Un modello topino di ablazione linfatica del cuore donatore tramite elettrocauterizzazione per ricerca su trapianto

Sommario

Abbiamo sviluppato un nuovo modello murino di ablazione linfatica cardiaca con donatore nel trapianto di cuore. Questo modello dimostra che la perturbazione delle linfose del donatore attenua il rigetto acuto, riduce la lesione miocardica e prolunga la sopravvivenza del trapianto, fornendo nuove intuizioni sulla funzione linfatica cardiaca nell'immunità al trapianto.

Abstract

Sebbene i vasi linfatici cardiaci abbiano attirato una crescente attenzione negli ultimi anni, la relazione tra il sistema linfatico cardiaco donatore e il rigetto acuto nel trapianto di cuore resta da chiarire.

L'attività elettrofisiologica cardiaca è stata valutata tramite elettrocardiografia (ECG) nei topi normali prima e dopo l'ablazione linfatica cardiaca. I principali vasi linfatici dei cuori donatori sono stati visualizzati tramite iniezione di Evans Blue e successivamente ablati tramite elettrocauterizzazione. È stato stabilito un modello di trapianto cardiaco che presenta disfunzioni linfattiche cardiache tramite donatore utilizzando cuori sottoposti ad ablazione linfatica. La funzione dell'innesto cardiaco è stata valutata tramite ecocardiografia, western blotting ed ELISA. L'impatto dell'ablazione linfatica del donatore sul rigetto acuto è stato valutato tramite colorazione di ematossilina-eosina (HE) e monitoraggio del tempo di sopravvivenza dell'innesto.

I risultati dell'ECG non hanno indicato cambiamenti significativi nell'elettrofisiologia cardiaca prima e dopo l'ablazione linfatica, confermando che i principali vasi cardiaci sono rimasti intatti. Evans Blue è stato iniettato nell'apice cardiaco per identificare i vasi linfatici. I principali linfatici sono stati poi ablati tramite elettrocauterizzazione. Dopo il completamento della procedura di ablazione, i topi sono stati eparinizzati e i loro cuori sono stati successivamente prelevati. L'aorta e l'arteria polmonare sono state interseccate, e la vena cava superiore/inferiore, insieme alle vene polmonari, sono state legate. I cuori del donatore preparati (ablati) venivano poi trapiantati. I livelli di cTnI e la frazione di eiezione hanno dimostrato che l'ablazione linfatica non ha aggravato il danno cardiaco. La colorazione con HE ha rivelato che l'ablazione di linfatici cardiaci donatori alleviava il rigetto acuto, riduceva la lesione miocardica e prolungava la sopravvivenza dell'innesto.

Abbiamo istituito con successo un modello di trapianto di cuore murino con disfunzione linfatica cardiaca del donatore e dimostrato che l'ablazione di limfatici cardiaci donatori può mitigare il rigetto acuto, attenuare il danno miocardico e prolungare la sopravvivenza del trapianto. Questi risultati offrono nuove intuizioni e una base per comprendere il ruolo del sistema linfatico cardiaco nel trapianto cardiaco.

Introduzione

Il rigetto dell'alloinnesto cardiaco rimane una delle complicazioni più comuni e gravi dopo il trapianto di cuore, classificata principalmente in rigetto cellulare acuto e rigetto mediato dagli anticorpi. Sebbene le terapie immunosoppressive moderne abbiano migliorato significativamente i tassi di sopravvivenza del trapianto, il rifiuto continua a essere un fattore determinante per i risultati del trapianto. Secondo la letteratura, circa il 12% dei pazienti sperimenta almeno un episodio di rigetto acuto moderato o grave nel primo anno dopo il^trapianto.

Il sistema linfatico cardiaco ha attirato sempre più attenzione per il suo potenziale ruolo nel rigetto del trapianto. Oltre alle sue funzioni ben consolidate nell'equilibrio dei fluidi e nella sorveglianza immunitaria, il sistema linfatico svolge un ruolo importante nella modulazione delle risposte immunitarie. I vasi linfatici fungono da conduttore primario per le cellule immunitarie di entrare ed uscire dai^{tessuti 2,3}. Nel cuore, la rete linfatica fornisce l'infrastruttura fondamentale per il trasporto e la ricircolazione delle cellule immunitarie, inclusi i linfociti. Attraverso questo percorso, i linfociti migrano dal flusso sanguigno allo spazio interstiziale, dove svolgono una sorveglianza immunitaria. Successivamente, vengono drenati verso i linfonodi, e infine ritornano alla circolazione^{sistemica 2,4}. Inoltre, studi indicano che le cellule T e i loro sottogruppi svolgono un ruolo centrale nelle risposte di rigetto acuto, e l'attivazione e la migrazione di queste cellule possono essere influenzate dal sistema^{linfatico 5}.

