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Articolo metodologico

Recupero postoperatorio e stabilità della registrazione cronica di elettroencefalografia intracranica multielettrodo nei ratti

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DOI:

10.3791/69937

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24 aprile 2026

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1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea un quadro standardizzato per la valutazione post-chirurgica dopo l'impianto cronico di EEG multi-elettrodo nei ratti, inclusi il monitoraggio sequenziale della qualità del segnale, il recupero comportamentale e i marcatori neuroinfiammatori per determinare l'avvio appropriato di registrazioni stabili a lungo termine.

Abstract

L'impianto intracranico multi-elettrodo consente l'acquisizione simultanea di segnali neurali attraverso le regioni cerebrali ma introduce perturbazioni post-chirurgiche che possono influenzare la qualità dei dati e il tempismo sperimentale. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro standardizzato per l'impianto cronico di elettrodi EEG intracranico multi-sito e una valutazione strutturata post-impianto nei ratti di Sprague–Dawley. Gli elettrodi in filo di tungsteno vengono impiantati stereotaticamente in tre siti intracranici predefiniti (corteccia cingolata anteriore, ippocampo CA1 ed endorhinale) utilizzando una strategia chirurgica progettata per minimizzare la perturbazione tissutale.

Dopo l'impianto, il protocollo specifica la valutazione longitudinale in cinque domini: accuratezza della localizzazione degli elettrodi, integrità del potenziale locale del campo, comportamento legato al dolore, comportamento di alimentazione e marcatori neuroinfiammatori. Le valutazioni elettrofisiologiche e comportamentali vengono condotte in momenti predefiniti postoperatori (giorni basali e postoperatori 1, 4, 7, 10 e 13) per supportare un monitoraggio costante degli effetti post-operatori precoci (n = 3). Le analisi istologiche vengono utilizzate per caratterizzare le risposte locali dei tessuti alla fine dello studio (n = 3 per punto temporale).

Sono forniti criteri operativi e intervalli di valutazione per guidare le decisioni riguardanti la prontezza sperimentale e l'inizio delle registrazioni a lungo termine. Questo protocollo fornisce un approccio strutturato al monitoraggio post-impianto e informa il momento appropriato degli esperimenti neurofisiologici a valle.

Introduzione

L'elettroencefalografia intracranica (EEG) consente una misurazione ad alta risoluzione dell'attività neurale registrando direttamente i segnali dal tessutocerebrale 1,2, offrendo vantaggi nella specificità spaziale e nella fedeltà del segnale rispetto agli approcci EEG del cuoiocapelluto 3. Le registrazioni intracraniche a più regioni offrono intuizioni sulle interazioni a livello di rete, ampiamente utilizzate per indagare la dinamica neurale sottostante alla cognizione e alle malattie e sono comunemente implementate nei modelli di roditori per studi meccanicistici elongitudinali 4,5.

Gli elettrodi a filo di tungsteno sono comunemente impiegati per registrazioni croniche a causa della loro stabilità meccanica ebiocompatibilità 6,7,8. Tuttavia, l'impianto richiede interventi chirurgici invasivi che possono temporaneamente compromettere la fisiologia neurale, l'integrità dei tessuti e il comportamentoanimale 9,10,11. Sfide come stress chirurgico acuto, infiammazione locale, risposte gliali e cambiamenti nel comportamento alimentare o nocicettivo possono influenzare la qualità del segnale e l'interpretazione sperimentale durante il primo periodopost-impianto 12,13,14. Tuttavia, questo periodo di recupero rimane in gran parte empirico, con finestre di recupero segnalate che variano da 5 a 7giorni 15,16. I ritardi prolungati, al contrario, possono introdurre ulteriori confondimenti legati al rimodellamento tissutale o allo spostamento dielettrodi 17.

