Metodo di Interazione DNA-DNA con Cromatina Associata a RNA

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per catturare le interazioni DNA-DNA cromatina associate all'RNA per mappare l'organizzazione genomica tridimensionale correlata all'RNA.

Abstract

Il Metodo di Interazione DNA-DNA (RDD) con Cromatina Associata a RNA è una strategia mirata per mappare le interazioni della cromatina ancorate da un RNA specifico. Contemporaneamente identifica i loci genomici associati all'RNA di interesse e risolve i contatti a lungo raggio DNA-DNA tra questi loci, permettendo di inferire l'organizzazione spaziale e le relazioni regolatorie. Nella RDD, sonde antisenso biotinilate complementari all'RNA target vengono utilizzate per arricchire i complessi RNA-cromatina. Le cellule sono reticolate, la cromatina è frammentata e riparata terminalmente, e la legatura di prossimità viene eseguita utilizzando un collegamento progettato per unire frammenti di DNA che sono spazio-adiacenti all'interno dei complessi catturati. I prodotti di legazione vengono purificati, convertiti in librerie di sequenziamento e analizzati tramite sequenziamento ad alto rendimento per generare mappe di interazione ancorate all'RNA. La RDD è applicabile sia agli RNA endogeni che agli RNA esogeni derivati da microrganismi e virus infettanti dall'ospite, ed è compatibile con diversi tipi cellulari e condizioni sperimentali. Il metodo produce profili di contatto ad alta risoluzione specifici per locus, adatti per dissezionare l'accoppiamento potenziatore-promotore, la regolazione a lungo raggio e l'architettura genomica tridimensionale associata a RNA regolatori codificanti e non codificanti. Integrando l'arricchimento biochimico con la ligatura di prossimità e il sequenziamento di nuova generazione, RDD fornisce un flusso di lavoro robusto e riproducibile per mostrare come gli RNA organizzino la cromatina e influenzino l'espressione genica.

Introduzione

Hi-C e ChIA-PET hanno trasformato studi sull'organizzazione genomica tridimensionale (3D) convertendo la vicinanza spaziale tra frammenti di cromatina in giunzioni covalenti di DNA che possono essere sequenziate per dedurre contatti fisici su scale che vanno dagli anelli ai compartimenti ^1,2. Oltre alle proteine, numerosi RNA partecipano alle interazioni con la cromatina, influenzando la comunicazione tra potenziatore/repressore e promotore e l'organizzazione della cromatina^{di ordine superiore 3}; tuttavia, nonostante i progressi negli saggi ancorati a proteine, rimane difficile determinare direttamente come uno specifico RNA organizzi le interazioni a lungo raggio DNA-DNA tra i suoi loci legati. L'obiettivo generale del Metodo di Interazione DNA-DNA (RDD) con Cromatina Associata a ^RNA4 è generare mappe di interazione cromatina ad alta risoluzione, ancorate all'RNA, che rivelano come una specie di RNA definita si associa alla cromatina e orchestri i contatti DNA-DNA all'interno del suo vicinato locale, consentendo un'inferenza meccanicistica sulla comunicazione potenziatore/repressore-promotore e sull'architettura genomica di ordine superiore centrata su quell'RNA⁵. Metodologicamente, la RDD arricchisce complessi RNA-cromatina reticolati con sonde antisenso biotinilate contro l'RNA di interesse, esegue legazione di prossimità su complesso con un linker progettato per unire frammenti di DNA spazioamente adiacenti e costruisce librerie di sequenziamento per ottenere profili di contatto specifici per il locus, adatti ad analisi basate su ipotesi su diversi tipi e condizioni cellulari, inclusi contesti che coinvolgono RNA batterici o virali esogeni in ospiti infetti. Queste caratteristiche posizionano la RDD come controparte ancorata all'RNA ai metodi consolidati di conformazione cromosomica, fornendo informazioni di contatto interpretabili a risoluzioni appropriate per l'analisi regolatoria.

