Method Article

Impatto dei diversi metodi di estrazione sui profili di bioattività in vitro di Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bioattività in vitro degli estratti di Terfezia claveryi dipendeva dal metodo di estrazione biofisica e dalla polarità del solvente. L'estratto acquoso dall'estrazione assistita dalla macerazione (MAE) ha mostrato la più forte attività antiossidante, mentre l'estratto di estrazione Soxhlet (SE) ha indotto una maggiore citotossicità nelle cellule SH-SY5Y. Questi risultati dimostrano differenze chiare dipendenti dal metodo nella bioattività in vitro degli estratti di Terfezia claveryi.

Abstract

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Terfezia claveryi è un tartufo del deserto commestibile tradizionalmente consumato nelle regioni aride. Negli ultimi anni, ha suscitato un crescente interesse scientifico grazie alle sue potenziali proprietà antiossidanti, antimicrobiche e terapeutiche, suggerendo possibili applicazioni nei campi alimentari e sanitari. Tuttavia, nonostante le crescenti evidenze del suo potenziale biologico, l'influenza delle diverse strategie di estrazione sul recupero dei composti bioattivi e il profilo di bioattività in vitro risultante di Terfezia claveryi non è ancora stata chiarita in letteratura. In questo studio è stata valutata la bioattività in vitro degli estratti di Terfezia claveryi ottenuti utilizzando diversi metodi di estrazione e solventi con polarità variabile. È stata determinata la resa di estrazione e gli estratti ottenuti sono stati valutati per attività antiossidanti, antimicrobiche, antibiofilm e citotossici utilizzando sistemi di test consolidati. La capacità antiossidante è stata misurata utilizzando test 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico) (ABTS) e il potere antiossidante ferrico riducente (FRAP), mentre gli effetti citotossici sono stati studiati nelle cellule neuroblastoma SH-SY5Y. La resa di estrazione variava sia in base al metodo che alla polarità del solvente, con la resa massima ottenuta dall'estratto acquoso preparato con il metodo dell'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) (18,40%). È stato stabilito che l'attività antiossidante mostrava differenze significative a seconda del metodo di estrazione, e gli estratti acquosi ottenuti con il metodo di estrazione assistita dalla macerazione (MAE) hanno mostrato un profilo ricco di composti fenolici insieme alla più forte capacità di recupero radicali. L'analisi LC-MS/MS di questo estratto ha rivelato la presenza di nove composti fenolici; l'acido chinico e l'acido clorogenico sono stati identificati come componenti dominanti. Al contrario, estratti derivati da Soxhlet hanno indotto effetti citotossici maggiori nelle cellule SH-SY5Y. Le risposte antimicrobiche e antibiofilm hanno mostrato variazioni relativamente limitate tra i metodi di estrazione, indicando una dipendenza più debole dalla strategia di estrazione per queste attività. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il metodo di estrazione biofisica e la selezione del solvente sono fattori determinanti fondamentali del profilo di bioattività in vitro degli estratti di Terfezia claveryi , con effetti marcati osservati per attività antiossidanti e citotossiche.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'uso di varie specie di funghi per migliorare la salute e prevenire e trattare malattie risale ai tempi antichi 1,2,3. I macrofunghi sono generalmente classificati in due gruppi: epigeosi (funghi) e ipogeo (tartufi)4. Conosciuta come tartufo del deserto, Terfezia claveryi (T. claveryi) è una specie di tartufo di fama mondiale e commestibile appartenente al genere Terfezia5. T. claveryi è comunemente distribuito in regioni aride e semi-aride dove le specie di Helianthemum sonoprevalenti 6,7,8,9,10,11. Negli ultimi anni, il carico globale delle malattie croniche come il cancro e i disturbi neurodegenerativi è aumentato significativamente, evidenziando l'urgente necessità di nuovi agenti terapeutici sicuri ed efficaci. Secondo i rapporti sanitari globali, il cancro rimane una delle principali cause di morte a livello mondiale, mentre le malattie neurodegenerative continuano ad aumentare insieme all'invecchiamento della popolazione. Data questa crescente questione di salute pubblica, l'indagine sui prodotti naturali derivati da funghi e piante medicinali come potenziali fonti di composti bioattivi è diventata una priorità diricerca importante 12.

Parallelamente, la rapida emergere della resistenza agli antimicrobici rappresenta un'altra minaccia importante per la salute globale. La resistenza ai farmaci ha ridotto significativamente l'efficacia degli antibiotici tradizionali, creando un'urgente necessità di strategie antimicrobiche alternative13. I metaboliti secondari derivati da fonti naturali, in particolare composti fenolici e polifenolici, stanno attirando un interesse crescente grazie ai loro diversi meccanismi antimicrobici e alla bassa tendenza a sviluppare resistenza14. Lo stress ossidativo è un fattore meccanicistico fondamentale alla base di molte malattie croniche, tra cui il cancro, i disturbi neurodegenerativi e le sindromi metaboliche. Una produzione eccessiva di specie reattive dell'ossigeno (ROS) può infine compromettere l'omeostasi cellulare causando danni al DNA, perossidazione lipidica e ossidazione delle proteine. In questo contesto, gli antiossidanti naturali che possono assorbire i radicali liberi e regolare l'equilibrio redox sono considerati agenti promettenti per mitigare i danni ossidatori e la progressione dellamalattia 15.