Nonostante l'uso diffuso dell'EEG intracranico cronico, non esiste un quadro standardizzato per il monitoraggio post-impianto che integri valutazioni elettrofisiologiche, comportamentali, infiammatorie e istologiche per informare i tempi sperimentali. Pertanto, il protocollo attuale affronta questa lacuna delineando un approccio strutturato per valutare lo stato post-impianto in un modello cronico di impianto multi-elettrodo intracranico in ratti Sprague–Dawley (SD) anestetizzati (6 settimane). Utilizzando elettrodi di filo di tungsteno impiantati nella corteccia cingolata anteriore (Cg1), nell'ippocampo CA1 e nella corteccia entorinale (EC), il protocollo specifica la valutazione longitudinale della stabilità degli elettrodi, delle caratteristiche del segnale EEG, degli indicatori comportamentali e dei marcatori infiammatori su un periodo di due settimane. Sebbene le valutazioni vengano eseguite sotto anestesia generale per comodità pratica, questo approccio non danneggia l'obiettivo principale di stabilire un quadro per l'impianto e la stabilità degli elettrodi. Questo protocollo è pensato per guidare il monitoraggio post-chirurgico e supportare la determinazione coerente dei momenti opportuni per avviare studi neurofisiologici a valle.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali della Capital Medical University (ID Approvazione: AEEI-2024-391).

1. Preparazione degli animali

  1. Procurarsi maschi di ratti SD di 6 settimane (peso corporeo 220–230 g). Alloggiare gli animali in un ambiente specifico privo di patogeni (24 ± 2 °C, 50 ± 10% di umidità, 12 ore di ciclo chiaro/buio). Fornire cibo e acqua ad libitum. Acclimatare i ratti per 7 giorni prima dell'intervento.
  2. Dopo l'impianto dell'elettrodo, i ratti domestici singolarmente nelle stesse condizioni ambientali per prevenire danni al capostadio.
    NOTA: Il diagramma di flusso dello studio e le corrispondenti misurazioni sono presentati nella Figura 1A. Reagenti e attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

2. Chirurgia di impianto multielettrodo

  1. Anestetizzare i ratti con isoflurano (3–4% di induzione, 2% di mantenimento) somministrato con ossigeno a 2 L/min.
  2. Inserire il ratto in un telaio stereotassico e mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando una borsa riscaldante termostatica. Applicare unguenti oftalmici di eritromicina per prevenire l'essiccazione corneale.
  3. Rasi il cuoio capelluto e disinfetta con una soluzione di iodoforo allo 0,5%.
  4. Eseguire un'incisione al cuoio capelluto a metà linea (1 × 2 cm) per esporre il cranio e rimuovere delicatamente il periosto usando cotton cotton fighets sterili.
  5. Preparazione e perforazione del cranio
    1. Identificare bregma e lambda e livellare il cranio sia nei piani anteriore-posteriore che mediale-laterale.
    2. Forare i fori delle bave (diametro ≤2 mm) alle coordinate del bersaglio utilizzando un trapano dentale a bassa velocità con irrigazione salina intermittente.
  6. Preparazione e inserimento degli elettrodi
    1. Utilizzare elettrodi di filo di tungsteno isolati da poliimide (diametro del fusto: 300 μm) con una punta esposta di 4–8 mm (estremità a filo). Misurare l'impedenza degli elettrodi (| Z|) a 1 kHz; i valori accettabili variano da 7–10 kΩ con un angolo di fase da 1°–2°.
    2. Inserire lentamente elettrodi nelle seguenti regioni: Cg1 (corteccia cingolata anteriore): AP +1,2 mm, ML −0,2 mm, DV −2,4 mm; CA1 (ippocampo): AP −3,3 mm, ML −1,8 mm, DV −3,0 mm; EC (corteccia entorinale): AP −6,7 mm, ML −4,0 mm, DV −8,0 mm.
    3. Impiantare una vite cranica in acciaio inossidabile sopra la regione controlaterale CA1 e usarla come elettrodo di massa.
  7. Fissazione e chiusura dell'elettrodo
    1. Verificare la corretta profondità e puntamento degli elettrodi utilizzando coordinate stereotassiche durante l'impianto; confermare la localizzazione degli elettrodi a posteriori tramite l'identificazione istologica delle tracce degli elettrodi.
    2. Fissare elettrodi e viti usando resina dentale (polimerizzare 30–60 secondi per strato).
    3. Collega i cavi degli elettrodi a un connettore headstage e sutura la pelle circostante.
  8. Registrare l'attività EEG di base per 30 minuti nel corrispondente momento (Figura 1A) mantenendo l'anestesia.

