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Tutte le indagini originali del Genome-Wide Association Study (GWAS) incluse in questa analisi hanno ottenuto il consenso informato scritto dei partecipanti e l'approvazione dei rispettivi comitati etici istituzionali. Poiché il presente studio utilizzava statistiche riassuntive GWAS non identificate e disponibili pubblicamente, non era richiesta un'approvazione aggiuntiva del comitato di revisione istituzionale. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Dati
Le statistiche riassuntive del polimorfismo a nucleotide singolo (SNP) sono state ottenute da database GWAS accessibili al pubblico sia per i dataset di esposizione che per quelli di risultati. Le statistiche riassuntive GWAS per l'età al primo rapporto sessuale (AFS) sono state ottenute da una meta-analisi GWAS del 2021 che comprendeva 214.547 individui di origine europea provenienti dalla UK Biobank (UKB)12. AFS veniva trattata come una variabile di esposizione continua. Sono stati utilizzati i dati sui comportamenti sessuali riportati dai partecipanti raccolti tramite interviste anonime, escludendo gli individui sotto i 12 anni. Le risposte riguardanti la storia dei rapporti sessuali e l'età al primo rapporto sono state estrate come descritto nello studioGWAS originale 12.
Le statistiche riassuntive GWAS per l'infezione da Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV) sono state ottenute dal rilascio R5 del consorzio FinnGen, che includeva 357 casi di HIV e 218.435controlli 13. AFS è stata designata come variabile di esposizione, e l'infezione da HIV è stata definita come variabile di risultato. Sono stati inclusi solo dataset che coinvolgevano individui di ascendenza europea per minimizzare il bias di stratificazione della popolazione. Il flusso di lavoro analitico complessivo per l'estrazione dati GSi, il filtraggio SNP, l'armonizzazione, le analisi di randomizzazione mendeliana, i test di sensibilità e l'interpretazione dei risultati è riassunto nella Figura 1.
2. Progettazione dello studio
Èstato applicato un quadro di randomizzazione mendeliana (MR) a due campioni basato sull'allocazione cromosomica casuale durante la meiosi. Varianti genetiche associate all'AFS sono state utilizzate come variabili strumentali per stimare la relazione tra AFS e rischio di infezione da HIV. L'analisi della RM è stata condotta sotto tre ipotesi fondamentali: gli SNP selezionati erano fortemente associati all'AFS, coerenti con l'assunzione di rilevanza; gli SNP erano indipendenti dalle potenziali variabili di confusione associate al rischio di infezione da HIV, coerenti con l'assunzione di indipendenza; e gli SNP influenzavano l'infezione da HIV esclusivamente tramite AFS senza vie causali alternative, coerenti con l'assunzione di restrizione di esclusione (Figura 2)14.
La forza dello strumento è stata valutata utilizzando soglie di significatività genomica e statistiche F. Gli SNP significativi a livello genomico associati all'AFS sono stati selezionati utilizzando rigide soglie di aggregazione di disequilibrio di legame, e SNP con F-statistica < 10 sono stati esclusi per minimizzare il debole bias dello strumento e rafforzare l'assunzione di rilevanza. I potenziali effetti di pleiotropia e confondimento sono stati valutati utilizzando analisi di sensibilità. Le assunzioni di restrizione di indipendenza ed esclusione sono state ulteriormente valutate tramite procedure di armonizzazione, screening per confondi, test di intercetta MR-Egger, analisi di eterogeneità Q di Cochran, valutazione degli outlier MR-PRESSO e analisi di sensibilità lascia-uno-fuori per ridurre la probabilità di pleiotropia orizzontale e confondimento residuo. Ulteriori analisi di sensibilità sono state effettuate per identificare gli effetti pleiotropi e validare le ipotesi della RM15. Sono state condotte analisi RM per valutare se l'AFS geneticamente precoce fosse associata al rischio di infezione da HIV.
