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Articolo metodologico

Spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 per misurazioni seriali dell'energetica cardiaca durante la conservazione cardiaca a temperatura controllata

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DOI:

10.3791/70070

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17 marzo 2026

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo articolo abbiamo descritto un protocollo riproducibile e a temperatura controllata per la spettroscopia ex vivo di risonanza magnetica del fosforo-31, che consente una valutazione seriale e quantitativa dell'energetica miocardica durante la conservazione degli organi.

Abstract

Una conservazione affidabile degli organi è fondamentale per aumentare la disponibilità dei donatori e migliorare i risultati dei trapianti. Sebbene la conservazione statica rimanga lo standard per i cuori donati, è necessario adottare metodi precisi per monitorare l'energetica miocardica durante tutta la conservazione.

La Spettroscopia di Risonanza Magnetica al Fosforo-31 (31P MRS) consente una misurazione diretta e dinamica dei metaboliti energetici chiave, tra cui fosfocreatina (PCr), adenosina trifosfato (ATP), fosfato inorganico (Pi) e pH intracellulare. Questa tecnica consente una valutazione longitudinale, quantitativa e precisa dello stato metabolico miocardico durante la conservazione ex vivo . I vantaggi della MRS includono la valutazione dinamica dello stato energetico e una valutazione globale dell'energia ventricolare.

Il protocollo inizia con il recupero del donatore suale, l'amministrazione della cardioplegia e la cardiectomia. L'arco aortico è tagliato prossimalmente al tronco brachiocefalico per massimizzare la lunghezza dell'aorta ascendente. Una cannula a coste viene fissata nell'aorta ascendente distale, l'atrio sinistro è segnato e il cuore viene posto in un contenitore cilindrico e isolante, pre-riempito di cardioplegia specifica per la temperatura. Il coperchio si collega alla cannula, sospendendo il cuore all'interno, e il contenitore viene sigillato, mantenendo una temperatura entro 1 °C per 1 ora.

Il contenitore viene posizionato in una scatola di polistirolo su misura con un'apertura per una bobina accordata al fosforo, allineando il centro della bobina con il centro del ventricolo sinistro (LV). Le immagini scout confermano la posizione del vaso ventricolo vicino alla bobina 31P. Lo shimming B0 garantisce un'eccitazione uniforme, seguita dall'acquisizione di uno spettro MR 31P non localizzato. Il post-processing identifica i picchi spettrali per calcolare PCr/ATP, rapporti PCr/Pi e pH intracellulare.

Nel nostro protocollo, la MRS 31P viene eseguita in momenti temporali seriali tra h 0 e 8. Tra un momento e l'altro, il cuore viene conservato in un dispositivo di archiviazione standard alla temperatura desiderata.

31La P MRS ci ha permesso di studiare le variazioni dipendenti dal tempo nella depurazione energetica e il ruolo della temperatura di stoccaggio nella mitigazione dell'esaurimento energetico nel tempo.

Introduzione

Il trapianto cardiaco rimane il trattamento definitivo per alcuni pazienti selezionati con insufficienza cardiacaterminale 1. Tuttavia, una persistente carenza di organi donatori adatti e i limiti delle attuali strategie di conservazione rappresentano ostacoli importanti a risultati ottimali e a una maggiore disponibilità di trapianti 2,3. Tradizionalmente, i cuori dei donatori vengono conservati tramite stoccaggio statico a freddo, che è semplice ed economico, ma soggetto a un esaurimento energetico subclinico durante un trasportoprolungato 2,4. Man mano che i programmi accettano sempre più organi a rischio elevato e geograficamente distanti, cresce la necessità di strumenti oggettivi che caratterizzino la condizione metabolica del miocardio durante la conservazione, piuttosto che affidarsi esclusivamente al tempo ischemico e all'ispezionegrossolana 5,6,7. Inoltre, il metabolismo miocardico e la tolleranza ischemica sono fortemente influenzati dalla temperatura, e sia un raffreddamento inadeguato che un'ipotermia eccessiva possono peggiorare l'esaurimento energetico e il danno cellulare durante la conservazione. Valutare i cuori donatori a molteplici temperature di conservazione clinicamente rilevanti aiuta quindi a identificare le condizioni che meglio mantengono la vitalità miocardica neltempo 3.