3. Cure postoperatorie e gestione

  1. Lascia i ratti recuperare su un tappetino riscaldante fino a quando non sono completamente deambulativi.
  2. I ratti domestici sono sotto temperatura e umidità controllate con lenzuola morbida e accesso ad libitum a cibo e acqua per ridurre lo stress.
  3. Ispeziona quotidianamente i siti dell'incisione, la stabilità degli elettrodi e l'integrità della testa di testa.
  4. Gli animali domestici individualmente, fornire cura quotidiana delle ferite (soluzione iodoforica allo 0,5%) e monitorare il benessere senza agenti farmacologici per evitare effetti di confusione, in linea con studiprecedenti 6,18.

4. Registrazione EEG longitudinale

  1. Eseguire registrazioni EEG nei giorni 1, 4, 7, 10 e 13 dopo l'impianto.
  2. Anestetizzare i ratti con isoflurano (induzione 3–4%, mantenimento 1,5%).
  3. Stabilizzare i cavi di registrazione per minimizzare artefatti di movimento e rumore elettromagnetico.
  4. Registrare l'EEG per 30 minuti a partire dalle 9:00 per controllare la variabilità circadiana.
  5. Utilizzare i seguenti parametri di acquisizione: frequenza di campionamento: 1.000 Hz; filtro passa-banda hardware: 0,5–40 Hz; guadagno: 8–10. Eseguire filtraggio aggiuntivo e rifiuto di artefatti offline.
  6. I segnali EEG accettabili mostrano basi stabili, rumore o deriva minimi e contenuti di ampiezza e frequenza fisiologicamente plausibili; escludono registrazioni che non soddisfano questi criteri.

5. Analisi del segnale EEG

  1. Analizza i segnali EEG utilizzando il software di riferimento.
  2. Ispezionare visivamente i segnali e rimuovere segmenti con movimento o artefatti elettrici.
  3. Calcola la densità spettrale di potenza (PSD) usando FFT (funzione pwelch).
  4. Quantificare l'attività oscillatoria calcolando l'area sotto la curva PSD (AUCpsd) per bande di frequenza predefinite.
  5. Calcola il rapporto segnale-rumore (SNR) come il rapporto tra la potenza nella banda del segnale target (0,5–40 Hz) e la banda del rumore di fondo (40–80 Hz).
    NOTA: I segnali stabili mostrano profili PSD coerenti su giorni di registrazione consecutivi.

6. Valutazione del dolore

  1. Valutare il dolore utilizzando la Rat Grimace Scale19,20 un giorno prima dell'intervento (base operativa) e in tutti i giorni di registrazione.
  2. Usa una camera di osservazione (25 cm × 15 cm × 15 cm) e posiziona la telecamera nell'angolo in alto a sinistra con un angolo di 45°.
  3. Cattura immagini facciali, randomizza l'ordine delle immagini e segna il restringimento orbitale, l'appiattimento nasi/guance, i cambiamenti dei baffi e la posizione dell'orecchio (scala 0–2).
  4. Somma dei punteggi per generare un punteggio totale del dolore per animale per ogni momento temporale.

7. Comportamento alimentare e peso corporeo

  1. Pesa i ratti e misura l'assunzione di cibo ogni giorno. Calcola l'assunzione sottraendo il cibo rimanente dal cibo prepesato dopo 24 ore.
  2. Registrare il comportamento dei ratti in modo continuo per 24 ore usando un sistema di registrazione video. Analizzare il comportamento alimentare offline da parte di sperimentatori accecati alle condizioni sperimentali.
  3. Monitorare l'alimentazione continuamente. Definire un episodio di alimentazione come ≥1 evento che dura 5 s–15 min21.
  4. Calcolare l'apporto aggiustato per il peso corporeo (g × 100/g peso corporeo); l'assunzione media per pasto (g/numero di eventi alimentari); e il tasso di assunzione (g/durata totale dell'alimentazione in min).