La motivazione della RDD deriva dalle limitazioni delle strategie esistenti di mappatura RNA-cromatina. Approcci di cattura mirata come ChIRP-seq e CHART-seq identificano l'occupazione genomica del DNA a livello genomico di un singolo RNA, un paradigma di un RNA per tutto il DNA che riporta il legame ma non i contatti fisici DNA-DNA tra loci^{occupati 6,7}. Analisi globali, inclusi GRID-seq e MARGI, si sono estese a tutto l'RNA di tutto il DNA, catalogando le prossimità RNA-DNA a livello genomico ma senza una risoluzione esplicita dei contatti DNA-DNA all'interno dei complessi^{RNA-centrati 3,8}. Metodi multiplexati come RD-SPRITE riportano una co-localizzazione di ordine superiore tra molti RNA e loci di DNA e trasmettono aspetti della topologia^{nucleare 9}, ma i segnali sono tipicamente dominati da RNA abbondanti, che possono oscurare RNA regolatori a bassa abbondanza e limitare la profondità mirata per la rete di interazione di un singolo RNA. Le strategie di arricchimento più ligatura ancorate a proteine o marca, come ChIA-PET¹⁰,^{PLAC-seq 11} e HiChIP¹², mappano efficacemente anelli centrati sui fattori ma non ancorano le interazioni a un RNA definito senza un modulo di cattura specifico per RNA, lasciando irrisolta la dimensione DNA-DNA ancorata all'RNA. Integrando l'arricchimento biochimico mirato con la legazione di prossimità su complesso, RDD cattura direttamente i contatti DNA-DNA tra frammenti di cromatina cooccupati dall'RNA di^{interesse 4}, aumenta la sensibilità e la specificità per RNA di bassa a moderata abbondanza e genera mappe di contatto ad alta risoluzione specifiche per il luogo che completano i metodi globali incentrici sull'occupazione (ChIRP/CHART)^6,7 e quelli incentrati sulla prossimità (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3. 8,9} mentre parallelizza concettualmente strategie di ligatura ancorate ai fattori proteici (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP⁾10,11,12. I lettori dovrebbero considerare la RDD quando una questione biologica richiede di risolvere le relazioni spaziali tra loci di cromatina specificamente associati a un RNA bersaglio — in particolare quando si ipotizza che quell'RNA possa fare impalcatura, collegare o vincolare interazioni genomiche a lungo raggio per affinare la trascrizione — oppure quando si danno priorità a presunti bersagli regolatori dal gruppo di legame di un RNA, distinguendo i centri diretti sull'RNA dalla semplice co-occupazione, delineare reti potenziatrici/repressori per RNA specifici, o monitorare il riconnessione di contatti ancorati all'RNA attraverso perturbazioni, fasi di sviluppo o infezioni. In tali scenari, la RDD risponde a un bisogno non soddisfatto fornendo informazioni di interazione DNA-DNA ancorate all'RNA con la sensibilità, specificità e risoluzione richieste per studi meccanicistici rigorosi.

Protocollo

NOTA: Per questo metodo RDD, il sistema di esempio utilizza cellule Drosophila S2 e sia gli ncRNA roX2 che 7SK ; I reagenti di reazione sono elencati nella Tabella 1, le composizioni dei tamponi nella Tabella 2, i dettagli dei reagenti e quelli degli strumenti sono nella sezione Materiali . La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo per la generazione delle librerie RDD. Le procedure che coinvolgono la rotazione (F8) utilizzano i seguenti parametri: F8, 20 rpm, uu20 e UU30. Per tutti i tamponi utilizzati dallo Step 2 al Step 10, integrare frescamente con 1x inibitore della proteinasi (PI) e RNase inhibitor (RI, 0,05 U/μL).

Principi di progettazione delle sonde: Per RNA nuovo e non riportato, progettare le sonde online con il progettista Stellaris, poi filtrare sequenze non specifiche utilizzando strumenti di allineamento (ad esempio, allineamento simile a BLAST) o UCSC BLAT, seguito dalla 3′-biotinilazione delle sonde selezionate. Per nuovi RNA bersaglio, progettare sequenze che corrispondano all'RNA bersaglio per fungere da controlli negativi, anch'essi sottoposti a 3′-biotinilazione. Il controllo qualità prevede la progettazione di primer per trascrizione inversa contro l'RNA bersaglio per la validazione della trascrizione e primer genomici destinati al DNA per la qPCR per valutare la contaminazione; includono primer che individuano i siti di legame genomici e le regioni non legate per valutare la specificità del legame. Le sonde correlate a roX2 e 7SK sono fornite nella Tabella 1.

1. Raccolta cellulare e doppio reticolamento

1. Coltivare cellule S2 di Drosophila a 27 °C. Punta a raccogliere un totale di circa 3 x 10⁹ cellule. Risospendere direttamente le cellule nel mezzo di coltura e, dopo il conteggio Trypan-blue, aggiungere 8 x 10⁸ celle in ciascun tubo centrifugo conico da 50 mL.
   1. Mescola 2 μL di cellule con 8 μL di DPBS, aggiungi 10 μL di Tripan Blue, e poi carica sull'emocitometro per il conteggio delle cellule.
      NOTA: Le cellule di Drosophila S2 sono presentate come esempio. Tipicamente, 8 x 10⁸ celle corrispondono a circa 40 mL di volume di coltura processati in un singolo tubo conico da 50 mL. Gli utenti possono regolare le condizioni di coltura e prelevare le quantità cellulari in base al tipo cellulare utilizzato e all'abbondanza dell'RNA bersaglio.
2. Aggiungi formaldeide a una concentrazione finale dell'1% (p/v) e ruota a 27 °C per 20 minuti.
   NOTA: Eseguire la fissazione alla temperatura di coltura o a temperatura ambiente (RT; 20-25°C). Salvo indicazione, ruota sul mixer (F1, 12 giri/min). Per le cellule aderenti, si utilizza uno shaker orbitale (50 rpm).
   ATTENZIONE: Il formaldeide è tossico; Usa una cappa assorbente.
3. Cellule pellet a 845 x g per 5 minuti a RT; Scartare il supernante sui rifiuti chimici/biologici appropriati. Il pellet cellulare di 8 x¹⁰ 8 cellule S2 ha tipicamente un volume di circa 1 cm^{e 3} .
4. Sospendere il pellet in un EGS appena preparato da 2 mM a un volume totale di 40 mL in DPBS, e ruotare a 27 °C per 40 minuti.
   NOTA: Dissolvere l'EGS in DMSO e trasferirlo in DPBS (vedi Tabella 2). L'EGS in DMSO è pericoloso.
5. Tempre aggiungendo 2 mL di glicina da 2,5 M (finale 0,125 M); ruota a 27 °C per 10 minuti.
6. Pellet a 845 x g per 5 minuti a RT; Scartare il supernante sui rifiuti chimici/biologici appropriati. Lavare due volte il pellet con 40 mL di DPBS preriscaldato a 27 °C.
7. Pellet a 845 x g per 5 minuti. Risospendere la pellet cellulare in 10 mL di DPBS e contare le cellule. I numeri cellulari possono diminuire durante il passaggio di reticolazione, tipicamente di circa il 30%.
8. Aliquota 1 x 10⁹ celle in ogni tubo da 50 mL; pellet a 845 x g per 5 minuti a RT; Scarta il soprantantante. Conserva i pellet a −80 °C.
   NOTA: Tutti i seguenti passaggi di reazione sono per una libreria RDD.