3. Selezione delle variabili strumentali
Procedure rigorose di controllo qualità sono state implementate prima della selezione degli SNP. Gli SNP significativamente associati a AFS alla soglia di significanza genomica (P < 5 × 10⁻8) sono stati estratti utilizzando la funzione extract_instruments() nel pacchetto TwoSampleMR con soglie di squilibrio di collegamento di r2 < 0,001 e una distanza di aggregazione > 10.000kb 16. Le statistiche F sono state calcolate per tutti gli SNP selezionati, e le variabili strumentali deboli con F < 10 sono state escluse17.
La statistica F è stata calcolata come segue:
dove:
In queste equazioni, N indica la dimensione del campione del dataset selezionato, k indica il numero di SNP utilizzati per l'analisi RM, β indica la stima dell'effetto SNP su AFS, SD indica la deviazione standard di β e MAF indica la frequenza allele minore. Gli SNP che soddisfacevano tutti i criteri predefiniti sono stati mantenuti come variabili strumentali finali per l'analisi RM.
4. Rimozione degli SNP confondenti e palindromici
Tutti gli SNP selezionati sono stati esaminati per potenziali associazioni con caratteristiche di confusione prima dell'armonizzazione. Gli SNP associati a fenotipi correlati all'HIV o a potenziali tratti confondenti con r2 > 0,80 sono statiesclusi 23,24. I dataset di esposizione ed esito sono stati armonizzati utilizzando la funzione harmonise_data(), e gli SNP palindromici con frequenze alleli intermedie sono stati rimossi per evitare ambiguità delfilamento 23.
Gli SNP palindromici sono stati definiti come varianti contenenti alleli A/T o G/C con frequenze alleli intermedie che variano da 0,01 a 0,3024.
5. Stima dell'effetto causale
Le analisi RM sono state effettuate utilizzando la funzione mr() con ponderazione inversa della varianza (IVW), regressione MR-Egger, mediana ponderata, modalità ponderata e modalità semplice per stimare la relazione tra AFS e infezione da HIV25. La coerenza tra i metodi di RM è stata valutata per verificare la robustezza delle stime causali e il potenziale bias pleiotropo. IVW è stato utilizzato come metodo analitico principale perché combinava rapporti di Wald specifici per SNP tramitemeta-analisi 24.
Le stime dell'effetto causale sono state riportate come odds ratio (OR), coefficienti beta (β) e intervalli di confidenza (IC) al 95%. Successivamente sono state condotte analisi di eterogeneità e sensibilità. Le statistiche Q di Cochran sono state calcolate utilizzando la funzione mr_heterogeneity(), e analisi lascia-uno-fuori sono state effettuate utilizzando la funzione mr_leaveoneout() per determinare l'influenza dei singoli SNP sulle stimecausali 26,27.
Il test di intercettazione MR-Egger è stato effettuato utilizzando la funzione mr_pleiotropy_test(), e sono stati condotti test globali MR-PRESSO per valutare la pleiotropia orizzontale e identificare SNP atipici. Stime corrette sono state generate dopo la rimozione degli outlier utilizzando le procedureMR-PRESSO 28.
6. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software R (versione 4.1.0; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) con i pacchetti TwoSampleMR, LDlinkR, devtools e MR-PRESSO per l'estrazione SNP, aggregazione di disequilibrio di collegamento, armonizzazione, analisi di randomizzazione mendeliana e test di sensibilità. FinnGen (RRID non disponibile), MR-PRESSO (RRID non disponibile) e LDlinkR (RRID non disponibile) sono stati utilizzati per supportare il flusso di lavoro analitico. Tutti i test statistici erano a doppio senso e la significatività statistica fu definita come P < 0,05.
La potenza statistica è stata stimata utilizzando il calcolatore mRnd basato sul calcolo basato sulla dimensione del campione e sulle stime dell'effetto delle variabilistrumentali 29. Gli output analitici finali includevano stime della RO, intervalli di confidenza al 95%, statistiche di eterogeneità, valutazioni della pleiotropia e analisi di sensibilità, che sono state interpretate collettivamente per valutare la robustezza e la coerenza dell'associazione tra AFS geneticamente prevista e rischio di infezione da HIV. Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando funzioni consolidate dai pacchetti TwoSampleMR, LDlinkR, devtools e MR-PRESSO nel software R. Non sono stati sviluppati script analitici personalizzati per il presente studio.