortemente alle superfici minerali del^suolo1,10. Un'ulteriore sfida negli studi di essudazione radicale è il monitoraggio dell'essudazione nel tempo, poiché la maggior parte dei metodi di raccolta disturba le radici o richiede la raccolta delle piante cresciute nel suolo, rendendo difficile valutare nuovamente la stessa^{radice 1,11}. Pertanto, un campionamento accurato, la quantificazione e il monitoraggio degli essudati radicali richiedono una tecnica che catturi la variazione spaziale e faciliti il campionamento ripetuto durante la crescita delle^{piante 11}.

Nel studio attuale, presentiamo un metodo non distruttivo e in situ, inizialmente sviluppato per il citrato da Tiziani et ^al.12, ora ulteriormente raffinato e applicato per il campionamento, la localizzazione spaziale precisa e la quantificazione di sei carbossilati aggiuntivi (aconato, fumarato, lattato, malato, ossalato e succinato) espulsi da radici vegetali intate coltivate nel terreno in rizobox. Il metodo utilizza idrogel di poliacrilamide a base di idrossido di zirconio (idrogel ZrOH) per campionare esudati^{radicali 13}. Gli idrogel ZrOH mostrano una forte capacità di legame per gli anioni (inclusi i carbossililati) che possono essere facilmente^eluzionati 12,13,14. Gli idrogel ZrOH (1) permettono di campionare carbossilati radicali dalle radici delle piante coltivate nel terreno semplicemente posizionando l'idrogel sul sistema radicale con minima perturbazione, (2) offrono una protezione efficace dei carbossiliati legati contro la mineralizzazione microbica per almeno 6 settimane, (3) la distribuzione spaziale dei carbossilati nella rizosfera viene preservata al momento del legame al gel, e (4) consentono una mappatura 2D in scala millimetrica dei carbossiliati^12.

I metodi esistenti per il campionamento degli essudati radicali sono classificati come tecniche basate sul suolo da piante coltivate nel terreno (cioè lavaggio radice o ibrido suolo-idroponico, dispositivi collettori di essudati suolo-radice (SOIL-REC), microventose, carta filtrante/fogli di agar, trappole di essudazione e la tecnica RHIZOtest) o metodi di campionamento idroponico degli essudati. Il lavaggio delle radici o l'approccio ibrido suolo-idroponico prevede la rimozione attenta dell'intera pianta dal suolo, il lavaggio del sistema radicale e poi l'immersione nella soluzione di campionamento per raccogliere essudati^{radicali 15}. È il metodo più utilizzato per campionare essudati da piante coltivate nel terreno grazie alla sua semplicità. Tuttavia, estrarre le radici dal terreno comporta il rischio di perdita di peli radicali e radici più fine. Inoltre, è necessaria una pulizia approfondita delle radici, che può danneggiare le radici, compromettere la qualità e la quantità degli essudati radicali e impedire campionamenti a risoluzione^{temporale 8,11}. Il metodo SOIL-REC prevede la coltivazione delle piante in un sistema di rizobox appositamente progettato con radici che crescono tra due reti porose di nylon (≤ 30 μm) e la raccolta degli essudati radicali utilizzando uno strumento per la raccolta degli essudati^{radici 16,17}. Questo approccio preserva il sistema radicale, minimizza la contaminazione del suolo e consente la raccolta ripetuta degli essudati radicali. Tuttavia, ha una configurazione complessa (con poche repliche), una maggiore diluizione degli essudati da volumi più grandi utilizzati per il campionamento, e richiede comunque ottimizzazione, poiché la sua replicabilità è impegnativa e esistono enormi variazioni tra le^{repliche 8}.

L'applicazione di piccoli pezzi di resine, fogli di gel agario o carta filtrante in grado di equilibrarsi con la soluzione circostante o di adsorbere essudati sui segmenti radicali di interesse di radici intatte e accessibili cresciute nel terreno (cioè usando rizobox o finestre radicali^)18,19. Questo metodo consente campionamenti a risoluzione temporale e misurazione parziale della composizione localizzata degli essudati, sebbene con bassa risoluzione spaziale. D'altra parte, è suscettibile agli artefatti derivanti dalla mineralizzazione microbica ed è difficile da maneggiare. Analogamente, le trappole per essudati vengono utilizzate per campionare essudati radicali da singoli segmenti radicali, dove una singola radice è intrappolata in camere laterali orizzontali, con anelli sigillati in Perspex contenenti la soluzione di campionamento, posizionati^{localmente 8}. Il metodo è applicabile sia a radici idroponiche che a quelle coltivate nel suolo e consente un campionamento^{localizzato 12}. Tuttavia, si raccolgono piccoli volumi, il campionamento a risoluzione temporale è quasi impossibile e isolare le singole radici è suscettibile a stress meccanico, che potrebbe influire sul metabolismo e l'esudazione^{delle radici 8}. Microventose vengono utilizzate per raccogliere la soluzione del suolo nella rizosfera, permettendo il campionamento in situ da radici coltivate nel^{terreno 20}. Tuttavia, si raccolgono piccoli volumi, il campionamento è parzialmente risolto nel tempo e gli essudati sono soggetti all'adsorbimento e alla degradazione^{microbica 16}. La tecnica RHIZOtest consiste nel far crescere radici idroponicamente in piccoli cilindri con il fondo coperto da una rete di nylon da 30 μm e poi trasferirle su un disco di suolo, permettendo lo scambio di soluti tra radice e^{suolo 8,21,22.} Gli essudati vengono raccolti immergendo il tappeto radicale in una soluzione di campionamento. Questo metodo mantiene il contatto con radici e suolo ma impiega condizioni di crescita artificiali. È limitato a esperimenti a breve termine e manca di campionamento a tempo determinato. Tra questi metodi, solo resine, fogli di gel di agar, carta da filtro, trappole di essudazione e microventose possono essere impiegate per determinare i modelli di essudazione spaziali.

I metodi di campionamento idroponico degli essudati comprendono tecniche di idroponica e semi-idroponica. L'idroponica è un metodo frequentemente utilizzato e semplice per raccogliere essudati radicali, in cui le piante vengono coltivate in una soluzione nutritiva, che viene poi sostituita con una soluzione di campionamento (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, micropur) per ottenere campioni di^{essudato 15,23}. Il metodo è semplice e impone uno stress meccanico minimo sulle radici. È altamente riproducibile e sterile se necessario, il che aumenta la qualità degli essudati radicali e consente un campionamento a risoluzione^{temporale 5,16}. Tuttavia, è un sistema altamente artificiale che può alterare la fisiologia delle piante, la morfologia (ad esempio, lo sviluppo dei peli radicali) e i processi di essudazione^{radicale 6,15}. Nella semi-idroponica, le piante vengono coltivate su perline di vetro, sabbia o vermiculite con una soluzione nutriente a percolazione continua, e gli essudati vengono raccolti nella soluzione di^{percolazione 8,18}. Questo approccio è leggermente meno artificiale rispetto all'idroponica e permette un campionamento a risoluzione temporale. Tuttavia, il sistema è quasi completamente saturo d'acqua e quindi richiede piante tolleranti a condizioni parzialmente anaerobiche.