2. Lisi cellulare e permeabilizzazione dei nuclei

1. Prendi 1 x 10⁹ celle a doppio reticolatore dal congelatore a −80 °C. Scongelare con acqua ghiacciata per 30 minuti.
2. Risospendere le celle in 50 mL di DPBS, centrifugare a 845 x g per 5 minuti a RT e scartare il soprantantante.
3. Lisi cellulare: Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di buffer di lisi FA allo 0,1% (senza Triton X-100). Ruota a RT per 15 minuti. Verifica tramite microscopia; Regola il tempo in base al tipo di cellula. La lisi riuscita è indicata dalla permeabilizzazione della membrana plasmatica e dal rilascio citoplasmico, in modo che i nuclei diventino facilmente visibili come strutture distinte sotto un microscopio laser standard (Figura 2A).
4. Permeabilizzazione dei nuclei: Aggiungere 1,8 mL di SDS al 10% (1% finale). Ruota a 37 °C per 15 minuti. Centrifugare a 3.200 x g per 20 minuti a RT e scartare il soprantantante. Controlla tramite microscopia (Figura 2B); Regola il tempo in base al tipo di cellula. I nuclei appaiono più scuri, simili a membrane a velo, oppure alcuni sono staccati. Ripeti finché la lisi non è completa.
5. Lavaggio del nucleo: Sospensa il pellet in un buffer di lisi FA a 20 mL (senza Triton X-100), ruota a RT per 10 minuti, poi centrifuga a 3.200 x g per 20 minuti a RT, scartare il sovranante e segnare la dimensione del pellet del nucleo. Conservare il pellet dei nuclei a −80 °C per un uso successivo.

3. Frammentazione della cromatina

1. Risospendere il pellet dei nuclei in 15 mL di buffer di lisi FA allo 0,1% (con Triton X-100). Inserire 1,5 mL di sospensione dei nuclei in ogni provetta da 14 mL a fondo rotondo, evitando bolle.
   1. Segna la dimensione del pellet prima della sonicazione per confronto e ripeti la sonicazione se il pellet rimane grande dopo la sonicazione.
2. Sonica all'ampiezza del 38% per 4,5 minuti, con cicli di 30 s ON / 30 s OFF. Raccogli tutta la cromatina sonicata in un tubo da 15 mL e centrifuga a 3.200 x g per 20 minuti a RT, poi trasferisci il soprandanante (~13 mL) in un nuovo tubo da 15 mL.

4. Cromatina preclear con perle C1

1. Prepara le sfere di Streptavidina C1: Aliquota 400 μL di Streptavidina C1 si inserisce in un tubo da 1,5 mL (100 μL per 1 × 10 celle⁹ S2), posizionare sul magnete per 30 secondi e rimuovere il soprantantante. Lavare due volte con 200 μL di buffer di lisi FA allo 0,1% (con Triton X-100), poi risospendere in 100 μL di buffer di lisi FA allo 0,1% (con Triton X-100).
2. Preclear della cromatina: Aggiungere i 100 μL di sfere preparate di Streptavidina C1 nel tubo contenente ~13 mL di sovrantaente di cromatina sonicata (dal Passo 3.2); ruotare 20 minuti a RT; mettere su un rack magnetico per 1 minuto e trasferire il soprannatante (cromatina pre-cleared) in nuovi tubi da 50 mL; prendere 10 μL e conservare a −20 °C per QC1 (Figura 3A).

5. Ibridare la sonda RNA con la cromatina pre-cleared

1. Aggiungere 2 volumi (26 mL) di tampone di ibridazione appena preparato a 1 volume (13 mL) di cromatina pre-cleared; ruota 30 minuti a RT.
2. Aliquota la miscela in tre tubi da 15 mL; aggiungere 6 μL di sonde biotinilate da 100 μM (oligonucleotide del DNA, Tabella 1) a ciascun campione (2 μL per tubo da 15 mL); ruotare a 37 °C durante la notte. Sigilla i tappi dei tubi con pellicola.