I tartufi sono ricchi di acidi grassi insaturi, proteine, minerali, vitamine, amminoacidi, fenolici e polifenoli, componenti associati a proprietà antimicrobiche, antiossidanti eanticancerogene 16,17,18,19,20,21,22,23,24. La loro capacità antiossidante è stata collegata alla loro efficacia nell'assorbire radicaliliberi 25,26,27. Tra le specie di tartufo, T. claveryi è particolarmente degna di nota per la sua struttura commestibile, il valore economico regionale e la ricchezza riportata di compostifenolici 23. Nonostante le evidenze emergenti riguardo al suo consumo tradizionale e alla sua attività biologica, studi approfonditi che indagano su come le strategie di estrazione influenzino la sua composizione chimica e gli effetti biologici rimangono limitati.

Il recupero di composti biologicamente attivi dai tartufi è fortemente influenzato dai parametri di estrazione, inclusa la tecnica applicata e la polarità del solvente. I metodi di estrazione biofisica come l'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE), l'estrazione assistita da macerazione (MAE) e l'estrazione Soxhlet (SE) mostrano differenze significative in termini di input energetico, efficienza di estrazione e selettività per i compostipolari 28. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche si è basata su un singolo metodo di estrazione o su sistemi solventi limitati, e gli studi che affrontano in modo comparativo gli effetti di questi metodi sul profilo di attività biologica in vitro di T. claveryi sono limitati. Pertanto, questo studio confronta sistematicamente molteplici metodi di estrazione biofisica utilizzando solventi di polarità variabile per valutare le attività biologiche in vitro degli estratti di T. claveryi . Si ipotizzava che il metodo di estrazione e la polarità del solvente avrebbero portato a differenze dipendenti dal metodo nelle attività biologiche. Di conseguenza, gli obiettivi dello studio sono: (i) confrontare le rese di estrazione tra diversi metodi e solventi, (ii) valutare la variazione dipendente dal metodo nelle attività antiossidanti e citotossiche, e (iii) esaminare le risposte antimicrobiche e antibiofilm, considerando la loro sensibilità alla strategia di estrazione.

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Protocol

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NOTA: Il flusso di lavoro sperimentale complessivo per la preparazione e l'analisi degli estratti di T. claveryi è riassunto schematicamente nella Figura 1. Tutti i materiali utilizzati nello studio sono descritti nella Tabella dei Materiali.

1. Autenticazione e preparazione dei materiali fungini

  1. Raccolta e lavorazione del materiale
    NOTA: Tartufi T. claveryi freschi sono stati raccolti nel maggio 2023 da steppe e aree sabbiose, non coltivate (non agricole) nella provincia di Kırsehir, Anatolia centrale, Turchia. Il campionamento è stato effettuato in tre località distinte: Villaggio Dedeli (38°54′15,8" N, 34°06′40,3" E; ~1050 m sul livello del mare), Villaggio Buyukkayapa (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m sul livello del mare) e Villaggio di Akcaagıl (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m sul livello del mare). I siti di raccolta sono caratterizzati da un clima continentale semi-arido, con inverni freddi, estati calde e secche, e una precipitazione media annua di circa 380–420 mm. Tutti i campioni sono stati raccolti durante la stagione naturale della fruttificazione in aree senza attività agricola recente per minimizzare la potenziale contaminazione antropica.
    1. Seleziona tartufi puliti e non danneggiati, sbucciali e lavali tre volte con acqua distillata.
    2. Taglia i campioni in piccoli pezzi e asciuga all'ombra fino a raggiungere un peso costante (circa 20 giorni).
    3. Polverizza il materiale essiccato usando un macinacaffè meccanico e passa attraverso un setaccio da 328 micron (50 rete).
    4. Conservare i campioni processati in sacchetti zip-lock in un ambiente fresco, asciutto e buio a temperatura ambiente fino a ulteriori analisi.
  2. Identificazione molecolare di T. claveryi
    1. Isolare DNA genomico da campioni secchi di T. claveryi per l'identificazione molecolare.
    2. Valuta la quantità e la purezza del DNA spettrofotometricamente.
    3. Eseguire l'identificazione della specie tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) amplificando la regione dello spaziale interno trascritto (ITS) utilizzando i primer universali ITS1 (5′-TCCGTGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Risolvere i prodotti di amplificazione PCR tramite elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5% preparato in 1x tampone TAE e visualizzato sotto illuminazione UV dopo la colorazione con bromuro di etidio.
    5. Purificare i prodotti PCR a banda singola secondo le istruzioni delproduttore 29. Soggetta gli amplicon purificati al sequenziamento Sanger.
    6. Assemblare le letture di sequenza dirette e inverse in sequenze di consenso utilizzando l'algoritmo CAP (contig assembly programme).
    7. L'identità della specie è stata confermata confrontando la sequenza ITS consensuale con le sequenze di riferimento disponibili nei database pubblici.
      NOTA: Un campione voucher di T. claveryi è stato conservato nella collezione di laboratorio per riferimento futuro. L'identificazione della specie è stata confermata tramite analisi molecolare basata su ITS (Supplementary File 1).