Una valutazione accurata e dinamica della bioenergetica miocardica durante la conservazione è essenziale per migliorare le tecniche di conservazione e massimizzare l'utilizzo degli organi. Attualmente, la prassi standard si basa sull'accumulo statico a freddo a temperature comprese tra circa 4 e 8 °C 8. Sebbene questo protocollo abbia mostrato risultati positivi su brevi durate di conservazione, una conservazione prolungata a questa temperatura può compromettere l'integrità miocardica. Pertanto, è essenziale effettuare misurazioni seriali dell'attività metabolica su una gamma di temperature e durate per delimitare le condizioni ottimali di conservazione necessarie a garantire un trapianto d'organo di successo. La valutazione convenzionale della lesione della conservazione spesso si basa su esame istologico o analisi biochimiche da biopsie miocardiche, che sono invasive, distruttive e forniscono solo istantanee regionali intermittenti dello statotissutale 9. Al contrario, la spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 (31P MRS) è una modalità potente e non distruttiva che consente la misurazione diretta e seriale dei metaboliti energetici chiave, tra cui fosfocreatina (PCr), adenosina trifosfato (ATP), fosfato inorganico (Pi) e pH intracellulare, all'interno del tessuto cardiacointatto 6,10,11,12. Consentendo misurazioni ripetute nello stesso organo senza ulteriore gestione dei tessuti, la 31P MRS fornisce approfondimenti globali e longitudinali sullo stato energetico miocardico, migliorando la precisione sperimentale e la riproducibilità rispetto agli approcci basati su biopsia o a sero-surrogati 6,13.

La valutazione della vitalità dell'innesto cardiaco con 31P MRS è stata riesaminata da Bernard etal 14. Qui viene presentato un protocollo dettagliato a temperatura controllata per la MRS ex vivo 3 Tesla 31P del cuore di suino durante la conservazione. Questo metodo fornisce un quadro pratico per monitorare l'esaurimento dei substrati, testare le variabili di stoccaggio e convalidare gli interventi di conservazione. Il protocollo è particolarmente adatto per laboratori che cercano misurazioni seriali e intere del ventricolo durante la conservazione statica a freddo, come studi di conservazione dipendente dalla temperatura, lesioni ischemia-reperfusione o ottimizzazione di soluzioni per cuori donatori marginali e a criteri estesi.

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Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali ed è stato approvato dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee (Protocollo numero SW24M319) per tutte le procedure che coinvolgono animali vivi fino a e incluso il prelievo chirurgico. Tutti gli esperimenti ex vivo successivi sono stati condotti utilizzando tessuti ottenuti dopo l'eutanasia.

1. Procedura pre-raccolta

  1. Imposta l'incubatrice a una temperatura inferiore di 2 °C rispetto alla temperatura di conservazione target. Lascia stabilizzare l'incubatrice per almeno 2 ore.
  2. Metti 6-7 impacchi di ghiaccio nell'incubatrice per pre-raffreddarli alla temperatura stabilita. Assicurati che le bosse di ghiaccio siano sufficienti in quantità da mantenere la temperatura durante il trasporto.
  3. Prepara una soluzione modificata per la cardioplegia di San Tommaso:
    1. In 1 litro di sacchetto di soluzione di Lactato Ringer, aggiungi
      1. 30 mL di bicarbonato di sodio all'8,4%
      2. 5 mL di 30 mmol/10 mL di cloruro di potassio
      3. 2,5 mL di solfato di magnesio da 20 mmol/10 mL
      4. 15 mL di destrosio al 50%
      5. 100 mg di nitroglicerina da 50 mg/10 mL
      6. 5000 U di eritropoietina fredda
    2. Prepara un totale di 3 L di soluzione per la cardioplegia e conserva la soluzione nell'incubatore pre-raffreddato.
  4. Mettere da parte il dissipatore isolante con un tubo in silicone integrato che consente un posizionamento ottimale dell'altezza verticale del cuore. Posiziona un segno nero di riferimento sul tubo in silicone nel punto che si trova direttamente sotto la punta dell'apertura sul coperchio del dissipatore.
  5. Metti da parte una cannula a coste per fissare e sospendere il cuore raccolto. Posizionare un segno di riferimento nero sulla superficie esterna della cannula per fungere da punto di allineamento riproducibile.