6. Immobilizzare la sonda - complesso di cromatina su perle C1

1. Bloccare le sfere di Streptavidina C1 con tampone bloccante: Prendere 400 μL di sfere fresche di Streptavidina C1 e lavare due volte con 800 μL di tampone di lisi FA allo 0,1% (senza Triton X-100); aggiungere 400 μL di Blocking Buffer e incubare su un mixer (F8) per 30 minuti a RT. Posizionare su un magnete per 10 minuti e scartare il sovrantante; lavare tre volte con 800 μL di buffer di lisi FA allo 0,1% (senza Triton X-100). Per ogni lavaggio, si sparge delicatamente per mescolare con pipetta, si applica sul magnete per almeno 30 secondi, poi si elimina il soprandante.
2. Risospendere le sfere C1 in 400 μL di buffer di ibridazione.
3. Immobilizzare il complesso sonda-cromatina sulle perle di Streptavidina C1: Aggiungere le sfere di Streptavidina C1 trattate con Blocking Buffer alla corrispondente cromatina ibridizzata e ruotare per 2,5 ore a RT.
4. Trasferire la reazione di immobilizzazione da tubi da 15 mL a un tubo da 1,5 mL utilizzando un rack magnetico. Posizionare ogni tubo da 15 mL su un rack magnetico per 5 minuti; Rimuovi il soprantantante. Sospezione delle perne con 1 mL di buffer di lavaggio e trasferimento su un nuovo tubo da 1,5 mL.
5. Lava le perle cinque volte con 800 μL di buffer di lavaggio, poi due volte con il buffer TE. Per lavare, aggiungi il tampone, incuba su un mixer (F1, 12 giri/min) per 5 minuti a 37 °C, posiziona su un rack magnetico per 30 secondi e scarta il surnadante.
6. Tieni le sfere in 1.000 μL di buffer TE (1x PI) a RT.

7. Bloccare i siti non occupati su perle C1 con Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB) denaturata

1. Sciogliere 4,8 mg di IPB in 400 μL di tampone di lavaggio IPB; ruota a RT per 15 minuti.
2. Soluzione β-ME: Aggiungere 1 μL di β-ME a 312 μL di H₂O; Mixa e ruota a RT per 15 minuti.
3. Denatura dell'IPB: Aggiungere 44 μL della soluzione β-ME a 400 μL di IPB; Mixa e ruota a RT per 15 minuti.
4. Bloccare le sfere C1: aggiungere 220 μL dell'IPB denaturato alle sfere C1 legate al complesso sonda-cromatina (in 1.000 μL TE); ruota a RT per 15 minuti.
5. Lava le perle C1 con TE cinque volte. Aggiungi il buffer, incuba su un mixer (F8) per 5 minuti a RT, poi posiziona su un rack magnetico per 30 secondi e scarta il soprandatante.

8. Riparazione finale della cromatina (sulle perline)

1. Aggiungere 693 μL di miscela di riparazione terminale alla cromatina sulle sfere C1 e mescolare bene; poi aggiungere 7 μL di DNA polimerasi T4.
2. Incubare su termomiscelatore (800 giri/min) a 12 °C per 30 minuti; poi sul mixer (F8) a 16 °C per 15 minuti.
3. Lavare le sfere tre volte con 800 μL di tampone ChIA-PET gelato, poi una volta con TE. Per ogni lavaggio, si sparge delicatamente per mescolare con pipetta, si applica sul magnete per almeno 30 secondi, poi si elimina il soprandante.

9. Cromatina A-tailing (sulle perline)

1. Aggiungi 693 μL di miscela per A-tailing alla cromatina sulle perle C1 e mescola bene, poi aggiungi 7 μL di frammento di Klenow (3'-5' exo-).
2. Incubare sul mixer (F1, 12 giri/min) a 37 °C per 50 minuti. Lavare le sfere tre volte con 800 μL di tampone ChIA-PET gelato, poi una volta con tampone per eluzione.

10. Legatura di prossimità della cromatina (sulle perle)

1. Aggiungi 1.390 μL di miscela per legatura di prossimità alla cromatina sulle sfere C1. Incubare sul mixer (F8) a RT per 5 minuti.
2. Poi aggiungi 10 μL di legasi di DNA T4. Ruota sul mixer (F8) a RT per 5 minuti, poi passa a F1 (12 giri/min) a RT per 50 minuti, seguito da 16 °C durante la notte.
3. Lavare le perline tre volte con 800 μL di buffer ChIA-PET gelato, poi due volte con tampone TE.

11. Rilascio del DNA della cromatina ligato in prossimità dalle sfere C1

1. Aggiungi 480 μL di tampone di eluzione LC ChIP alla cromatina sulle sfere C1, mescola bene e aggiungi 20 μL di 20 mg/mL di proteinasi K per la decrosslinking.
2. Incubare con termomiscelatore (950 giri/min) a 65 °C durante la notte.