8. Valutazione della neuroinfiammazione

  1. Eutanasiare i ratti con un'overdose di isoflurano seguita dalla decapitazione.
  2. Raccogliere tessuto cerebrale dagli emisferi impiantati al basale e ai giorni postoperatori 1, 4, 7, 10 e 13 (n = 3 per ogni punto temporale).
  3. Western blotting
    1. Estrarre la proteina totale dal tessuto cerebrale e quantificare la concentrazione proteica utilizzando un saggio di acido bicinconinico (BCA). Regolare tutti i campioni a una concentrazione finale di 2 μg/μL e denaturare a 100 °C per 5 minuti.
    2. Separare le proteine per il 10% di SDS-PAGE a 120 V per 90 minuti, caricando 20 μg di proteine per corsia.
    3. Trasferire proteine su una membrana PVDF a 300 mA per 1 ora.
    4. Bloccare membrane e incubare durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) e l'interleucina-6 (IL-6) (1:1.000).
    5. Incubare con anticorpi secondari coniugati con HRP (1:20.000, 2 h, temperatura ambiente).
    6. Visualizza le bande usando ECL e immagini con un sistema di imaging chemiluminescenza usando la modalità di esposizione automatica.
    7. Esegui la densitometria usando ImageJ.

9. Sicurezza e smaltimento dei rifiuti

  1. Maneggiare l'isoflurano utilizzando un sistema attivo di recupero della mano.
  2. Smaltire i tessuti pungenti e i tessuti biologici in contenitori designati per i rischi biologici.
  3. Smaltire i reagenti chimici secondo le normative di sicurezza istituzionale.

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Risultati

Tutti i 21 ratti SD hanno tollerato l'impianto di elettrodi intracranici e completato il protocollo dello studio. Misurazioni longitudinali (EEG, peso corporeo, comportamento alimentare e punteggi del dolore) sono state raccolte dagli stessi animali nei momenti temporali (n = 3), mentre le valutazioni neuroinfiammatorie sono state misure terminali in ogni momento (n = 3 ratti al giorno: base, 1, 4, 7, 10, 13). I dati sono stati valutati per la normalità tramite test di Shapiro-Wilk. I da...

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Discussione

L'impianto cronico di elettrodi intracranici per il monitoraggio EEG nei roditori rimane una tecnica fondamentale per studiare la dinamica neurale ad alta risoluzione temporale. Stabilire una finestra di monitoraggio postoperatorio e recupero adeguata è fondamentale per garantire sia l'affidabilità dei segnali sia il benessere animale. Questo studio fornisce un quadro strutturato per valutare la stabilità elettrofisiologica, gli esiti comportamentali e le risposte infiammatorie dopo l'im...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto Excellent Young Talents della Capital Medical University (A2308).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sistema attivo di scavatura isofluoranoRDWR510-31-6
AnimaliFiume Charles
Kit per il test BCASolarbioPC0020
Sistema di imaging ChemiDocBio-Rad17001401
Resina dentaleVerticeXG473P03
Reagente di rilevamento ECLSolarbioPE0010
Pomata oculare con eritromicinaRenhe1.00E+11
Anticorpo secondario anti-coniglio di capraProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0GraphPad SoftwareSoftware per l'analisi statistica
Amplificatore headstageBIOPAC Systems IncEEG100C
Cuscina riscaldanteTecnologia YuYanS-100
ImageJIstituti Nazionali di SaluteSoftware di analisi delle immagini
Anticorpo policlonale IL-6Proteintech21865-1-AP
IodoforoCleanboom430-DFXDY100
IsofluranoRWDR510 e ndash; 31
Dispositivo di registrazione neuro con NeuroExplorer (v 5.012)PlexonOPX-A1600-128-16CSoftware per l'analisi dei dati elettrofisiologici
Membrana PVDFCytivaRPN303F
Sistema SDS-PAGEBio-Rad1658004
Apparecchiatura stereotassicaTecnologia scientifica ZhongShiZS-PDC
TNF-α Anticorpo policlonaleProteintech17590-1-AP
Apparecchiatura di trasferimentoBio-Rad1703937
Filo di tungstenoSistemi A-M785500
Sistema di registrazione videoBasleracA1920
Anticorpo monoclonale β-actinProteintech2D4H5

Riferimenti

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