2. Procedura di raccolta

  1. Sedate l'animale usando una combinazione di telazolo, ketamina e xilazina mescolate in una singola siringa e somministrate per via intramuscolare, per minimizzare lo stress e il dolore associati a più iniezioni.
    1. Telazol (50 mg di tiletamina + 50 mg di zolazepam) a 4,4 mg/kg per ogni componente.
    2. Ketamina a 2,2 mg/kg.
    3. Xilazina a 2,2mg/kg.
  2. Intubare e anestetizzare l'animale.
    1. Volume tidale a 5-10 mL/kg.
    2. Frequenza respiratoria a 12-15 respiri al minuto.
    3. Pressione positiva a fine espirazione a 5 cmH2O.
    4. Isoflurano inalato allo 0,5-2% con un flusso di ossigeno di 1-2 L/min.
  3. Posizionare linee endovenose periferiche, eseguire una sternotomia e aprire il pericardio15. Somministrare antiaritmiche se necessario.
  4. Posizionare un ago per la cardioplegia nell'aorta ascendente, posizionandosi sopra la valvola aortica ma sotto l'arco aortico.
  5. Metti un punteggio e collega una busta da 1 L di soluzione per la cardioplegia all'ago.
  6. Ventila l'atrio sinistro, la vena cava inferiore e la vena cava superiore.
  7. Applica una pinza incrociale aortica prossimale all'arco.
  8. Avviare il flusso di cardioplegia attraverso le coronarie a una pressione di circa 75-80 mmHg. Monitora la pressione usando un manometro in linea.
  9. Raccogli il cuore mantenendo l'integrità anatomica.
  10. Versa soluzione salina pre-raffreddata sul cuore raccolto per raffreddarne rapidamente la superficie.
  11. Metti il cuore in una ciotola piena di soluzione fredda per la cardioplegia.
  12. Inserire una sonda per la temperatura miocardica all'apice del cuore e un termometro nella ciotola di soluzione cardioplegica per monitorare la temperatura.
  13. Separare l'aorta dall'arteria polmonare (PA).
  14. Fissa la cannula a costole nell'aorta usando fascette di seta e fascette a serratura, assicurandoti che la parte segnata della cannula corrisponda alla posizione del ventricolo sinistro (LV).
  15. Riempi il frigorifero con la soluzione Saint Thomas al 60-70% della capacità, poi trasferisci il cuore e la soluzione della ciotola nel frigorifero per un riempimento totale, massimizzando l'immersione.
  16. Misura e documenta la soluzione finale e la temperatura del tessuto.
  17. Fissa la cannula a scanale al coperchio del dissipatore con tubi in silicone al punto predefinito. Assicurarsi che i segni sulla cannula a coste e sul tubo in silicone siano allineati, in modo che il basso basso mantenga un'orientazione costante rispetto al coperchio quando il dissipatore è chiuso, garantendo una posizione riproducibile del basso basso per ogni scansione (Figura 1A).
  18. Svuotare l'organo per garantire un'omogeneità ottimale del campo RM e un buon rapporto segnale-rumore durante la raccolta dei dati RM.
  19. Chiudi il coperchio del raffreddatore, assicurandoti che l'allineamento delle valenze basse.
  20. Metti impacchi di ghiaccio e un frigorifero in una borsa da trasporto.