12. Purificazione del DNA legato a prossimità (con fenolo: cloroformio: reagenti IAA)

1. Fai ruotare il tubo a blocco di fase ad alta densità a 13.500 x g per 2 minuti a RT. Aggiungi prodotti di de-reticolazione (500 μL) nel tubo a blocco di fase ad alta densità.
2. Aggiungere 500 μL di Fenolo:Cloroformio:IAA (usando una punta di pipetta da 5 mL) al tubo a blocco di fase ad alta densità. Mescola delicatamente a mano.
   ATTENZIONE: Esegui in una cappa a fumo.
3. Centrifuga a 13.500 x g per 6 minuti a RT. Durante la centrifugazione, preparare un tubo da 1,5 mL aggiungendo 52 μL di 3 M di acetato di sodio (pH 5,5) sul fondo. Mettere 1 μL di glicogeno con colorante blu sul tappo. Non mescolare o chiudere il tubo a questo punto.
4. Trasferire rapidamente il sovrantantante dal tubo a blocco di fase ad alta densità al tubo preparato da 1,5 mL.
5. Aggiungi 520 μL di isopropanolo gelato al tubo da 1,5 mL. Mescola delicatamente, poi lascia a -80 °C per tutta la notte.
6. Rimuovi il tubo da -80 °C e scongela a RT (~10 min). Centrifugare a 13.500 x g per ~1 ora a 4 °C per precipitare il DNA. Un pellet blu sarà presente sul fondo del tubo.
7. Lava la pellet di DNA con etanolo al 75% e rimuovi con cura il surnadante. Aggiungi 800 μL di etanolo gelato al 75%, centrifuga a 13.500 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovi il soprantantante. Ripeti il lavaggio all'etanolo una volta.
   ATTENZIONE: Rimuovere il sovrantantante immediatamente dopo la centrifugazione: prima con una punta da 1 mL, poi con una punta da 100 μL. I tubi caldi possono spostare la pallina blu.
8. Dopo l'ultimo lavaggio all'etanolo, centrifugare a 13.500 x g per 10 minuti a 4 °C per raccogliere eventuali residui di etanolo sul fondo, poi rimuovere con cura l'etanolo residuo.
9. Asciuga la pellet di DNA nel vuoto (tipicamente 1 min 30 s a 2 min). Risospendere il pellet di DNA in 10 μL di tampone di eluzione e incubare a RT per circa 2 ore. Quantificare il DNA utilizzando un quantificatore di acidi nucleici e valutare la qualità con un sistema automatico di elettroforesi capillare (Figura 3B-C).

13. Etichettatura con DNA Tn5 a vicinanza

1. Test di taglatura Tn5: Preparare un volume totale di reazione di 50 μL secondo la Tabella 1. In un tubo PCR su ghiaccio, aggiungere sequenzialmente 50 ng di DNA QC1, ddH₂O e 12,5 μL di tampone di taglatura 4x. Infine, aggiungi la quantità richiesta di enzima Tn5. Mescola delicatamente pipettando su e giù 10-20 volte dopo ogni aggiunta, evitando bolle. Fai girare brevemente il tubo se necessario.
   NOTA: Mescolare delicatamente ed evitare bolle è fondamentale per l'etichettatura. Inoltre, la quantità di Tn5 dovrebbe essere ottimizzata empiricamente per ottenere la distribuzione desiderata dei frammenti (prevalentemente 200 bp-1 kb), e gli utenti possono regolare la gamma di dimensioni regolando l'ingresso Tn5.
2. Reazione di taglamento: Incubare la reazione a 55 °C per 10 minuti in uno strumento PCR con il coperchio impostato a 70 °C, poi mantenere a 4 °C.
3. Rilascio di Tn5 e purificazione del DNA: Aggiungere 50 μL di tampone di eluzione ChIP e 1 μL di proteinasi K al DNA marcato (per una concentrazione finale di SDS dello 0,5%). Mescola e incuba sul termomiscelatore a 65 °C e 900 giri/min per 30 minuti. Purificare il DNA con un kit di purificazione del DNA e quantificare il DNA utilizzando un sistema automatico di elettroforesi capillare (Figura 3D).
   NOTA: In questa fase, i frammenti di DNA dovrebbero prevalentemente variare da 200 bp a 1 kb. Il rapporto enzima Tn5/DNA dovrebbe essere ottimizzato empiricamente.
4. Scala della Taglatura Tn5: Sulla base dei risultati del test Tn5, si amplia la reazione per il DNA legato in prossimità utilizzando le stesse condizioni. Dopo la tagmentazione, rimuovi il campione dallo strumento PCR e mettilo sul ghiaccio. Spina brevemente verso il basso, incuba a RT per 2 minuti, poi aggiungi 5,5 μL di SDS al 10% (peso e ritorno; concentrazione finale di SDS: 1%). Mescola pipettando su e giù 10-20 volte, evitando le bolle, e gira brevemente verso il basso. Incubare i campioni a 37 °C in uno strumento PCR per almeno 15 minuti. Il DNA marcato può essere conservato a -20 °C per diversi giorni.