2. Preparazione ed estrazione di materiali fungini

  1. Preparazione degli estratti di T. claveryi
    1. Pesa circa 30 g di polvere di T. claveryi essiccata.
    2. Aggiungere 150 mL di solvente (metanolo, acetone, n-esano, acetato di etil o acqua distillata) per mantenere un rapporto solido-liquido costante in tutti i metodi di estrazione.
    3. Utilizzare solventi di grado analitico per tutte le procedure di estrazione.
    4. Filtrare ogni estratto a pressione ridotta usando carta filtrante di qualità.
    5. Concentrare i filtrati a pressione ridotta a 30–45 °C utilizzando un evaporatore rotante.
    6. Liofilizzare (liofilizzare) gli estratti concentrati fino a quando non si raggiunge la completa rimozione del solvente.
    7. Conservare gli estratti di greggio essiccati a −20 °C fino a ulteriori analisi.
      NOTA: Applicare passaggi identici di elaborazione post-estrazione a tutti i campioni per garantire coerenza metodologica e comparabilità.
  2. Metodi di estrazione biofisica
    1. Estrazione assistita dalla macerazione (MAE)
      1. Metti il campione in polvere di T. claveryi in un contenitore di estrazione chiuso.
      2. Aggiungi il solvente selezionato mantenendo un rapporto solvente-solido costante.
      3. Incubare la miscela a temperatura ambiente in condizioni di buio per 72 ore.
      4. Tieni i contenitori chiusi per evitare l'evaporazione del solvente.
      5. Non applicare agitazione esterna durante il periodo di macerazione.
      6. Lascia che la miscela si depositi alla fine del periodo di estrazione.
      7. Filtra l'estratto prima di ulteriori lavorazioni.
    2. Estrazione Soxhlet (SE)
      NOTA: Assicurati una corretta circolazione dell'acqua nel condensatore ed evita il riscaldamento a secco durante il reflusso.
      1. Metti il campione in polvere in un ditale di estrazione di cellulosa.
      2. Posiziona il ditale all'interno della camera di estrazione Soxhlet collegata a una fiaschetta a fondo rotondo.
      3. Aggiungi il solvente selezionato alla fiaschetta mantenendo un rapporto solvente-solido costante.
      4. Riscalda il solvente fino a farlo reflussare usando un mantello riscaldante controllato termostaticamente.
      5. Mantieni l'estrazione continua per 24 ore.
      6. Mantenere la temperatura di estrazione al punto di ebollizione di ciascun solvente (n-esano: 68,7 °C; acetato di etile: 77,1 °C; metanolo: 64,7 °C; acetone: 56 °C; acqua distillata: 100 °C).
    3. Estrazione assistita da ultrasuoni (UAE)
      NOTA: Monitorare la temperatura continuamente per evitare il surriscaldamento durante la sonicazione.
      1. Inserire il campione in polvere di T. claveryi nel recipiente di estrazione.
      2. Aggiungi il solvente selezionato mantenendo un rapporto solvente-solido costante.
      3. Sonicare la miscela a una frequenza fissa di 35 kHz e a una potenza di uscita di 520 W per 25 minuti.
      4. Mantieni la temperatura di estrazione a circa 30 °C.
      5. Aggiungere ghiaccio a intervalli di 5 minuti per mantenere la temperatura entro 25–28 °C durante la sonicazione.
  3. Efficienza di estrazione
    1. Pesa il materiale fungino essiccato (Wp) prima dell'estrazione.
    2. Pesa l'estratto greggio essiccato (We estensione) dopo aver rimosso completamente il solvente.
    3. Calcola l'efficienza di estrazione usando l'Equazione (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Ri-sciogliere ogni estratto di greggio essiccato nel rispettivo solvente per preparare una soluzione di stocco a una concentrazione standardizzata di 10 mg/mL.
    5. Prepara le soluzioni di stocco frescamente prima di ogni esperimento di bioattività in vitro .
      NOTA: Standardizzare tutte le concentrazioni degli estratti per garantire dosaggi comparabili tra i successivi saggi di bioattività.