Rispetto ad approcci alternativi, il metodo degli idrogel ZrOH offre diversi vantaggi. Gli idrogel ZrOH permettono di campionare essudati radicali in coltura del suolo (vicino a condizioni naturali) con un disturbo minimo del sistema radicale, un campionamento risolto nel tempo durante il ciclo vitale della pianta e la raccolta di essudati radicali per più di 24 ore è possibile grazie alla minore degradazione microbica e all'elevata capacità di legame^{carbossiliata 12}. Inoltre, non è necessario alcun biocida (ad esempio micropur,_{NaN 3}) per campionare/preservare gli idrogel, che hanno un potenziale effetto sullo strumento analitico a lungo termine e interferiscono con l'analisi chimica. Questo perché i carbossiliati sono chimicamente legati all'idrogel ZrOH. Inoltre, i campioni possono essere conservati per alcune settimane o mesi prima dell'analisi e, di conseguenza, molti campioni possono essere raccolti da un unico sistema^{sperimentale 12}, attribuibile alle proprietà antimicrobiche dello Zr presente nell'idrogel^24,25. Inoltre, gli idrogel ZrOH permettono una mappatura a risoluzione millimetrica 2D di composti esudati e altri anioni nella rizosfera, con la possibilità di campionare l'intero sistema^radicale 12,14,26. Gli idrogel ZrOH occupano meno spazio di stoccaggio in frigorifero (4 °C) rispetto ai grandi volumi richiesti dai metodi classici, che vengono tipicamente conservati nel congelatore (-20 °C). La principale limitazione è abituarsi a produrre idrogel ZrOH di alta qualità con bolle d'aria minime o assenti, oltre al fatto che le rizobox rimangono sistemi di ambiente di crescita artificiali. Un'altra limitazione è che il metodo è stato sviluppato solo per sette carbossilati (aconato, citrato, fumarato, lattato, malato, succinato e ossalato⁾¹², sulfonamidi (sulfadiazina, sulfametazina, sulfacloropiriazina e clindamicina⁾²⁷, e anioni inorganici (solfuri e ossianioni di P, V-vanadio, As-arsenico, Se-selenio, Mo-molibdeno, Sb-antimonio^)14,26,28,29. L'idrogel ZrOH è stato inoltre utilizzato in combinazione con il reagente particolato sospeso – acido iminodiacetico per campionamento in situ e mappatura dei cationi (Al, Fe, Ca-calcio, Mg-magnesio, Mn-manganese, Ni-Nichel e Zn-Zinco) nella rizosfera 28,29,30.

Qui forniamo un metodo a base di idrogel ZrOH per consentire campionamenti in situ risolti in tempo e spazialmente di carbossiliati da sistemi radicali cresciuti nel suolo. Forniamo una descrizione dettagliata di come eseguire un esperimento con la rizobox, inclusi campionamenti e mappatura 2D degli essudati radicali utilizzando la tecnica idrogel ZrOH. Copre la preparazione dell'idrogel, il riempimento del rizo, la coltivazione delle piante, l'applicazione, il recupero e la riduzione dell'idrogel, l'eluzione e l'analisi dei carbossili, e segue la generazione di immagini 2D. Inoltre, fornisce note sui passaggi critici, come l'analisi carbossilata tramite cromatografia ionica-spettrometria di massa (IC-MS).