14. Bloccare le perline M280

1. Prendi 20 μL di sfere M280 e lava due volte con 200 μL di 1x buffer B&N. Per lavare, aggiungere il buffer, risospendere le perline pipettando, girare brevemente verso il basso, posizionare sul magnete per 30 secondi e rimuovere il sovrantantante.
2. Blocco delle perle con buffer di bloccaggio: Sospensa le perle M280 in 100 μL di buffer di bloccaggio; ruota sul mixer (F8) a RT per 45 minuti.
3. Lavaggio delle perline: Gira brevemente verso il basso, metti sul magnete per 10 minuti e scarta il buffer di bloccaggio. Lava le perline due volte con 200 μL di 2x buffer B&N.
4. Blocco delle perle con DNA genomico: Sospensa le sfere in 100 μL di 2x tampon B&N, aggiungi 100 μL di DNA genomico tagliato (~500 ng, 300-500 bp), mescola bene e ruota sul miscelatore (F8) a RT per 30 minuti.
5. Scartare la miscela di DNA genomico e lavare le perline due volte con 200 μL di 1x tampone B&N.

15. Immobilizzazione del DNA ligato su perle M280

1. Legare DNA ligato alle sfere M280: Scartare 1x buffer B&N. Aggiungi tutto il DNA frammentato e ligato alle sfere M280, mescola e ruota sul mixer (F8) a RT per 45 minuti.
2. Gira brevemente verso il basso, metti sul magnete e scarta il soprannatante. Lavare le perline cinque volte con 500 μL di tampone di lavaggio preriscaldato a 37 °C; una volta con 500 μL di 1x B&N; e una volta con 200 μL di 1x B&N. Mettere sul magnete per 1 minuto, mescolare delicatamente sul fondo del tubo e scartare il soprandante. Aggiungi 30 μL di tampone di eluzione alle perle (non mescolare).
   1. Per lavare, aggiungi il buffer, incuba 5 minuti sul mixer (F8), metti sul magnete 30 s, poi scarta il soprantantante. Le sfere con DNA legato e ligato possono essere conservate a -20 °C.

16. Amplificazione del DNA ligato su perle M280

1. Prepara la reazione PCR (secondo il kit di preparazione della libreria del DNA). Trasferisci i tubi PCR alla macchina PCR e imposta il programma.
   NOTA: I cicli di amplificazione PCR sono fondamentali per la qualità finale della libreria; l'aumento del numero di cicli riduce la complessità della libreria. Ottimizzare empiricamente il numero di cicli e generalmente non superare i 15 cicli.
2. Purificare il prodotto PCR usando sfere magnetiche (Figura 3E). Selezione delle dimensioni: Utilizzare perle magnetiche (0,8-0,61) per selezionare la doppia dimensione della libreria RDD.
   1. La libreria finale di DNA dovrebbe prevalentemente variare da 250 a 600 bp (Figura 3F). Assicurarsi che 10-30 ng di DNA della biblioteca vengano misurati tramite quantificatore di acidi nucleici per il sequenziamento.
3. Sequenziamento: soggetto per sequenziamento Illumina con 2x 150 bp. La profondità di sequenziamento dipende dall'espressione dell'RNA, dalla densità del sito di legame e dai modelli genomici a livello genomico. Qui, roX2 satura a ~23M letture e 7SK a ~8M leture, quindi quest'ultimo necessita di meno profondità. Inizia per specie, poi valuta la ridondanza per eventuali profondità extra: ~5M per Drosophila, ~20M per umano/topo, aggiustando con metriche QC.

Risultati

Questo protocollo delinea il metodo RDD per rilevare le interazioni DNA-DNA associate alla cromatina a RNA. Il flusso di lavoro inizia con l'arricchimento biochimico dei complessi RNA-cromatina utilizzando sonde biotinilate, seguito da una legazione di prossimità per collegare frammenti di DNA spazioamente adiacenti. Dopo aver costruito librerie di sequenziamento, viene eseguita una sequenziazione ad alto rendimento.

L'analisi bioinformatica dei dati RDD è semplificata dalla piattaforma^{ChIA-PIPE 13}. I passaggi chiave di questa pipeline analitica includono: tagliare i linker di sequenziamento dalle letture grezze, mappare le letture a coppie al genoma di riferimento, filtrare coppie di letture mappate in modo univoco, rimuovere duplicati PCR e assegnare interazioni ai siti RNA target basandosi sulle coordinate della sonda. Tipicamente, circa il 50% delle letture sequenziate viene mantenuto con successo dopo il filtraggio di linker e qualità. Gli eventi di interazione validi sono stati poi aggregati per generare mappe di contatto specifiche per locus, fornendo profili dettagliati dell'architettura della cromatina guidata da RNA. Per i dati RDD, abbiamo implementato tre aggiustamenti ChIA-PIPE: la sequenza del linker DDD ("ACGCGATATCTTATCTGACT") è stata utilizzata al posto del linker ChIA-PET predefinito ("ACGCGATGGCTACTCTGACT"); il clustering a loop veniva eseguito con un'estensione PET accorciata di 50 bp oltre ai 500 bp predefiniti per aumentare la precisione posizionale dei siti di interazione con l'RNA; e la copertura di arricchimento RNA è stata calcolata con deepTools (bamCoverage v3.5.1) utilizzando una dimensione di 1 bp bin. Queste modifiche - configurazione del linker, riduzione dell'estensione PET per clustering più fine e ChIA-PIPE ad alta risoluzione adattato alla copertura per le librerie RDD.