3. Determinazione dell'attività antiossidante

  1. Esegui analisi dell'attività antiossidante utilizzando i saghi DPPH, ABTS e FRAP.
  2. Prepara cinque diverse concentrazioni di estratto che vanno da 0,25 a 1,0 mg/mL da soluzioni di stock appena preparate.
  3. Effettuare tutte le misurazioni in triplicata per garantire la riproducibilità.
  4. Registra i valori di assorbanza spettrofotometricamente utilizzando un lettore di microplacche.
    NOTA: Eseguire tutti gli saghi secondo i protocolli di letteratura consolidati con piccole modifiche.
  5. Attività di recupero radicale DPPH
    NOTA: L'attività di scavenging dei radicali DPPH degli estratti di T. claveryi è stata valutata secondo il metodo descritto in letteratura, con modificheminori 30. Proteggi la soluzione DPPH e le miscele di reazione dall'esposizione alla luce.
    1. Prepara una soluzione DPPH al 70% di metanolo.
    2. Regola la soluzione DPPH a un'assorbenza di 1,00 ± 0,02 a 517 nm.
    3. Pipetta 50 μL di estratto a diverse concentrazioni in un pozzo a micropiastre.
    4. Aggiungere 250 μL di soluzione DPPH a ciascun pozzo.
    5. Incuba la miscela di reazione al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
    6. Misurare l'assorbenza a 517 nm usando uno spettrofotometro a microplacche.
    7. Usa metanolo come controllo negativo e acido ascorbico come controllo positivo.
    8. Costruire curve dose-risposta e calcolare i valori IC₅₀ per quantificare l'attività di recupero radicale.
  6. Attività di recupero radicale cationico ABTS
    NOTA: Eseguire il saggio di recupero radicale ABTS secondo il metodo descritto in letteratura, con modificheminori 31. Prepara la soluzione radicale ABTS⁺ almeno 16 ore prima dell'uso e proteggila dalla luce.
    1. Generare la soluzione radicale ABTS incubando la miscela di reazione al buio a temperatura ambiente per 16 ore.
    2. Diluire 1 mL di soluzione ABTS con 80 mL di etanolo prima dell'analisi.
    3. Regolare l'assorbenza della soluzione ABTS diluita a 0,80 ± 0,02 a 734 nm.
    4. Pipetta 50 μL di estratto a diverse concentrazioni in un pozzo a micropiastre.
    5. Aggiungi 250 μL di soluzione ABTS a ciascun pozzo.
    6. Incuba la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti.
    7. Misura l'assorbenza a 734 nm usando uno spettrofotometro a microplacche.
    8. Costruire curve dose-risposta e calcolare i valori IC₅₀.
  7. Saggio antiossidante riducente ferrico (FRAP)
    NOTA: Eseguire il test FRAP secondo il metodo proposto in letteratura, con modificheminori 32. Prepara il reagente FRAP con cura prima dell'uso e proteggi la miscela di reazione dalla luce.
    1. Prepara il reagente FRAP secondo il protocollo di riferimento.
    2. Pipetta 20 μL di estratto a diverse concentrazioni in un pozzo di microplacche.
    3. Aggiungi 280 μL di reagente FRAP appena preparato.
    4. Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente al buio per 45 minuti.
    5. Misura l'assorbanza a 593 nm usando uno spettrofotometro a microplacche.
    6. Genera una curva di calibrazione usando Trolox come standard.
    7. Esprimi la capacità antiossidante in mg di equivalenti Trolox (TE) per grammo di estratto.

4. Analisi del contenuto fenolico totale (TPC)

NOTA: Determinare il contenuto fenolico totale (TPC) degli estratti di T. claveryi utilizzando il metodo Folin–Ciocalteu come descritto in letteratura, con modificheminori 33. Proteggi le miscele di reazione dalla luce durante l'incubazione. Prepara la soluzione di carbonato di sodio frescamente prima dell'uso.

  1. Prepara soluzioni estratte a una concentrazione di 1 mg/mL da soluzioni di stock appena preparate.
  2. Pipetta 25 μL di estratto in un pozzo a micropiastre, aggiungi 75 μL di acqua distillata e poi aggiungi 25 μL di reagente Folin–Ciocalteu.
  3. Incuba la miscela a temperatura ambiente per 6 minuti.
  4. Aggiungi 100 μL di soluzione di carbonato di sodio al 7% (p/v) in ogni pozzo.
  5. Incuba la miscela di reazione a temperatura ambiente al buio per 90 minuti.
  6. Misurare l'assorbanza a 665 nm usando uno spettrofotometro a microplacche.
  7. Preparare una curva di calibrazione utilizzando l'acido gallico come standard e calcolare il contenuto fenolico totale, esprimendo i risultati in mg di equivalenti di acido gallico (GAE) per mL di estratto.

5. Analisi fitochimica tramite LC-MS/MS

NOTA: Eseguire l'analisi LC-MS/MS secondo metodi cromatografici precedentemente pubblicati con modificheminori 34. Filtrare tutti i campioni e le fasi mobili attraverso filtri a membrana da 0,22 μm e degassare le fasi mobili prima dell'analisi.

  1. Seleziona l'estratto che presenta il più alto contenuto fenolico totale per il profilaggio fitochimico quantitativo.
  2. Eseguire la separazione cromatografica utilizzando una colonna C18 a fase inversa mantenuta a 30°C.
  3. Preparare la fase mobile composta da (A) 0,1% di acido formico in acqua deionizzata e (B) acido formico allo 0,1% in acetonitrile, impostare la portata a 0,4 mL/min, regolare il volume di iniezione a 5 μL e impostare il tempo di esecuzione totale a 17 min.
  4. Effettuare la rilevazione spettrometrica di massa in condizioni di ionizzazione elettrospray (ESI) utilizzando azoto come gas di essiccazione, guaina e nebulizzazione.
  5. Impostare la temperatura del gas di essiccazione a 350 °C con portata di 12 L/min, impostare la temperatura del gas di guaina a 250 °C con portata di 5 L/min, e regolare la pressione del nebulizzatore a 55 psi.
  6. Preparare curve di calibrazione esterne per ogni standard fenolico e quantificare gli analiti utilizzando le corrispondenti curve di calibrazione.