Sebbene si sappia che i vasi linfatici esistono nel cuore e formano reti analoghe ai vasi sanguigni, il loro significato non ha ricevuto un'attenzione comparabile nel corso degli anni. Gli studi hanno dimostrato che l'assenza di vasi linfatici funzionali porta a una marcata ipertrofia cardiaca ed edema, indicando un ruolo cruciale dei linfatici nel mantenimento dell'omeostasi del tessuto^{cardiaco 6}. Inoltre, un drenaggio linfatico compromesso o assente può ridurre l'efficienza della pulizia delle cellule infiammatorie, aggravando così le risposte infiammatorie locali e influenzando il processo di rimodellazione^{cardiaca 7}.

Nelle malattie cardiache esistono vari interventi che mirano ai vasi linfatici. Nei modelli murini, la carenza linfatica cardiaca può essere indotta generando topi Vegfc+/-⁸. Clinicamente, l'embolizzazione linfata mediastinale^{interventistica 9} e la chirurgia pericardica minimamente invasiva^{a finestra 10} possono essere impiegate per trattare l'effusione pericardica chilosa. Per i pazienti con fisiologia circolazione di Fontan, la decompressione linfatica può essere effettuata^{chirurgicamente 11}, tramite decompressione percutana dei dotti^{toracici 12}, oppure stabilendo l'anastomosi^{linfovena 13}. Le tecniche di occlusione includono embolizzazione del dotto^{toracico 14}, embolizzazione selettiva del dotto^{linfatico 15} e legatura del dotto^{toracico 16}. Tuttavia, gli interventi diretti che mirano direttamente ai vasi linfatici cardiaci rimangono limitati.

Dato il ruolo fondamentale dei vasi linfatici cardiaci, abbiamo stabilito un nuovo modello di trapianto di cuore muro ablando i principali vasi linfatici nei cuori donatori tramite elettrocauteria. Questo modello è stato utilizzato per indagare l'impatto della disfunzione linfatica del donatore sul rigetto acuto post-trapianto.

Protocollo

I maschi C57BL/6J e topi BALB/c (maschi, 6-8 settimane, peso corporeo 25-28 g) sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di patogeni. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte secondo i protocolli approvati dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale di Fuwai (N.: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Visualizzazione e ablazione dei vasi linfatici cardiaci nei topi
Per simulare la disfunzione linfatica cardiaca, i principali vasi linfatici cardiaci sono stati ablati tramite elettrocauteria.

Tutti i topi sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo all'1,25% a un dosaggio di 0,2 mL per 10 g di peso corporeo e ventilati meccanicamente durante tutta la procedura. Dopo l'anestesia con tribromoetanolo, i topi BALB/c sono stati sottoposti a intubazione endotracheale utilizzando un catetere calibro 22 e sono stati collegati ai cavi elettrocardiografici (ECG) (Figura 1A, Figura Supplementare S1). Nei parametri del ventilatore, il rapporto respiratorio era impostato a 1:1 o 1:2, con un volume di marea di 0,3 mL e una frequenza respiratoria di 100 respirazioni/minuto. Dopo aver collegato il catetere al ventilatore, le condizioni del topo venivano attentamente monitorate; L'intubazione era considerata efficace se la frequenza respiratoria del topo corrispondeva a quella del ventilatore, mentre tassi incoerenti o distensione addominale indicavano un fallimento che richiedeva la reintubazione. È stata quindi eseguita una toracotomia nello spazio intercostale sinistro 3-4 con un'incisione di circa 1 cm, e un retrattore è stato utilizzato per esporre l'intero cuore (Figura 1B). Successivamente, 5 μL di colorante blu di Evans sono stati iniettati intramuscolarmente nell'apice cardiaco per visualizzare i vasi linfatici, con un periodo di attesa di 1 minuto dopo l'iniezione per consentire l'opacificazione completa (Figura 1C, E; Figura supplementare S2A-B), osservando che il blu di Evans dovrebbe essere iniettato molto lentamente. Dopo la visualizzazione, la posizione dei principali vasi linfatici cardiaci è stata confermata confrontando con i dati anatomici precedentemente^{riportati 17,18}, e l'ablazione è stata eseguita utilizzando una penna elettrocauterizzata impostata a 10 W in modalità continua, con un tempo di coagulazione di circa 3-7 secondi (Figura 1D,F). L'elettrocardiografia (ECG) veniva monitorata prima e dopo l'ablazione per garantire l'assenza di lesioni vascolari (Figura 1G,H). Infine, dopo una grande ablazione linfatica, i topi sono stati eparinizzati in preparazione al successivo prelievo del cuore donatore. Una rappresentazione schematica della procedura chirurgica è fornita nella Figura 2.