3. Protocollo di spettroscopia

  1. Questo protocollo è ottimizzato per uno scanner MR 3T. Lo scanner MR è dotato di un'opzione di spettroscopia multinucleo, inclusa una gamma amplificatrice e ricevitore a radiofrequenza a banda larga da 4 kW, compresa la bobina di fosforo fornita dal fornitore standard (P140). La bobina 31P è una bobina di trasmissione e ricezione a singolo anello di diametro 14 cm con due barre per accordatura e abbinamento.
  2. Avvisa il personale della struttura MRI prima del trasporto e conferma la disponibilità della scansione.
  3. Prepara una scatola di polistirolo con le seguenti dimensioni esterne: lunghezza 33,5 cm, larghezza 28 cm (bordo più lungo), larghezza 23 cm (bordo più corto) e spessore 4 cm. Realizzare una fessura di 3,3 cm di larghezza su un lato della scatola per permettere il posizionamento della bobina 31P adiacente al cuore (Figura 1B).
  4. Inserire il dissipatore con il cuore sospeso adiacente all'asse centrale della bobina, puntando alla posizione del basso livello (Figura 1C). Prepara un frigorifero alto 25,4 cm e largo 11,4 cm. Il tubo in silicone è fissato a una lunghezza di 7 cm dalla superficie interna del coperchio, nel punto di montaggio del cuore (Figura 1D).
  5. Posiziona le borse di ghiaccio negli spazi intorno al dissipatore, facendo attenzione a non creare spazio tra il dissipatore e la bobina, poi nastro del nastro sul coperchio della scatola per garantire stabilità durante la scansione (Figura 1E).
  6. Centra il raffreddatore sull'isocentro del magnete utilizzando le guide laser e il punto di riferimento di centraggio, per garantire l'omogeneità ottimale di B0 (Figura 1F).
  7. Collega la bobina da 31P al connettore di scansione e collega le aste di accordatura e corrispondenti alla bobina (Figura 1F).
  8. Acquisire immagini scout localizer tri-plane per verificare la posizione della bobina e la vicinanza ottimale del livello di tensione alla bobina 31P(Figura 2).
  9. Se il posizionamento LV è errato, ruota il coperchio del dissipatore e rifai la scansione scout.
  10. Acquisire una mappastatica B 0 per shimming localizzato di 2° ordine16 per garantire un campo magnetico uniforme nella regione di interesse richiesta per un'elevata qualità spettrale:
    1. Dopo l'acquisizione della mappaB 0, un "Shimtool"16 viene lanciato automaticamente con quella mappa caricata (Figura 3).
    2. Punti clic di un poligono levigato che delinea il muscolo cardiaco in tutte le fette (Figura 3A).
    3. Lo "Shimtool" esegue quindi un adattamento ai minimi quadrati vincolati per determinare la frequenza di risonanza localizzata e le correzioni del campo di primo (x, y, z) e di secondo ordine (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y 2)/2) (Figura 3C). Carica questi termini di correzione nello scanner e applicali alle scansioni successive.
  11. Prima dell'acquisizione MRS 31P, girare le aste di sintonia della bobina per garantire una sintonia ottimale della bobina a radiofrequenza e adattarne l'impedenza al sistema MR, massimizzando così l'efficienza della trasmissione del segnale e minimizzando le riflessioni nel sistema a radiofrequenza (Figura 4).
  12. Acquisire uno spettro MR iniziale non localizzato di 31P (tempo di ripetizione [TR]: 10 s, angolo di rotazione = 90° usando impulsi adiabatici B1-Insensitive Rotation-4 (BIR-4); tempo di eco [TE] = 0,1 ms; larghezza di banda = 3000 hertz (Hz); 1024 punti spettrali, 5 medie) per determinare la frequenza di risonanza al centro tra i picchi PCr e γ-ATP. Tempo totale di acquisizione: 50 s.
  13. Poi si acquisiscono spettri MR 31P completamente rilassati e non localizzati dopo aver regolato la frequenza di offset basandosi sul calcolo in 3,12 (TR: 16 s, angolo di rotazione = 90° usando impulsi adiabatici BIR-4; TE = 0,1 ms; larghezza di banda = 3000 Hz; 512 punti spettrali, 20 medie). Tempo totale di acquisizione: 5 min 20 s.
  14. Dopo la scansione, misurare il liquido e le temperature miocardiche; assicurando che la deviazione dal bersaglio sia di ≤1 °C.
  15. Conserva il cuore nell'incubatore alla temperatura desiderata fino alla prossima scansione programmata.