6. Test di attività antimicrobica

NOTA: Valutare l'attività antibatterica utilizzando il metodo di diffusione del pozzo dell'agar secondo i protocolli microbiologici consolidati. Esegui tutte le procedure microbiologiche in condizioni asettiche in un armadietto di biosicurezza. Sterilizza tutti i materiali prima e dopo l'uso.

  1. Seleziona i seguenti ceppi di tipo per i test antimicrobici: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, e Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inoculare ogni ceppo batterico nel brodo di soia triptone (TSB) e incubare alla temperatura ottimale di crescita fino a raggiungere una densità ottica di OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Distribuire le colture batteriche in modo uniforme sulle piastre di agar di soia e triptone (TSA) utilizzando un tampone sterile.
  4. Perforare pozzi asetticamente nell'agar usando un perforatore sterile del sughero.
  5. Aggiungere 100 μL di ciascun estratto (100 μg/mL) nei pozzi corrispondenti.
  6. Incubare le piastre a 37 °C per 18 ore.
  7. Misurare i diametri delle zone inibitorie che circondano ciascun pozzo per valutare l'attività antimicrobica.
  8. Esegui tutti gli esperimenti in triplicata ed esprimi i risultati come valori medi.

7. Inibizione del biofilm

NOTA: Valutare l'attività anti-biofilm utilizzando un saggio di colorazione viola cristallina rispetto a ceppi batterici di riferimento. Esegui tutte le procedure in condizioni asettiche ed evita di disturbare i biofilm aderiti durante le fasi di lavaggio.

  1. Seleziona Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 come ceppi di riferimento e coltivali in TSB a 37 °C fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica.
  2. Regolare le sospensioni batteriche a una densità ottica di OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipettare 100 μL di soluzioni estratte (0,625–10 mg/mL) in piastre sterili di polistirene a 96 pozzi, aggiungere 100 μL di sospensione batterica in ciascun pozzo e mescolare delicatamente.
  4. Incubare le placche a 37 °C per 24 ore. Usa pozzi contenenti solo TSB come blank e pozzi contenenti sospensioni batteriche senza estratto come controlli.
  5. Rimuovere con cura le cellule non aderenti, lavare i pozzi due volte con acqua distillata e lasciare asciugare le lastre all'aria.
  6. Aggiungi 200 μL di soluzione di viola cristallina allo 0,4% (p/v) in ogni pozzo e incuba per 30 minuti.
  7. Rimuovere la macchia in eccesso, sciacquare i pozzi due volte con acqua distillata e lasciare asciugare completamente le lastre.
  8. Aggiungi etanolo per solubilizzare il colorante legato e misura l'assorbanza a 595 nm usando un lettore di microplacche.
  9. Calcola l'attività dell'antibiofilm usando l'Equazione (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Coltura cellulare e analisi dell'attività citotossica (analisi MTT)

NOTA: Valutare gli effetti citotossici utilizzando il test MTT secondo i protocolli standard di vitalità cellulare. Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza e preriscaldare il mezzo e i reagenti a 37 °C prima dell'uso.

  1. Ottenersi la linea cellulare del neuroblastoma umano SH-SY5Y da un deposito cellulare accreditato e coltivare le cellule nel mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco, integrate con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di penicillina/streptomicina e 1% di L-glutamina in25 cm di 2 fiaschette di coltura.
  2. Mantieni le colture a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% diCO2 e fai crescere le cellule fino a circa l'80% di confluenza.
  3. Si staccano le cellule tramite tripsinizzazione, le seminano in piastre da 96 pozzi a una densità di 2 × 104 cellule per pozzo, e si incubano per 24 ore per consentire l'attacco.
  4. Trattare le cellule con estratti di T. claveryi a concentrazioni di 150, 300, 600, 1200 e 2000 μg/mL e incubare per 24 ore.
  5. Rimuovere il mezzo di coltura, aggiungere 100 μL di mezzo fresco contenente 10 μL di soluzione MTT in ciascun pozzo e incubare per 4 ore a 37 °C.
  6. Aspirare il mezzo, sciogliere i cristalli di formazan aggiungendo 100 μL di dimetilsolfosido (DMSO) in ogni pozzo e misurare l'assorbenza a 570 nm usando uno spettrofotometro a microplacche.
  7. Esegui tutti gli esperimenti in triplice.