Protocol

1. Preparazione di idrogel ZrOH

NOTA: È necessario un ambiente e materiali puliti per la preparazione del gel per evitare contaminazioni. Utilizzare solo acqua di grado di laboratorio (≤18 MΩ·cm) durante la preparazione delle soluzioni, il risciacquo con gel e l'idratazione per garantire la qualità. Assicurarsi che i contenitori di rifiuti tossici (liquidi e solidi) siano già inseriti nella cappa prima di iniziare la preparazione dell'idrogel. Preriscaldare il forno a circa 42─45 °C per 1 ora prima di iniziare la preparazione dei gel. I dettagli sui materiali e sulle sostanze chimiche sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dell'assemblaggio del vetro
   1. Prepara un bagno acido HNO₃ al 10% (p/v) aggiungendo 153,8 mL di HNO₃ al 65% a 846,2 mL di acqua di laboratorio di grado I in una cappa a fumo.
   2. Immergi le lastre di vetro (6,1 x 17 cm), le pinzette, i distanziatori a forma di U in Teflon (0,25 mm o 0,4 mm) e le clip di plastica nel bagno acido per almeno 4 ore.
   3. Rimuovi le piastre di vetro, le pinzette, le clip di plastica e i distanziatori in Teflon dal bagno d'acido e poi lava almeno tre volte con acqua di laboratorio di qualità I. Poi lasciali asciugare all'aria in un banco a flusso laminare o pulito.
      NOTA: Le lastre di vetro devono essere preparate lo stesso giorno della preparazione del gel ed evitare di asciugarle con carta per minimizzare la contaminazione.
   4. Posiziona il distanziatore a forma di "U" sulla lastra di vetro secco, aggiungi il secondo e fissali insieme usando delle pinze. Sposta le lastre di vetro di circa ~1 mm per facilitare la pipettura (vedi Figura 1A).
   5. Posiziona l'assemblaggio della piastra di vetro su una carta plastica pulita sotto il cappuccio del film prima di gettare la soluzione gel.
2. Preparazione del gel di^{poliacrilammide 31}
   1. Soluzione gel: Prepara una soluzione gel da 100 mL mescolando un gel reticolante Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) da 15 mL con 47,5 mL di acqua di laboratorio grado I in una fiala di plastica pulita, poi aggiungi 37,5 mL di soluzione di acrilammide (40%). Mescola accuratamente la miscela dopo l'aggiunta di ogni soluzione. La soluzione in gel può essere conservata in frigorifero (4 °C) per almeno tre mesi.
      NOTA: Assicurarsi di pipettere/pesare le quantità corrette di ciascuna soluzione e utilizzare solo la soluzione di acrilammide senza bis-acrilammide, poiché questa produce gel molli se inserita in un tampone di acido 2-(N-morfolino)-etanosulfonico (MES).
   2. Prepara una soluzione di persolfato di ammonio (APS) al 10% (p/v) sciogliendo 0,1 g di APS in 1 g di H_2O. Prepara la soluzione fresca ogni giorno e assicurati che sia completamente sciolta prima dell'uso.
   3. Prepara un cocktail gel mescolando una soluzione gel da 4 mL con 28 μL di APS al 10%, poi aggiungi 10 μL di 99% N,N,N'N'-Tetrametilenediamine (TEMED) in fiale di plastica pulite. Mescola dopo aver aggiunto ogni soluzione. La soluzione può essere preparata fino a 3 gel poiché la miscela polimerizza rapidamente. Il volume di un cocktail può essere regolato a seconda della dimensione delle piastre e dei distanziatori da utilizzare.
      NOTA: Evita bolle e schiuma quando si mescolano i vari reagenti.
   4. Pipettare lentamente la miscela di gel tra l'assemblaggio della lastra di vetro dal centro, come mostrato nelle Figure 1B,^{C 26}. Nel caso in cui ci siano bolle d'aria, rimuovile inclinando delicatamente l'assemblaggio di vetro o battendo sulle lastre con una penna.
      NOTA: Per ottenere gel senza bolle, evita di usare piastre di vetro graffiate e conservale in un bagno acido dopo l'uso, lavandole solo prima del prossimo utilizzo invece di conservarle in sacchetti di polietilene. Usa una pipetta da 1 mL o 5 mL con una punta piccola per gettare il gel e aggiungi il cocktail di gel lentamente dal centro in modo che si distribuisca uniformemente inclinando le piastre a un angolo di 45°.
   5. Metti l'assemblaggio nel forno preriscaldato e mantieni la temperatura a 42─46 °C per almeno 1 ora per assicurarti che il gel si solidifichi completamente (senza gocce liquidi).
   6. Leva delicata con l'aiuto di una lametta pulita e priva di ruggine dagli angoli e lava i gel dalle lastre di vetro usando acqua di laboratorio di grado I in una bottiglia (Figura 1D–F). Per una facile rimozione del gel, immergilo in acqua per alcuni minuti e poi lavalo in un becher da 1-L contenente acqua di laboratorio di grado I.
      NOTA: Evita di tirare il gel con una pinzetta nel caso si attacchi alla piastra perché questo può causare deformazioni del gel. Dopo la polimerizzazione, eventuali bolle apparenti si trovano solitamente tra il gel e la piastra di vetro piuttosto che all'interno del gel stesso, che diventa chiaro una volta rimossa la placca.
   7. Cambia l'acqua almeno 3–4 volte entro 24 ore dall'idratazione (preferibilmente a intervalli di 2 ore dopo la preparazione) per lavare via i residui chimici di polimerizzazione. Sostituendo ripetutamente l'acqua durante l'idratazione, impurità come reagenti non reattivi vengono diffuse e il pH si riduce, prevenendo l'accumulo di carica all'interno del gel.
   8. Conservare i gel in acqua di laboratorio di grado I (per un breve periodo di circa 24 ore) oppure in frigorifero (4 °C) a 0,01 mol di ^L-1 NaCl o_{NaNO 3} se i fogli di gel non vengono utilizzati immediatamente per la precipitazione dello ZrOH. Questi gel possono essere conservati in NaCl fino a 1 mese prima della precipitazione.
      NOTA: Raccomandiamo di precipitare i gel immediatamente dopo la polimerizzazione per minimizzare la contaminazione che potrebbe essere introdotta durante il lavaggio.
3. Precipitazione dei gel ZrOH¹⁴
   1. Sciogliere 3,22 g di ottaidrato di ossido di dicloruro di zirconio (ZrOCl_{2,8H 2}O) in 40 mL di acqua di laboratorio di grado I in un becher di plastica da 250 mL.
   2. Posizionare fino a 4 fogli di gel e riempire fino a 100 mL. In alternativa, sciogliere 1,66 g di ZrOCl_{2,8H 2}O in 20 mL di acqua di laboratorio di grado I, mettere 2 gel e riempire fino a 50 mL.
   3. Immergi i fogli di gel per almeno 2 ore per garantire una distribuzione uniforme dello Zr nei gel.
   4. Trasferire ogni gel in 100 mL di acido etanosolfonico (MES) da 0,05 mol ^L-1 2-(N-morfolino)-etanosulfonico (MES) tamponato a pH 6,7 (il pH è regolato con 1 mol ^L-1 NaOH) per la precipitazione. Mescolare delicatamente il gel con una pinzetta durante i primi 30-60 secondi per ottenere una precipitazione omogenea.
   5. Agita delicatamente su un mixer a piatti a ≤100 giri/min per 40 minuti per una completa precipitazione di Zr(OH)₄ nel gel.
      NOTA: Si preferisce una velocità di agitazione più lenta per evitare che i gel si attacchino tra loro.
   6. Mettere i gel in acqua di laboratorio di grado I in un becher da 1─2 L per 24 ore per ^{rimuovere gli} ioni Cl- e cambiare l'acqua almeno 3 volte a intervalli di^{2 ore 32}. La rimozione accurata degli ioni Cl^- può essere verificata misurando la conducibilità della soluzione di risciacquo o effettuando un test al cloruro.
   7. Conservare il gel in 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3} o NaCl, ma il NaCl è preferito per gli esperimenti sul suolo poiché il nitrato aumenta rapidamente l'attività microbica del suolo ed è anche un nutriente importante^{per le piante 13,32}.
   8. Gli idrogel ZrOH sono stati testati fino a 60 settimane (conservati in frigorifero a 4 °C) e si è dimostrato mantenere le loro caratteristiche e buone prestazioni (±10% dei valori target⁾³².
4. Taglio gel
   1. Pulisci la piastra di plexiglass non graffiata, le pinzette e una lametta affilata e priva di ruggine. In assenza di una piastra in plexiglass, può essere utilizzata qualsiasi lastra di vetro spessa e resistente.
   2. Inumidisce la piastra in plexiglass con acqua di laboratorio di grado I per aiutare a stendere i fogli di idrogel ZrOH.
   3. Stenda il foglio di idrogel ZrOH sulla piastra di plexiglass usando una pinzetta assicurandoti che resti piatto senza bolle. Identifica le aree con fori nei fogli; queste aree vanno evitate durante il taglio.
   4. Taglia con precisione i fogli di idrogel ZrOH con una lametta affilata alla dimensione desiderata. Rimuovere l'acqua dalla piastra dopo il taglio aiuta a vedere chiaramente le sezioni ritagliate.
      NOTA: Per una migliore identificazione dei lati per la mappatura 2D, consigliamo di tagliare pezzi di idrogel ZrOH in un trapezio ad angolo retto con il lato più lungo situato in alto a sinistra.
   5. Conservare gli idrogel ZrOH in acqua di laboratorio di grado I (per conservazione a breve termine e poco prima dell'applicazione del gel) oppure in 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3}/NaCl per conservazione a lungo termine (>24 ore).