La Figura 4 mostra risultati rappresentativi della RDD per due RNA non codificanti: roX2¹⁴ (Figura 4A,C; verde), un complesso di RNA di compensazione del dosaggio coinvolto nella regolazione della struttura e dell'espressione genica del cromosoma X in Drosophila, e 7SK¹⁵ (Figura 4B,D; viola), un piccolo RNA nucleare altamente conservato che modula l'allungamento della trascrizione regolando l'attività P-TEFb nei metazoi. Le interazioni di legame all'RNA e cromatina rilevate dalla RDD sono visualizzate insieme ai dati RNAPII ChIA-PET (archi blu), evidenziando la relazione strutturale tra i loop associati all'RNA e gli elementi regolatori chiave come promotori (P), potenziatori (E) e siti di inizio o fine della trascrizione (TSS/TES). I picchi di interazione prominenti nei dati aggregati supportano un modello in cui sia roX2 che 7SK mediano contatti critici potenziatore-promotore o cromatina a lungo raggio.

L'analisi multidimensionale si ottiene integrando interazioni ancorate alla RDD con mappe di conformazione della cromatina genomica a livello genomico Hi-C (mappe di calore rosse del pannello inferiore) e segni epigenomici (H3K27ac, H3K27me3), trascrizione nascente (RNA-seq) e dati RNAPII ChIA-PET (Figura 4C,D). In queste regioni, i domini topologicamente associati (TAD) sono chiaramente visualizzati, con anelli di cromatina guidati da RNA spesso situati ai confini TAD o che si estendono su più TAD. Ulteriori annotazioni con dati di modifica degli istoni e trascrizione permettono la discriminazione tra regioni attive e inattive della cromatina. I principali centri regolatori incentrati sull'RNA sono cerchiati nella figura.

Emergono schemi distinti per diversi ncRNA. roX2 è caratterizzato dal legarsi nelle regioni TES e per il looping verso TSS, localizzandosi frequentemente ai confini TAD e formando contatti a lungo raggio che possono attraversare più TAD. Al contrario, 7SK si lega prevalentemente agli enhancer e forma loop a corto raggio con promotori vicini, generalmente senza attraversare i confini del TAD.

Collettivamente, questi risultati confermano che la RDD è un metodo affidabile e ad alta risoluzione per dissezionare la cromatina 3D specifica per RNA. Questo approccio consente un'indagine diretta sui ruoli spaziali degli RNA regolatori nell'architettura genomica e nell'espressione genica in diversi contesti biologici.

Figura 1: Schema del flusso di lavoro di generazione della libreria RDD. I passaggi centrali del flusso di lavoro per la generazione delle librerie RDD sono mostrati in sequenza e accompagnati da illustrazioni schematiche corrispondenti. La procedura inizia con doppio reticolamento e marcatura della cromatina, seguita da ibridazione con una sonda di RNA modificata con biotina e immobilizzazione tramite streptavidina. I passaggi successivi includono il taglio A, la legazione di prossimità con linker modificati con biotina e la costruzione di librerie. Dopo la legatura del DNA, vengono eseguite la purificazione, la frammentazione mediata da Tn5, l'arricchimento della biotina e l'amplificazione della libreria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini microscopiche rappresentative delle cellule di Drosophila S2 che dimostrano criteri visivi di controllo qualità per la lisi cellulare e la permeabilizzazione dei nuclei. (A) La lisi cellulare di successo è caratterizzata dalla permeabilizzazione della membrana plasmatica e dal rilascio citoplasmatico, rendendo i nuclei facilmente visibili. (B) La permeabilizzazione riuscita dei nuclei è indicata dal gonfiore cellulare, dal distacco parziale della membrana plasmatica e da nuclei intatti e chiaramente visibili. Barra della scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi elettroferografica delle preparazioni di cromatina. Screenshot di un sistema di elettroforesi capillare che analizza diversi campioni di cromatina. (A) Mostra cromatina frammentata (sonicazione) con dimensioni che variano da circa 1000 a 3000 bp, indicando una frammentazione riuscita a risultare. (B) Illustra la cromatina associata all'RNA (associate all'RNA + sonde non legate), con un picco minore che rappresenta le sonde non legate, come indicato dalla freccia. (C) Mostra cromatina associata all'RNA, con anch'essa un intervallo di concentrazione da 1000 a 3000 bp, riflettente complessi RNA-proteina. (D) Rappresenta la cromatina contrassegnata con Tn5, rivelando un intervallo indicativo dell'efficienza della tagmentazione. (E) Mostra la distribuzione delle dimensioni dei frammenti della libreria di sequenziamento dopo amplificazione, che copre circa 180-1000 bp. (F) Mostra la distribuzione delle dimensioni dei frammenti della libreria di sequenziamento dopo la selezione delle dimensioni, con frammenti prevalentemente arricchiti nell'intervallo di ~250-600 bp. I valori RFU (unità relative di fluorescenza) sono indicati per ogni campione, dimostrando una quantificazione efficace dell'integrità e della dimensione della cromatina. Le cime viola rappresentano il marcatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi della RDD per le interazioni con la cromatina associate a ncRNA. (A-B) Mostra le posizioni genomiche del legame ncRNA roX2 (verde) e 7SK (viola), insieme ai corrispondenti cicli di interazione remoti della cromatina. I dati di RNAPII ChIA-PET (blu) rivelano una chiara relazione regolatoria tra questi ncRNA e l'espressione genica, con picchi che indicano la forza dell'interazione. Abbreviazioni: TSS = sito di inizio della trascrizione; TES = sito finale della trascrizione; P = promotore; E = potenziatore. (C-D) Fornisce una visione in dimensioni più alte della relazione tra ncRNA roX2 e i loop di cromatina correlati a 7SK e i TAD (rosso), nonché dei diversi stati attivi e inattivi della cromatina e dei livelli di espressione genica. I cerchi evidenziano le aree con interazioni significative tra i TAD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Reagenti di reazione RDD. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Composizioni buffer RDD. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Fasi critiche del metodo
Stimare la quantità di sonde di RNA e i corrispondenti livelli di RNA nella cromatina è fondamentale. Un eccesso di sonde può portare a sonde non legate che occupano siti di streptavidina durante la fase di immobilizzazione, il che può ostacolare la prevista cattura delle interazioni con l'RNA bersaglio. Inoltre, aggiungere troppa streptavidina spreca materiali e richiede un IBP più denaturato per bloccare efficacemente i siti vuoti. Un blocco insufficiente può influire negativamente sull'efficienza della successiva ligazione di prossimità, soprattutto perché anche il collegatore di legazione di prossimità presenta modifiche alla biotina. Se il blocco non viene eseguito adeguatamente, alcune porzioni del linker possono legarsi direttamente alle sfere di streptavidina, complicando i risultati. Inoltre, il rapporto tra linker e cromatina deve essere stimato con attenzione: un eccesso di linker può causare il marcaggamento di entrambe le estremità del DNA della cromatina, inibendo la legatura efficace di prossimità.