figure-protocol-3
Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

9. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software statistici appropriati e confrontare i gruppi di controllo e di trattamento utilizzando il test t di Student o l'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA), secondo opportunità.
  2. Esprimi tutti i dati come media ± errore standard della media (SEM).
  3. Definisci la significanza statistica a p < 0,05.
  4. Indicare la significanza statistica nelle figure usando asterischi come segue: **** per p < 0,0001, *** per p < 0,001, ** per p < 0,01 e * per p < 0,05, e usare "ns" per indicare la non significanza.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificazione molecolare di T. claveryi
L'amplificazione PCR della regione ITS è stata eseguita utilizzando i primer universali ITS1 e ITS4 per l'identificazione molecolare di T. claveryi. Le sequenze risultanti sono state analizzate e confrontate con le sequenze di riferimento nel database NCBI utilizzando l'algoritmo BLAST, permettendo un'identificazione definitiva delle specie (File supplementare 1).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente studio stabilisce una piattaforma comparativa e standardizzata di estrazione–bioattività per T. claveryi, dimostrando che la strategia di estrazione è un determinante decisivo sia della composizione chimica che della funzionalità biologica. La principale forza metodologica di questo protocollo risiede nel rigoroso controllo dei parametri di estrazione, in particolare il rapporto solido-liquido fisso, il volume standardizzato del solvente, la lavorazione post-estrazio...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto. Tutti i dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili all'interno del manoscritto principale e dei file informativi supplementari. I dataset generati e analizzati durante lo studio attuale sono disponibili dall'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori hanno dichiarato che questo studio non ha ricevuto alcun sostegno finanziario.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastre microtitolate in polistirene a 96 pozziNest Scientific701001Coltura cellulare / piastre per analisi
ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico))Sigma-AldrichA3219Saggio di recupero radicale cationico
Acetone (grado analitico)Sigma-Aldrich179124Solvente per estrazione
Acetonitrile (grado LC-MS)Sigma-Aldrich34851Fase organica mobile
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, USAATCC 17978
Triple Quad LC-MS/MS con sistema UPLC 1290 InfinityTecnologie Agilent6460Analisi quantitativa
Colonna analitica (C18, 4,6 e volte 100 mm, 3,5 e mu; m)Tecnologie Agilent (Zorbax)959990-902Colonna a fase inversa
Standard antiossidanti (Acido ascorbico / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Controlli positivi
Analizzatori di DNA Applied Biosystems 3730xlBiosistemi applicati Analizzatori di DNA 3730xlSistema di sequenziamento del DNA
Biosistemi applicati e commercio; BigDye™ Kit di sequenziamento ciclico Terminator v3.1Biosistemi applicati 4337455Kit di sequenziamento Sanger
Bacillo cereusATCCManassas, VA, USAATCC 14579
Analisi bioinformatica, software BioEdit, Algoritmo utilizzato: assemblaggio CAP contigIbis BiosciencesNASoftware di assemblaggio di sequenze
Ditale per l'estrazione della cellulosaFisherbrand e il commercio;  11724043Utilizzato per l'estrazione dei Soxhlet
Dimetilsolfossido (DMSO)Merck102952Solvente
Kit di isolamento del DNA (Plant & Plant & Kit di isolamento del DNA dei funghi (Polonia)EurX GeneMATRIXE3595Isolamento del DNA 
DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazile)Sigma-AldrichD9132Saggio radicale per recupero
Eagle Medium Modificato di DulbeccoCapricorno,  DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, USAATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, USAATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, USAATCC 25922
EtanoloMerck100983Solvente
Acetato di etilMerck109623Solvente per l'estrazione
Siero Fetale Bovino (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
Kit di sequenziamento ciclico BigDyeTerminator v3.1ThermoFisher4337455Kit di sequenziamento
Reagente Folin-CiocalteuSigma-Aldrich 47641Contenuto fenolico totale
Acido formicoSigma-Aldrich 33015Additivo di fase mobile
Acido gallicoCarlo Erba406335Curva di calibrazione
Pianta e pianta Gene MATRIX Kit di isolamento del DNA dei funghiEurX E3595Kit di isolamento del DNA
GraphPad Prism (v9)Visualizzazione dei dati e analisi statisticaN/AAnalisi statistica
Mantello riscaldanteElettrotermico EME30500Usata per mantenere il reflusso solvente
HighPrep e commercio; Sistema di pulizia PCRMAGBIOAC-60005
GhiaccioGrado di laboratorio—Controllo della temperatura durante gli Emirati Arabi Uniti
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, USAATCC 13883
L-glutaminaCapricorn ScientificGermania
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, USAATCC 19115
LiofilizzatoreScientzN/ALiofilizzazione degli estratti
Linea magnetica e traguardo; sistema di pulizia PCR basatoMAGBIOAC-60005PCR