2. Configurazione dell'esperimento Rhizobox

NOTA: Le piante sono coltivate in rizobox riempite di terreno, che variano nel design. Raccomandiamo l'uso di rizobox dotate di fori sul fondo o sul retro per facilitare l'irrigazione e garantire una distribuzione uniforme dell'acqua (vedi Figura Supplementare 1). I dettagli sui materiali e i prodotti chimici sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Determinazione del riempimento della rizobox e capacità di ritenuta^{d'acqua 26}
   1. Setaccia il terreno essiccato all'aria usando un setaccio da 2 mm e omogeneizza il terreno. Raccomandiamo l'uso di terreno a trama media, ma si può anche utilizzare terreno sabbioso o argilloso, a condizione che vengano impiegate tecniche specifiche di manipolazione (ad esempio, tipo rizobox, riempimento, apertura e irrigazione).
   2. Pesa tutti i componenti della rizobox (vuota) insieme alle pinze e alla carta di alluminio e annota il peso (vedi Figura Supplementare 2C). Aggiungi 2–3 rizobox extra al numero richiesto per determinare la capacità di ristoccaggio d'acqua (WHC).
   3. Stima la massa di terreno secco necessaria per riempire il rizobox. Generalmente, il rizobox viene riempito fino a 2 cm sotto la sommità. La densità bulk raccomandata è di circa 1,0–1,4 g ^cm-3.
   4. A seconda del tipo di rizobox e della comodità di maneggiarla, riempire con cura il rizobox con il terreno secco. Durante e dopo il riempimento, il terreno può essere livellato usando una piastra piatta senza compattarlo. Un terreno leggermente umido può anche essere utilizzato per riempire il rizobox, mantenendo la struttura del suolo, specialmente per terreni a trama fine o argillosa pesante (vedi Wagner et ^al.26 per una descrizione dettagliata).
   5. In alternativa, se la rizobox è riempita dall'alto, fissare la carta plastica sulla rizobox, coprirla con la piastra frontale e poi serrare (vedi Figura Supplementare 2A–D).
   6. Per comodità, installa una membrana nucleporale durante il processo di riempimento e assicurati che sia piatta sulla superficie. È necessaria una membrana nuclepora durante il campionamento degli essudati radicali.
   7. Annota il peso delle rizobox riempite di terra insieme alle pinze. Calcola la massa del terreno secco (m_{terreno secco}) per ogni rizobox sottraendo il peso delle rizobox vuote da quelle ripiene di terra e annota il peso.
   8. La capacità di rizocassetta è determinata prima saturando le rizobox con acqua deionizzata e poi lasciandole drenare per ~8 ore. Pesare le rizobox e calcolare la massa d'acqua (m_w) sottraendo il peso delle rizobox riempite nel terreno registrate nel passo 2.1.7 dal peso attuale. Poi determinare WHC (g ^g-1) dividendo m_w per_{m terreno secco}, il risultato è un rapporto.
      NOTA: Non utilizzare rizobox usate per la determinazione del WHC per la mappatura effettiva, poiché la saturazione dell'acqua può portare all'anaerobia e quindi a artefatti redox.
   9. Il contenuto idrico ottimale per la maggior parte delle piante durante la crescita dovrebbe essere mantenuto al 50%─60% WHC (cioè fattore WHC, f_WHC = 0,5─0,6), a seconda del tipo di suolo e della specie vegetale. Stima la quantità d'acqua da aggiungere (m_{w aggiungere}) a ogni rizobox come segue: m_{w add} = WHC x f_{WHC x m terreno secco}.
   10. Annaffia la rizobox prima di piantare con m_{w add}. Se l'annaffiatura viene fatta attraverso i fori, aggiungi 5-10 mL d'acqua in superficie.
   11. Annota la massa delle rizobox annaffiate, necessarie per annaffiare le piante durante la crescita delle piante.
2. Coltivazione e gestione delle^{piante 12,26}
   1. Sterilizza i semi prima della germinazione o della piantagione. Una pratica comune è metterli al 70% di etanolo per 3 minuti e poi in NaClO all'1% per 15 minuti per prevenire la crescita fungina. Poi risciacquare i semi con acqua deionizzata (circa 6─7 volte).
   2. Pre-germinare i semi tra fogli filtranti o rotoli di germinazione bagnati con acqua o 0,05 mmol L⁻¹ _{CaSO 4} fino all'emergenza della radice.
   3. Trasferisci una piantina in ogni rizocassetta, posizionala vicino alla piastra anteriore, copri con un po' di terra e poi aggiungi un po' di acqua.
   4. Avvolgere le rizobox in un foglio di alluminio per prevenire la riduzione fotochimica nella rizosfera, prevenire la crescita di alghe e altri microrganismi fotosintetici, nonché evitare di stressare le radici quando esposte alla luce. In alternativa, sono disponibili lastre frontali nere che non permettono il passaggio della luce e possono essere utilizzate al posto della lamina di alluminio.
   5. Posizionare le rizobox su una grappa per inclinarle nella camera di crescita o nella serra con temperatura, umidità relativa e intensità luminosa controllate. Raccomandiamo un'inclinazione di 25°─35°.
   6. Annaffiare le rizobox gravimetricamente almeno 2─3 volte a settimana, a seconda delle esigenze delle piante. Questo avviene pesando le rizobox, aggiungendo acqua per compensare la differenza rispetto al peso registrato nel passo 1.2.11. Tuttavia, quando la biomassa della pianta è significativa e la domanda d'acqua aumenta, la biomassa deve essere considerata e il volume di irrigazione deve essere adeguato di conseguenza.
   7. Le pratiche specifiche di gestione delle colture (ad esempio, la fertilizzazione) vengono eseguite in base all'impianto sperimentale, alle caratteristiche del suolo, alle specie vegetali coltivate e alle esigenze prevalenti di controllo di malattie e parassiti durante la crescita delle piante.
   8. Il periodo di crescita e il campionamento dell'essudato radicale dipendono in gran parte dalla dimensione dei rizobox, dalle specie vegetali e dagli obiettivi dello studio.