4. Analisi dei dati

  1. Esporta i dati MRS 31P completamente rilassati come . SDAT e caricati in un'interfaccia grafica per l'elaborazione (Figura 5A)17.
  2. Innanzitutto, si possono appodizzare gli spettri usando un filtro lorentziano a 15 Hz (Figura 5B), poi applicare uno sfasamentodi ordine 0 e 1, e impostare la frequenza a 0 parti per milione (ppm) al centro del picco PCr (Figura 5C).
  3. Adatta gli spettri usando la funzioneAMARES 18 utilizzando i valori di conoscenza elencati nella Tabella 1.
  4. Rivedere l'analisi per un adeguato adattamento nella finestra successiva (Figura 6), assicurandosi che ogni picco sia correttamente identificato (singoli componenti) e che rimanga un minimo segnale residuo dopo l'analisi (residuo).
  5. Calcola i rapporti dei metaboliti miocardici PCr/ATP e PCr/Pi in base all'ampiezza di picco spettroscopica (Figura 7). La risonanza γ-ATP viene utilizzata come misura dell'ATP.
  6. Calcola il pH intracellulare basandosi sullo spostamento chimico tra Pi e PCr dopo la regolazione, per riflettere la condizione di temperatura14.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa dopo ogni risonanza magnetica (passo 3.15). Assicurati che il controllo della temperatura sia mantenuto per tutto il tempo.

5. Equazioni

  1. Calcolare il pH intracellulare (pHi) come descrittoin precedenza 19:
    Equazione 1
    Dove T è la temperatura in °C, e δ0 è la differenza di spostamento chimico osservata tra le risonanze PCr e Pi, in ppm.

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Risultati

La calma localizzata del 2° ordine16 ha prodotto un campo magneticoB0 più omogeneo nella regione di interesse, come indicato da una riduzione della deviazione standard in ogni punto temporale (0 h: 14,0 a 4,0 Hz; 4 h: 17,5 a 3,2 Hz; 8 h: 16,0 a 3,2 Hz). Questo garantiva che si ottenesse un'eccellente qualità spettrale in ogni momento (Figura 7). I cambiamenti metabolici miocardici durante la conservazione a freddo ex vivo indicano un rap...

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Discussione

Questo manoscritto descrive una preparazione chirurgica e un protocollo di acquisizione e analisi MRS a 31P per la valutazione seriale dell'energetica miocardica durante la conservazione cardiaca. 31La P MRS consente una valutazione seriale e non distruttiva dei metaboliti cardiaci chiave a diverse temperature di conservazione a freddo, fornendo nuove intuizioni sulla vitalità metabolica del tessuto miocardico. Questo protocollo MRS a 31P è relativamente ...

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Dichiarazioni

Non abbiamo alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare il nostro team di Johns Hopkins nel dipartimento di chirurgia cardiaca e radiologia per aver contribuito a portare avanti con successo questa ricerca. Questo studio è stato finanziato dall'American Association for Thoracic Surgery (AATS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IncubatoreBenchmark Scientific H2265-HCIncubatore di riscaldamento e raffreddamento MyTemp 65HC
Raffreddatore isolanteGatoradeUPC 052000047097Raffreddatore per bevande sportive isolate Gatorade
jMRUI versione 7.0Giavawww.jmrui.euInterfaccia grafica utente per l'analisi dei dati
Sonda miocardica per la temperaturaDeRoyal81-030415Sonda miocardica DeRoyal serie 400 (15mm)
Scanner a risonanza magneticaPhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Bobina di fosforo a singolo loopPhilips Healthcare & nbsp;https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

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