MetanoloMerck106009Solvente per estrazione
n-EsanoMerck103701Solvente per estrazione
Penicillina/StreptomicinaCapricorn ScientificGermania
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, USAATCC 27853
Carta filtro (n. 541)Cytiva1541-125 VNel processo di filtrazione con estratto
Evaporatore rotativoBuchi R10011100V101Rimozione del solvente
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, USAATCC 13313
Carbonato di sodioMerck106392Analisi fenolica totale
SPECTROstar Nano Microplate Reader BMG LabtechMisurazioni di assorbanza
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, USAATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, USAATCC 12228
Software di analisi statistica (SPSS, v23)Analisi dei datiNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Triptone Soy Agar (TSA)MerckGermania—
Brodo di Soia di Triptone (TSB)MerckGermania—
Omogeneizzatore a ultrasuoniScientzSCIENTZ-650LEstrazione assistita da ultrasuoni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasser, S. P., Weis, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (Review). Int. J. Med. Mushrooms. 1 (1), 31-62 (1999).
  2. Wasser, S. P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (5), 1323-1332 (2011).
  3. Badalyan, S. Medicinal aspects of edible ectomycorrhizal mushrooms. Edible Ectomycorrhizal Mushrooms: Current Knowledge and Future Prospects. Zambonelli, A., Bonito, G. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 317-334 (2012).
  4. El Enshasy, H. A., Hatti-Kaul, R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 31 (12), 668-677 (2013).
  5. Morte, A., Kagan-Zur, V., Navarro-Ródenas, A., Sitrit, Y. Cultivation of desert truffles—A crop suitable for arid and semi-arid zones. Agronomy. 11 (8), 1462(2021).
  6. Gutiérrez, A., Morte, A., Honrubia, M. Morphological characterization of the mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza. 13 (6), 299-307 (2003).
  7. Loizides, M., Hobart, C., Konstandinides, G., Yiangou, Y. Desert truffles: the mysterious jewels of antiquity. Field Mycology. 13 (1), 17-21 (2012).
  8. Atila, F., Kazankaya, A. Terfezia species natural distributed in Türkiye and their ecologies. Mantar Dergisi. 13 (3), 119-130 (2022).
  9. Türkoğlu, A., Castellano, M., Trappe, J., Yaratanakul Güngör, M. Turkish truffles I: 18 new records for Turkey. Turkish J. Bot. 39, 359-376 (2015).
  10. Doğan, H., Kurt, F. New macrofungi records from Turkey and macrofungal diversity of Pozantı-Adana. Turkish J. Bot. 40, 209-217 (2016).
  11. İnci, Ş, Kırbağ, S. Nutritional content, antioxidant and antimicrobial activity of Terfezia claveryi Chatin. Artvin Çoruh Univ. J. For. Fac. 19 (2), 138-143 (2018).
  12. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  13. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 40 (4), 277-283 (2015).
  14. Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  15. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39 (1), 44-84 (2007).
  16. Morte, A., Honrubia, M., Gutiérrez, A. Biotechnology and cultivation of desert truffles. Mycorrhiza: State of the Art. Varma, A. , 467-483 (2008).
  17. Corrêa, R. C. G., et al. Biotechnological, nutritional and therapeutic uses of Pleurotus spp. related with its chemical composition: a review. Trends Food Sci Technol. 50, 103-117 (2016).
  18. Ma, G., et al. A critical review on the health promoting effects of mushrooms nutraceuticals. Food Sci. Hum. Wellness. 7 (2), 125-133 (2018).
  19. Reis, F. S., et al. Functional foods based on extracts or compounds derived from mushrooms. Trends Food Sci. Technol. 66, 48-62 (2017).
  20. Mandeel, Q. A., Al-Laith, A. A. Ethnomycological aspects of the desert truffle among native Bahraini and non-Bahraini peoples. J. Ethnopharmacol. 110 (1), 118-129 (2007).
  21. Patel, S. Food, health and agricultural importance of truffles: a review. Curr. Trends Biotechnol. Pharm. 6, 15-27 (2012).
  22. Janakat, S., Nassar, M. Hepatoprotective activity of desert truffle (Terfezia claveryi) compared with Nigella sativa in rats. Pak. J. Nutr. 9, 52-56 (2010).
  23. Al-Laith, A. A. A. Antioxidant components and activities of desert truffle (Tirmania nivea). J. Food Compos. Anal. 23 (1), 15-22 (2010).
  24. Shavit, E., Shavit, E. The medicinal value of desert truffles. Desert Truffles. Kagan-Zur, V., Roth-Bejerano, N., Sitrit, Y., Morte, A. 38, 323-340 (2014).
  25. Patel, S., et al. Potential health benefits of natural products derived from truffles. Trends Food Sci. Technol. 70, 1-8 (2017).
  26. Beara, I. N., et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of truffles. Food Chem. 165, 460-466 (2014).
  27. Dahham, S. S., et al. Antioxidant, anticancer and apoptosis properties of Terfezia claveryi. Saudi J. Biol. Sci. 25 (8), 1524-1534 (2018).
  28. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds: a review. J. Food Eng. 117 (4), 426-436 (2013).
  29. Kumar, M., Shukla, P. K. PCR targeting of ITS regions for rapid diagnosis of mycotic keratitis. J. Clin. Microbiol. 43 (2), 662-668 (2005).