3. Campionamento dell'essudato delle radici^12,26

NOTA: Qui forniamo dettagli sul campionamento non distruttivo degli essudati radicali. Assicurarsi che tutti i materiali necessari siano preparati prima del campionamento e che i materiali sperimentali siano inclusi durante il campionamento. I dettagli sui materiali e sulle sostanze chimiche sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Porta lentamente il contenuto d'acqua delle rizobox al 90%─95% WHC (80% per colture altamente sensibili allo stress da ossigeno) un giorno o almeno 2 ore prima del campionamento. Questo può essere ottenuto accuratamente calcolando prima la quantità d'acqua da aggiungere (m_{w add}) nel passo 2.1.9 usando il 90%─95% WHC, poi ricalcola il peso totale del rizobox, del terreno umido e una stima del peso della pianta. Usando un bilancio, aggiungi acqua deionizzata finché il rizobox non raggiunge il peso ricalcolato.
2. Srotola la lamina di alluminio dal rizocassetto, identifica e disegna la regione di interesse sulla piastra anteriore. Questo passaggio è necessario solo se vengono campionati solo i segmenti radicali o le piante jove.
3. Tagliare una lamina plastica e un idrogel ZrOH (vedi passo 1.3) nelle dimensioni specificate in base alla regione di interesse e alla dimensione del rizobox. Se la membrana nucleoforica non è stata installata durante il processo di riempimento la taglia, tagliala alle dimensioni desiderate, leggermente più grandi rispetto allo idrogel ZrOH.
4. Posiziona le rizobox su un supporto piatto con la piastra anteriore rimovibile rivolta verso l'alto e aprile con cura (vedi Figura 2A). Rimuovi lentamente la carta stagnola assicurandoti che radici e terreno non vengano disturbate.
5. Posizionare un righello sull'area di interesse e catturare immagini ad alta risoluzione, necessarie per l'elaborazione successiva dei dati. Un righello funge da riferimento per una determinazione accurata della dimensione direttamente dall'immagine durante l'elaborazione, specialmente se devono essere campionati molti rizobox.
6. Aggiungere una piccola quantità d'acqua all'area radicale bersaglio finché non appare una sottile pellicola d'acqua sulla superficie (vedi Figura 2B). Un contenuto di umidità più elevato (preferibilmente 90%–95% WHC o 80% per colture altamente sensibili allo stress da ossigeno) del suolo facilita un buon contatto suolo-gel durante il campionamento. È necessario un contenuto di umidità più elevato per mantenere un flusso costante di molecole sull'idrogel.
7. Posiziona la membrana nuclepora pretagliata direttamente sulla superficie del suolo/regione radicale di interesse e assicurati che sia piatta sull'interfaccia suolo-radice (vedi Figura 2C).
8. Posizionare l'idrogel ZrOH direttamente e il più piatta possibile sulla membrana nuclepora nella regione di interesse e scattare una foto insieme al righello posizionato sul lato sinistro dell'idrogel ZrOH (vedi Figura 2D). Il righello può aiutare a determinare la dimensione dell'idrogel ZrOH e, in caso di cambiamenti nelle proprietà durante il campionamento, l'area campionata e identificare i lati durante la conservazione prolungata (>1 anno).
9. Proteggi lo ZrOH idrogel dalla piastra frontale applicando una lamina di plastica sull'idrogel ZrOH (vedi Figura 2D).
10. Chiudere delicatamente la rizobox per ridurre il movimento dell'idrogel ZrOH. Un movimento minimo dell'idrogel ZrOH durante la chiusura della rizobox può essere ottenuto anche attaccando il sandwich gel (membrana nuclepore + idrogel ZrOH + carta plastica) a una piastra frontale pulita della rizobox con nastro isolante in vinile, come descritto da Wagner et^{al. 26}.
11. Avvolgi nuovamente la rizobox nella stagnola di alluminio e rimettila nella camera di crescita/serra per 24 ore. Gli essudati radicali possono essere raccolti per periodi più lunghi o più brevi, a patto che il gel non si secchi e a seconda dell'allestimento sperimentale e degli obiettivi dello studio.
12. Dopo il periodo di applicazione, apri delicatamente il rizobox, rimuovi con cura il nastro e la membrana, e recupera l'idrogel. Metti l'idrogel in una busta sterile ermetica, aggiungi qualche goccia d'acqua prima di chiudere e poi conserva in frigorifero (4 °C) fino all'analisi. Conserva i gel in bianco in modo simile a un controllo. Per scopi di mappatura 2D, solleva l'idrogel ZrOH insieme a un foglio di plastica e segna la parte superiore.
13. Rimuovere le radici e determinare i parametri morfologici della radice, il peso fresco e il peso secco per la normalizzazione dei dati essudati se non vengono condotti esperimenti di risoluzione temporale.
14. Chiudi il rizobox e rimettilo nella camera climatica o nella serra se vengono condotti studi con risoluzione temporale.

4. Eluzione e misurazione dei carbossilati¹²

NOTA: Sono necessari standard di laboratorio di grado I e di alta purezza per preparare i materiali e gli standard. Come garanzia di qualità, devono essere utilizzati standard certificati di controllo qualità. Assicurarsi che le soluzioni (campioni e standard) siano prive di particelle filtrando i campioni attraverso filtri in nylon da 0,2 μm o 0,45 μm prima dell'analisi per evitare l'ostruzione dei tubi. I dettagli sui materiali e sulle sostanze chimiche sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Rimuovi gli idrogel ZrOH carichi e quelli brutti dal frigorifero, misura le dimensioni usando un righello e poi calcola il volume di ciascuno usando uno spessore di 0,4 mm per un distanziatore da 0,25 mm e 0,64 per uno da 0,4 mm. Per la mappatura 2D, taglia gli idrogel ZrOH nella dimensione desiderata usando una lametta pulita. Tieni presente che il limite inferiore è circa 2 x 2 mm a causa delle difficoltà nel tagliare pezzi più piccoli e gestire i volumi di eluzione appropriati.
   NOTA: Invece di un righello, usa carta millimetrata (millimetrica) su un lato della piastra di plexiglass usata per il taglio, facilitando il taglio degli idrogel ZrOH in pezzi quasi perfetti. Lo spessore degli idrogel ZrOH è confermato usando un calibro vernier.
2. Posizionare gli idrogel ZrOH o i pezzi di idrogel ZrOH in fiale di plastica, eluirli aggiungendo 0,5 mol ^L-1 NaOH seguendo il rapporto 1 mL eluente per 0,196 cm 3 ZrOH idrogel e agitare su uno shaker a piastra per 24 ore a 150 giri al minuto.
3. Se il volume di eluzione è basso nel caso di un pezzo di idrogel ZrOH molto piccolo (ad esempio 2 x 2 mm), aggiungere acqua di grado I da laboratorio in peso per arrivare a 45-60 μL, a seconda del volume minimo necessario per il metodo analitico utilizzato per la quantificazione dei carbossilati (ad esempio l'IC-MS necessita di almeno 45 μL di campione per l'autocampionatore, a seconda dello strumento). Registra la quantità esatta di acqua aggiunta per portare il volume a 45-60 μL, poiché ciò sarà necessario per il fattore di diluizione e il calcolo effettivo della concentrazione.
4. Filtrare i campioni (filtri in nylon da 0,2 μm o 0,45 μm) e trasferirli in fiale. Raccomandiamo l'uso di fiale di plastica IC da 1,5 mL, poiché possono essere congelate senza rompersi. Fiale da 330 μL possono essere utilizzate anche per volumi più piccoli, ma bisogna fare attenzione a non avere bolle d'aria.
5. Quantificare i carbossilati nella soluzione eluzionale con il metodo analitico preferito (ad esempio, IC-MS, HPLC). Raccomandiamo la loro separazione tramite IC abbinata al rilevamento MS. In alternativa, la cromatografia liquida ad alte o ultra prestazioni (HPLC o UHPLC) può essere impiegata in combinazione con vari rivelatori, inclusi rilevatori avanzati MS (ad esempio, time-of-flight o Orbitrap) o spettrofotometrici.
6. Al termine della misurazione, i campioni, insieme agli standard, possono essere conservati nel congelatore. Raccomandiamo di conservare tutte le soluzioni contenenti carbossilati a -20 °C per un periodo massimo di 1 anno. Per periodi di conservazione superiori a 1 anno, possono essere preparati nuovi standard e misurati come controllo qualità.
7. Calcola la quantità totale di ogni carbossilato nel volume totale di eluato (cioè volume NaOH + volume di idrogel + acqua aggiunta) e normalizza per peso radicale o area radicale e moltiplica per i fattori di efficienza eluzionale: 0,94 per aconato, 1,00 per citrato, 0,90 per fumarato, 1,02 per lattato, 1,05 per malato, 0,91 per ossalato e 1,00 per succinato (vedi Tabella Supplementare 1). Assicurati che i fattori di diluizione siano considerati se sono stati fatti durante l'eluzione e la misurazione.