Trapianto di cuore eterotopico addominale
Il trapianto di cuore eterotopico nella cavità addominale dei topi è stato eseguito come descritto^{in precedenza 19}. Un breve protocollo è riassunto di seguito:

Procedura con donatore
È stata eseguita una laparotomia lungo la linea alba nei topi BALB/c, e 1 mL di soluzione fisiologica a 50 U/mL a 4 °C è stato iniettato nella vena cava inferiore, mentre l'aorta addominale è stata tagliata per indurre eparinizzazione sistemica. Dopo questo, il cuore è stato esposto e 8-0 Le suture venivano utilizzate per legare la vena cava superiore sinistra e destra, che venivano poi trascinate all'estremità distale delle suture (Figura 3A,B). Successivamente, l'aorta è stata isolata dal tessuto adiposo circostante e tagliata vicino all'arco aortico (Figura 3C), e una procedura simile è stata eseguita per isolare e trasettare l'arteria polmonare (Figura 3D). La vena cava inferiore nel segmento toracico è stata legata con 8-0 suture e trassezioni all'estremità distale (Figura 3E), dopo di che le vene polmonari venivano legate e tranzate usando suture intrecciate in seta 7-0 (Figura 3F). Infine, il cuore del donatore espulso è stato preservato in soluzione fisiologica a 4 °C per il successivo trapianto, con tutti i cuori conservati per la stessa durata di circa 30 minuti per garantire la coerenza sperimentale.

Procedura del ricevente
Anestesiare i topi riceventi di C57BL/6J in preparazione al trapianto di cuore addominale. È stata eseguita una laparotomia lungo la linea alba per esporre l'aorta addominale e la vena cava inferiore del topo ricevente (Figura 4A). Dopo aver legato i vasi ramali dorsali della vena cava inferiore con suture in nylon 10-0, sono stati utilizzati clamp vascolari per occludere il flusso sanguigno attraverso l'aorta addominale e la vena cava inferiore (Figura 4B). Successivamente, è stata creata una finestra nell'aorta addominale e nella vena cava inferiore del topo ricevente, e il sangue veniva lavato dai vasi con soluzione salina di eparina. Utilizzando suture in nylon 11-0, è stata eseguita un'anastomosi laterale per collegare l'arteria polmonare del cuore donatore alla vena cava inferiore del ricevente e l'aorta del cuore donatore all'aorta addominale del ricevente (Figura 4C-E). Infine, le pinze vascolari sono state rilasciate per ripristinare il flusso sanguigno al topo ricevente (Figura 4F).

Progettazione sperimentale
Gruppo sperimentale: I vasi linfatici cardiaci nei topi BALB/c sono stati visualizzati utilizzando il colorante blu Evans e ablati con una penna elettrocauterizzata. I cuori di topi BALB/c con vasi linfatici ablati sono stati trapiantati in topi C57BL/6J.

Gruppo di controllo: I vasi linfatici cardiaci nei topi BALB/c sono stati visualizzati utilizzando il colorante Evans Blue, ma non è stata eseguita alcuna ablazione. I cuori dei topi BALB/c sono stati trapiantati in topi C57BL/6J.

In questo studio, la dimensione del campione è stata standardizzata su tutti i gruppi sperimentali e i momenti temporali, con n=5 topi per gruppo per i test condotti a 24 ore dal trapianto cardiaco, n=5 per gruppo per i test a 7 giorni dal trapianto e n=5 per gruppo per l'osservazione del tempo di sopravvivenza dell'innesto cardiaco.

I cuori dei donatori prelevati sono stati conservati in soluzione salina gelida a 4 °C per 30 minuti prima del trapianto cardiaco. Sia i cuori sperimentali che quelli del gruppo di controllo sono stati mantenuti in soluzione salina per una durata identica.

La durata del battito degli innesti cardiaci è stata valutata quotidianamente tramite palpazione in entrambi i gruppi (n=5 per gruppo).