  30. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH method. LWT Food Sci. Technol. 30, 609-615 (1997).
  31. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS assay. Free Radic. Biol. Med. 26 (9-10), 1231-1237 (1999).
  32. Đorđević, T. M., et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of cereals. Food Chem. 119 (3), 957-963 (2010).
  33. Herald, T. J., et al. High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour. Sci. Food Agric. 92 (11), 2326-2331 (2012).
  34. Kısa, D., et al. Evaluation of Biological Potency of two Endemic Species Integrated with in vitro and in silico Approches: LC-MS/MS Analysis of the Plants. Chem. Biodivers. 21 (3), e202301351(2024).
  35. Kumoro, A., Singh Hasan, Effects of solvent properties on the soxhlet extraction of diterpenoid lactones from andrographis paniculata leaves. ScienceAsia. 35, 306-309 (2009).
  36. Ng, Z. X., Samsuri, S. N., Yong, P. H. The antioxidant index and chemometric analysis of tannin, flavonoid, and total phenolic extracted from medicinal plant foods with the solvents of different polarities. Food Process. Preserv. 44 (9), e14680(2020).
  37. Kıvrak, İ Analytical methods applied to assess chemical composition, nutritional value and ın vitro bioactivities of Terfezia olbiensis and Terfezia claveryi from Turkey. Food Anal. Methods. 8 (5), 1279-1293 (2015).
  38. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2015).
  39. Monteiro, M., et al. Effect of extraction method and solvent system on the phenolic content and antioxidant activity of selected macro- and microalgae extracts. J. Appl. Phycol. 32 (1), 349-362 (2020).
  40. Pingret, D., et al. Degradation during application of ultrasound in food processing: A review. Food Control. 31, 593-606 (2013).
  41. Şahin, A., et al. Total phenol, antioxidant activity, fatty acid composition and mineral contents of the species of fungi known as domalan. J. Agroalimentary Process. Technol. 26 (3), 149-154 (2020).
  42. Fidan, M., et al. cytotoxic and protective effects of truffles. Anal. Biochem. 641, 114566(2022).
  43. Awika, J. M., et al. Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum (sorghum bicolor) and sorghum products. J. Agric. Food Chem. 51 (23), 6657-6662 (2003).
  44. Gursoy, N., et al. Antioxidant activities, metal contents, total phenolics and flavonoids of seven Morchella species. Food Chem. Toxicol. 47 (9), 2381-2388 (2009).
  45. Elsayed, E., et al. Truffles: A potential source of bioactive compounds. Bioactive Compounds in Food. , CRC Press. 163-174 (2021).
  46. Elsayed, E. A., et al. Mushrooms: a potential natural source of anti-inflammatory compounds for medical applications. Mediators Inflamm. 2014, 805841(2014).
  47. Stanikunaite, R., et al. Cyclooxygenase-2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus. Phytother. Res. 23 (4), 575-578 (2009).
  48. Doğan, H. H., Aydın, S. Determination of antimicrobial effect, antioxidant activity and phenolic contents of desert truffle in Turkey. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 10 (4), 52-58 (2013).
  49. Abu-Odeh, A., et al. In vitro and In vivo Antidiabetic Activity, phenolic content and microscopical characterization of Terfezia claveryi. Molecules. 27 (15), 4843(2022).
  50. Nguyen, V., et al. Chlorogenic Acid: A systematic review on the biological functions, mechanistic actions, and therapeutic potentials. Nutrients. 16 (7), 924(2024).
  51. Suhag, R., et al. Mapping antioxidant mechanisms in plant extracts via reactivity kinetics inhibiting oil autoxidation. Appl. Food Res. 5 (2), 101476(2025).
  52. Harir, M., et al. Evaluation of antimicrobial activity of Terfezia arenaria extracts collected from Saharan desert against bacteria and filamentous fungi. 3 Biotech. 9 (7), 281(2019).
  53. Hamza, A., et al. Nutraceutical potential, antioxidant and antibacterial activities of Terfezia boudieri Chatin, a wild edible desert truffle from Tunisia arid zone. Arab. J. Chem. 9 (3), 383-389 (2016).
  54. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2020).
  55. Dib, S., Fortas, Z. Antimicrobial activities of desert truffle extracts and their chemical ıdentification. J. Pharm. Pharmacol. 7, 1-7 (2019).
  56. Gargano, M. B., et al. Antimicrobial activity of the extracts of Terfezia Claveryi and Tirmania Pinoyi against gram-positive and gram-negative bacteria causal agent of diseases in tomato. Chem. Eng. Trans. 58, 73-78 (2017).
  57. Khojah, H. M. J., et al. Antimicrobial efficacy of extracts of Saudi Arabian desert Terfezia claveryi truffles. Saudi J. Biol. Sci. 29 (11), 103462(2022).
  58. Akyüz, M., et al. Cytotoxicity and DNA protective effects of the Terfezia and Picoa species from the eastern region of Turkey. Istanbul J. Pharm. 51 (2), 198-203 (2021).
  59. Al Obaydi, M. F., et al. Terfezia boudieri: A Desert Truffle With Anticancer and Immunomodulatory Activities. Front. Nutr. 7, 38(2020).
  60. Pakrashi, S., et al. Quercetin alleviates 6-OHDA-caused apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol. Res. 13 (4), tfae117(2024).

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