5. Mappatura 2D

NOTA: Non esiste un software specifico per creare immagini 2D dei dati di essudazione. La mappatura può essere effettuata con Microsoft Excel e Python.

1. Inserire i dati ottenuti nel passo 4.7 da ogni pezzo di gel nella loro cella corrispondente all'interno della griglia 2D (righe x colonne). La griglia viene generata sopra le foto scattate dalle radici durante il campionamento (vedi passo 4.1).
2. Definire la dimensione delle griglie e verificare che i dati corrispondano.
3. Seleziona la scala dei colori e specifica i codici colori che rappresentano i valori più bassi e più alti.
4. Specifica l'intervallo numerico per la legenda per assicurarti che corrisponda accuratamente alla scala selezionata.
5. Crea una mappa di calore e assicurati che non abbia etichette o linee di griglia. La mappa di calore può essere facilmente creata in R Software utilizzando lo script R di esempio fornito nel File Supplementare 1.
6. Elaborare l'immagine e posizionarla accanto alla fotografia delle radici ottenute durante il campionamento per poter interpretare la distribuzione spaziale dei carbossilati.
   NOTA: Oggi la mappatura può essere eseguita anche utilizzando strumenti di intelligenza artificiale. La procedura è semplice: basta copiare e incollare la griglia numerica da Excel nella chat, poi richiedere una heatmap con le dimensioni desiderate del gel e la scala dei colori per la legenda. Tieni presente che il risultato potrebbe non essere sempre perfetto al primo tentativo, ma ripetere il processo di solito produce risultati accurati. Questo approccio offre il vantaggio di essere notevolmente più veloce rispetto ai metodi manuali.

Results

Il metodo degli idrogel ZrOH è stato inizialmente sviluppato per campionare il citrato dalle radici vegetali coltivate nel terreno ed è stato utilizzato con successo per risolvere la distribuzione spaziale dell'esudazione¹¹. Prima di adottare questo metodo per altri carbossili, abbiamo caratterizzato gli idrogel ZrOH per assicurarci che fossero adatti anche all'uso con altri carbossiliati (vedi Tabella Supplementare 1). Inoltre, abbiamo eluzionato e analizzato idrogel ZrOH carichi e immagazzinati da un esperimento con rhizobox condotto nel 2019. Gli idrogel ZrOH possono occupare il 100% della quantità carica entro 5 ore (~0,2 μmol, 10 mL) per aconato, citrato, fumarato, lattato, malato, ossalato e succinato utilizzando gli stessi parametri di eluzione stabiliti da Tiziani et ^al.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). Gli idrogel ZrOH possono legarsi fino a 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 di carbossilati (vedi Tabella Supplementare 1), molto più elevati rispetto alle concentrazioni (spesso nell'intervallo nmol) solitamente presenti nella rizosfera. Inoltre, gli idrogel ZrOH carichi in carbossili rimangono stabili e possono essere conservati per diverse settimane prima dell'analisi, minimizzando così la degradazione microbica durante e dopo il campionamento.

I risultati della Figura 3 mostrano una visualizzazione 2D della distribuzione spaziale dell'esudazione di citrato lungo una radice a grappolo di una pianta Lupinus albus L (lupino) coltivata in terreno in un suolo carente di P. La mappa comprende 48 misurazioni individuali effettuate su pezzi di gel da 5 x 2 mm, nei quali il gel ZrOH è stato sezionato nell'agosto 2025 dopo il campionamento di citrato nell'agosto 2019. Chiaramente, gli idrogel ZrOH hanno assorbito efficacemente il citrato essudata, con risultati quantificabili anche su un piccolo gel (0,10^{cm 2}), senza la necessità di preconcentrazione dell'eluato. I tassi di esudazione più alti di citrato sono stati riscontrati nelle regioni radicali del grappolo (fino a 2,8 nmol ^cm-2 gel ^h-1), che si traducono in 67,2 nmol ^cm-2 gel al ^giorno-1, mentre i tassi più bassi sono stati osservati solo sui pezzi di gel a contatto con il suolo. Le radici del grappolo variavano in lunghezza da 0,2 mm a 15,6 mm, con una lunghezza totale di 250 mm. Questi risultati confermano l'idoneità degli idrogel al campionamento di carbossili rilasciati dalle radici per 24 ore. Gli idrogel ZrOH sono stati anche in grado di legare altri carbossilati, come lattato, fumarato, malato e ossalato, oltre al citrato (Tabella 1). La rilevazione della maggior parte dei carbossiliati dagli idrogel ZrOH, che sono stati conservati a 4 °C per 6 anni, suggerisce una degradazione minima dei carbossilati. Tuttavia, sono in corso esperimenti per raccogliere informazioni significativamente maggiori sui sette carbossilati testati provenienti da diverse specie vegetali.

Figura 1: Fasi critiche per la preparazione del gel di poliacrilamide. (A) Allineamento dell'assemblaggio della lastra di vetro con uno spostamento di ~1 mm. (B) Colata del gel e (C) distribuzione uniforme della soluzione gelida nella piastra dal centro della placca. (D) Leva sulla lastra di vetro usando una lametta da rasoio dall'angolo. (E) Ammollare i gel per aiutarli a staccarli dalla piastra di vetro. (F) Lavare via il gel in un becher. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Campionamento di essudato radicale da un segmento di sistema radicale vegetale coltivato in rhizobox utilizzando idrogel ZrOH. (A) Aprire la rizobox dopo aver rimosso la piastra frontale e la plastica. (B) Bagnare adeguatamente l'interfaccia suolo-radice usando acqua deionizzata in una bottiglia per lavaggio. (C) Membrana di incisione a traccia nuclepore fissata a un'interfaccia terra-radice umida. (D) Rizobox con idrogel ZrOH applicato nella regione di interesse, coperto con carta plastica per protezione del gel contro la piastra anteriore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Campionamento dell'essudato radicale usando idrogel ZrOH e immagine 2D a scala millimetrica dell'esudazione di citrato. (A) Foto dell'idrogel ZrOH sovrapposto sulla regione radicale di interesse durante il campionamento per generare griglie utilizzate per la mappatura. (B) Immagine 2D a scala millimetrica che mostra la distribuzione del tasso di essudazione del citrato (nmol ^cm–2 gel h^–1) una radice a grappolo bianco di Lupinus albus L. (lupino) cresciuta in un suolo carente di fosforo. Ogni griglia rappresenta un pezzo di gel di 5 x 2 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Impianto	Trattamento	Aconitate	Citrato	Fumarato	Lattato	Malate	Ossalato	Succinato
	mg P kg-1 suolo	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Rice (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabella 1: Tassi di esudazione di aconati, citrato, fumarato, lattato, malato, ossalato e succinato delle piante Lupinus albus L. (lupino) e Oryza sativa L. (riso) coltivate in terreno a 0, 50 e 250 mg di P ^kg-1 in terreno. LOQ è il limite di quantificazione