Valutazione istologica e punteggio per rigetto parenchimante (PR)
I campioni di tessuto miocardico sono stati fissati al 10% di formalina per 48 ore, seguiti da disidratazione tramite una serie di etanolo gradata (70%, 80%, 95%, 100%), pulizia dello xilene, incorporazione della paraffina e sezionamento del microtomo (4 μm), con le sezioni risultanti colorate usando ematossilina ed eosina (H&E). Il rigetto dell'innesto è stato valutato utilizzando il punteggio PR per il trapianto di cuore, e il grado di lesione dell'innesto è stato accelto in modo^{cieco 20}.

Esame ecocardiografico
La funzione cardiaca è stata valutata utilizzando l'impianto ecografico (trasduttore sonda 550 MHz). I topi venivano posti in posizione supina su una piattaforma animale rotabile a 360 gradi. Dopo la rimozione dei peli addominali, la funzione cardiaca è stata valutata sotto anestesia isoflurana all'1,0%. La frazione di eiezione (EF) dell'innesto cardiaco è stata misurata tramite ecocardiografia in modalità M.

Rilevamento dei marcatori della lesione miocardica
L'entità del danno del tessuto miocardico è stata valutata misurando l'espressione di enzimi specifici cardiomiociti nel siero. I livelli di troponina cardiaca I (cTnI) sono stati analizzati secondo le istruzioni del produttore.

Western blotting
A 24 ore dal trapianto cardiaco è stato raccolto tessuto miocardico dalle principali regioni dei vasi linfatici dei trapianti cardiaci, sia nel gruppo di controllo che in quello sperimentale. Seguendo il protocollo²¹ precedentemente descritto, è stata analizzata l'espressione dei marcatori associati ai vasi linfatici. I tessuti cardiaci sono stati accuratamente lisati in un tampone di lisi RIPA contenente inibitori della proteasi (fenilmetano solfonifluoro). Prima della denaturazione termica, la concentrazione proteica veniva determinata utilizzando un kit BCA e regolata a una concentrazione uniforme. La proteina totale di ciascun gruppo veniva separata tramite SDS-PAGE e successivamente trasferita su una membrana PVDF. La membrana PVDF è stata bloccata con il 5% di latte scremato (temperatura ambiente per 1-2 ore) e poi incubata durante la notte a 4 °C con i rispettivi anticorpi primari. Il giorno seguente, la membrana è stata trattata con un anticorpo secondario (anti-coniglio, 1:1000) a temperatura ambiente per 30 minuti. Le strisce di membrana sono state incubate con soluzione ECL (1-2 mL) ed esposte per catturare le immagini.

Gli anticorpi utilizzati erano i seguenti: anticorpo policlonale LYVE1 (1:500), Anticorpo Podoplanin (1:500) e recettore anti-VEGF 3 (1:50).

Analisi statistica
Tutti i risultati sono espressi come media ± errore standard di media (SEM). Nel confronto tra due gruppi, sono state effettuate analisi statistiche utilizzando il test t di Student o il test di somma dei ranghi di Wilcoxon, a seconda della distribuzione dei dati e delle caratteristiche. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05.

Risultati

Valutazione della funzione dell'innesto cardiaco
Modelli murini di trapianto cardiaco sono stati stabiliti sia nei gruppi di controllo che in quelli sperimentali secondo il protocollo descritto. Lo stato funzionale degli innesti è stato valutato 24 ore dopo il trapianto. Il livello di espressione della troponina cardiaca sieroica I (cTnI) era più alto nel gruppo sperimentale rispetto a quello di controllo, ma la differenza non era statisticamente significativa (

Discussione

Il sistema linfatico cardiaco costituisce un componente vitale nel mantenimento dell'omeostasi del liquido tissutale e nel supporto alla funzione immunitaria all'interno del cuore. Facilitando il riassorbimento del liquido interstiziale, il trasporto lipidico e il traffico delle cellule immunitarie, garantisce le prestazioni cardiache sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Negli ultimi anni, crescenti evidenze hanno evidenziato il coinvolgimento critico del sistema linfatico car...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Penna elettrocoagulante	Weitai	V70
Pincette microscopiche	Jinzhong	WA3030
Pincette microscopiche	Jinzhong	WA2040
Portaago microscopico	Jinzhong	YZE010
Portaago microscopico	Jinzhong	YZE020
Forbici microscopiche	Jinzhong	YBC010
Forbici microscopiche	Jinzhong	YBC020
Portaaghi	Jinzhong	J32010
Forbice	Jinzhong	Y00010
Ventilatore per piccoli animali	Zhuodi	DW-300