Tabella supplementare 1: Parametri di eluzione del NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) e capacità dell'idrogel ZrOH per sette carbossili. I dati sono medie ± deviazioni standard della media (n = 4 per l'efficienza dell'eluzione e la capacità dei singoli carbossiliati e n = 40 per la miscela di carbossili). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 1: Rappresentazione schematica della rizobox raccomandata per una irrigazione più facile. La rizobox è composta da una struttura rhizobox dotata di pozzi di acqua equidistanti in fondo e dietro per facilitare una distribuzione uniforme dell'acqua durante l'irrigazione, e di una piastra frontale trasparente rimovibile per monitorare la crescita radicale durante l'esperimento. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Assemblaggio della rizobox e processo di riempimento del suolo. (A) Copri i fori sul retro della struttura della rizobox con del nastro adesivo. (B) Attacca una membrana nuclepora, poi applicate una lamina plastica sul lato anteriore o aperto della struttura della rizobox (assicurandosi che sia abbastanza stretta e piatta). (C) Posiziona la piastra frontale e serra la rizobox. (D) Riempi la rizobox inclinandola verso la parte anteriore in modo che le particelle più fini cadano sulla superficie rimovibile per ottenere una superficie liscia, come nell'immagine. (E) In alternativa, riempire il telaio coperto del rizobox (A) dal lato aperto, livellarlo con la piastra rimovibile e poi coprirlo con membrana nucleoporica, stagnola plastica e la piastra anteriore. (F) Installazione finale del Rhizobox, annaffiata e piantata. Una procedura alternativa di riempimento è mostrata in Wagner et al. (2020). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 1: Il file include dettagli sullo script R usato per generare una heatmap. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il metodo di campionamento carbossilicato descritto qui utilizza idrogel ZrOH, per i quali è fondamentale una corretta preparazione e maneggiazione del gel. Per la manipolazione degli idrogel ZrOH, raccomandiamo di mantenerli umidi con alcune gocce d'acqua di laboratorio. Durante la preparazione, è importante gettare il gel immediatamente dopo aver preparato la miscela gelificata (passo 1.1.3) e assicurarsi che non si formino bolle tra le piastre di vetro. Le bolle situate al centro dell'idrogel ZrOH sono particolarmente critiche, poiché possono interferire con il campionamento. Al contrario, le bolle ai bordi possono essere rimosse ripotando il gel prima dell'applicazione. Inoltre, i carbossiliati rilasciati dalla radice si legano allo ZrOH precipitato negli idrogel, rendendo essenziale una distribuzione uniforme dello Zr durante la precipitazione. Una distribuzione disomogenea dello Zr all'interno del gel può portare a una diffusione laterale dei carbossilati, che distorce la loro distribuzione spaziale e compromette l'affidabilità della localizzazione^{2D 26}. Una distribuzione uniforme dello Zr può essere ottenuta immergendo i gel di poliacrilamide in una soluzione_{ZrOCl 2}·_{8H 2O}per più di 2 ore in un becher più ampio e posizionando meno gel¹² (passo 1.2.3). Inoltre, la distribuzione dello Zr può essere verificata utilizzando una microscopia elettronica a scansione (SEM, S-3400N II, Hitachi, Giappone) come raccomandato da Guan et ^al.14, che hanno sviluppato gli idrogel ZrOH. Tuttavia, il SEM non è fattibile come procedura standard per campioni enormi.

Un altro passo fondamentale riguarda il riempimento del rhizobox, l'applicazione della membrana nuclepore e l'irrigazione prima dell'applicazione del gel per il campionamento carbossiliato. È necessario prestare particolare attenzione nel riempimento e nella gestione di terreni sabbiosi o argillosi pesanti per garantire una superficie uniformemente liscia, essenziale per un corretto contatto con il gel, mantenendo al contempo condizioni ben drenate. Una superficie liscia è essenziale anche per un corretto attacco della membrana nuclepore. È fondamentale stabilire un buon contatto tra la radice e l'idrogel ZrOH assicurando che la membrana del nucleporo adera correttamente alla superficie del terreno con bolle d'aria minime. Prima dell'applicazione del gel ZrOH è inoltre fondamentale saturare correttamente il terreno affinché l'idrogel possa essere fissato saldamente, piatto e umido per preservarne l'integrità durante il campionamento. Durante il taglio del gel per la mappatura carbossilata 2D, ottenere tagli con precisione millimetrica può essere difficile; pertanto, consigliamo di non scendere sotto una risoluzione di 2 x 2 mm. Inoltre, poiché i gel si restringono all'asciugatura, è essenziale mantenerli umidi dopo il campionamento per preservarne l'integrità (passo 3.12). Il metodo attuale è stato adattato da Tiziani et ^al.12 che raccomandavano l'uso di_{NaN 3} come inibitore microbico per prevenire la degradazione dei carbossilati. In questo protocollo, non utilizziamo inibitori microbici, comunemente impiegati per campionare essudati radicali (_{NaN 3} o micropur, un materiale a base di_{AgCl 3})²³, a causa della loro interferenza con i metodi analitici e dei potenziali effetti sul sistema IC-MS.

Ad oggi, il metodo è stato convalidato solo per sette carbossiliati (aconato, citrato, fumarato, lattato, malato, ossalato, succinato), mentre l'essudoma radicale è composto da una miscela complessa di composti (ad esempio, fenoli, amminoacidi, carboidrati e carbossilati). Questi altri composti importanti non sono attualmente considerati nel metodo, né gli idrogel ZrOH sono stati caratterizzati per il loro campionamento. La presenza di altri ossianioni nel terreno (come fosfato, nitrato) può influenzare l'assorbimento, la capacità e l'eluzione dei carbossilati, così come la quantificazione dei carbossiliati su IC o HPLC. Inoltre, campionare sistemi radicali interi molto grandi da piante più grandi (ad esempio alberi o arbusti) può essere molto difficile a causa delle difficoltà nella produzione di idrogel ZrOH molto grandi (>30 cm). Tuttavia, questo è un problema in tutte le tecniche attuali di campionamento^{degli essudati.} Un'ulteriore limitazione è l'uso delle rizobox. Sebbene la crescita delle piante nelle rizobox sia molto più realistica rispetto ai sistemi^{idroponici 8}, rimane un impianto artificiale, con spazio tridimensionale limitato per lo sviluppo^{radicale 33}. Inoltre, il campionamento avviene su una superficie 2D, il che teoricamente potrebbe portare alla perdita di carbossilati emessi in altre direzioni non a contatto con i gel. Tuttavia, questa limitazione potrebbe essere mitigata dalla diffusione, da una maggiore capacità di legame degli idrogel ZrOH per i carbossiliati e dall'alto contenuto d'acqua del suolo della rizosfera durante l'applicazione. Tuttavia, sono necessarie ulteriori validazioni per determinare questi aspetti.

Il metodo idrogel ZrOH per campionare i carbossiliati rilasciati dalle radici offre diversi vantaggi rispetto ai metodi comunemente usati (cioè approccioli ibridi suolo-idroponica e idroponici). Questo approccio innovativo consente il campionamento in situ di carbossilati da sistemi radicali indisturbati nel suolo, campionamento a risoluzione temporale (Santner, Mühlbacher et al., dati non pubblicati) e mappatura 2D in scala mm. Inoltre, gli idrogel ZrOH possono essere impiegati sulle radici per almeno 24 ore^{e 12}. Inoltre, dovrebbe essere possibile campionare ripetutamente lo stesso segmento radicale per periodi più lunghi con risoluzione temporale. Questo metodo è molto meglio sviluppato e caratterizzato rispetto a metodi simili, come l'applicazione di carta^{filtrante 8}. È possibile un campionamento prolungato con gli idrogel ZrOH grazie all'elevata capacità di gel per i carbossiliati, ad esempio il minimo è di 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² gel per il malato fino al massimo di 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² per il succinato a pH 4,00 con un totale di 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² quando i carbossilati vengono miscelati (vedi Tabella Supplementare 1). Omettere la fase di lavaggio delle radici (che tipicamente richiede 20–30 minuti per pianta) nel metodo ibrido suolo-idroponica riduce significativamente i danni al sistema radicale e il biasing associato, ottenendo dati più realistici e rappresentativi.

In particolare, gli idrogel ZrOH caricati non richiedono condizioni particolari di conservazione, solo refrigerazione, e nelle nostre applicazioni finora non abbiamo riscontrato alcuna preconcentrazione necessaria dopo l'eluzione. Gli idrogel ZrOH legano anche altri anioni, che vengono eluiti nelle stesse condizioni e possono essere analizzati tramite IC^14,34. Questo permette di collegare l'esudazione carbossilata alla distribuzione spaziale dei nutrienti nella^{rizosfera 29}.

In conclusione, questo nuovo approccio di campionamento dei carbossiliati rilasciati dalle radici è un passo fondamentale per la ricerca sulla rizosfera. Poiché i carbossilati svolgono un ruolo cruciale nella mobilitazione e acquisizione di nutrienti vegetali (ad esempio, P, Fe)^35,36, nonché nel reclutamento di microrganismi benefici, questo metodo potrebbe essere utilizzato per selezionare varietà per i tratti radicali e l'allevamento genetico delle piante.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanolo	Sigma-Aldrich		70%
Acido ossalico	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
acido trans-aconitico	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Ottaidrato di ossido di dicloruro di zirconio (ZrOCl2 & times 8H2O, 98%)	Thermo Scientific	A12342.22	98%
Acido citrico	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Nitrato di sodio	VWR Chemicals	Numero di lotto: 19H224150	100%
Acido azorico (HNO3)	Sigma-Aldrich	CAS-No: 7697-37-2	>65% per analisi EMSURE® Reag. Ph Eur, ISO
Acido fumarico	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Persolfato di ammonio (APS_(NH4)2S2O8)	Thermo Scientific	201531000	≥ 98,0%, extra puro, per elettroforesi
Acido succenico	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
Tampone 2-(N-morfolino)-etanosolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Reticolatore	DGT Research Ltd (Lancaster, Regno Unito)	na	2%, derivata dell'agarosio
Scuottore a piastra o orizzontale			Any
Cromatografia ionica o IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	Qualsiasi cromatografia liquida ad alte o ultra prestazioni (HPLC o UHPLC) può essere impiegata in combinazione con vari rivelatori, inclusi rilevatori MS avanzati (ad esempio, time-of-flight o Orbitrap) o spettrofotometrici
Misuratore di pH			Può essere utilizzato qualsiasi elettrodo pH da laboratorio
Forno	Raccoglitore	na	Può essere usato qualsiasi forno piccolo che mantenga una certa temperatura, preferibilmente uno più piccolo.
Nylon filters_13 mm 0,45 & micro; M	Tecnologia di filtri GVS	Lotto n. 7135431	Si possono usare anche filtri in nylon più grandi, ma si preferiscono quelli più piccoli poiché il volume eluato è piccolo.
Solfato di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	Può essere utilizzato anche CaSO4.
Soluzione di acrilammide, 40%	G-Bioscienze	786-508	Non usare una soluzione di acrilammide mescolata con   Bis-acrilammide. Composto tossico che va maneggiato con attenzione in una cappa fumaria.
Rhizobox	https://www.rhizosphere.com/	na	I nostri rizobox sono realizzati su misura in base al design del Rhizosphere.com
Kit per fiale in polipropilene, 1,5 mL	Thermo Scientific	79812	Si preferiscono le fiale IC di plastica perché possono essere congelate senza rompersi. 330 & micro; L può essere usata, ma bisogna fare attenzione a non avere bolle d'aria
Acido cis-aconitico	Thermo Scientific	A16010.06	Tech. 85%
N,N,N',N'- tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma-Aldrich	Lotto n. BCBN1173V	Composto tossico che va maneggiato con attenzione
Fiale PP da 250 mL	Sarstedt	Lotto n.2406082
Carta stagnola	Supermercato locale	na
Beakers_1 L/ 2 L
Morsetti	Magazzino locale	na
Piastra di vetro (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Magazzino locale	na
L-(-)-Acido malico	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Norma di lattato per la CI	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Banco di flusso laminare
L-Acido lattico anidro	Thermo Scientific	L13242.14
Nuclepore Track-etch Membrane_0.2 & micro; m	Cytiva	Lotto n.: A29983896
Carta stagnola/sacchetti di plastica	Magazzino locale	na
Pinzette di plastica	Semadeni	602
Piastra in plexiglass	Magazzino locale	na
Fiale PP da 30 mL	Aptaca spa	Lotto n. 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Lamette di rasoio	Magazzino locale	na
Sovrano	Libreria locale	na
Ipoclorito di sodio (NaClO)	Reagenti CARLO ERBA	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Lotto n. 22A17C8
Nastro isolante in vinile	Magazzino locale	na