Modifiche del metodo
In questo studio, illustriamo il metodo RDD utilizzando cellule Drosophila S2 con ncRNA roX2 come esempio. I volumi dei reagenti necessitano di una regolazione in base al tipo cellulare e ai livelli di espressione di ncRNA; se l'espressione dell'ncRNA è elevata, si può ridurre la quantità cellulare o aumentare la concentrazione di RNA nella sonda, e viceversa. Sebbene questo protocollo immobilizzi la cromatina sulle sfere, un approccio alternativo prevede la legazione di prossimità in situ seguita da un arricchimento con sonde RNA.

Specificità, controlli e controllo qualità
In precedenza abbiamo descritto e validato RDD ed eseguito RDD paralleli su più RNA, mostrando una forte specificità; I lettori possono fare riferimento all'opera^{precedente 4,16}. La RDD richiede un arricchimento dipendente dalla sonda, specifico per il locus, riproducibile e, dove possibile, convalidato ortogonalmente. Le interazioni vere soddisfano tre criteri: arricchimento nei loci mirati alla sonda rispetto alle regioni non legate vicine; dipendenza dalla sonda (assente o notevolmente ridotta nei controlli negativi); e riproducibilità tra repliche biologiche e validazione indipendente (ad esempio, RT-qPCR). Le sonde antisenso sono state progettate con Stellaris, selezionate da BLAST/BLAT per rimuovere i bersagli, ordinate con 3'-biotina e validate da RT e qPCR (inclusi controlli di contaminazione del DNA e arricchimenti tra sito e non sito). Raccomandiamo tre controlli — senza sonda, scramble/non targeting, e sonde a RNA non correlati o non a regione di legame — e valutiamo la specificità confrontando la copertura qPCR o sequenziamento tra campioni target e controlli, riportando l'arricchimento del pieghe e il background. Per RNA a bassa abbondanza, aumentare la densità delle sonde (entro vincoli fuori target), aumentare la profondità di sequenziamento ed eseguire la validazione ortogonale.

Risoluzione dei problemi del metodo
Se le interazioni RNA-cromatina catturate sono notevolmente basse, l'efficienza della legatura di prossimità potrebbe richiedere ottimizzazione tramite aggiustamenti delle quantità di linker e cromatina. Inoltre, sono stati osservati picchi elevati di sonde non legate tramite elettroferogrammi capillari automatici. I risultati indicano che sono state aggiunte troppe sonde, cosa che può essere risolta riducendo la quantità utilizzata.

Limitazioni del metodo
Un vantaggio chiave del metodo RDD è la sua efficienza nel catturare specifiche interazioni della cromatina associate all'RNA, il che significa che ogni esperimento può concentrarsi solo su un RNA specifico alla volta. Inoltre, poiché la legazione di prossimità è progettata per rilevare interazioni a coppie, non possono essere valutate contemporaneamente le interazioni tra più siti.

Importanza del metodo
Il metodo RDD non solo rivela i siti di legame dell'RNA, ma chiarisce anche le relazioni di interazione tra questi siti, migliorando la nostra comprensione dell'architettura della cromatina.

Usi pratici e potenziale futuro della RDD
La RDD è adatta a vari RNA associati alla cromatina, inclusi RNA ospiti endogeni e RNA esogeni provenienti da virus o altri microrganismi, evidenziando la sua ampia applicabilità in diversi campi di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M di acetato di magnesio	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
Tubi da 1,5 mL	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
10% SDS (in peso/volume)	Invitrogen	AM9822
10 e volte; Buffer di coda A	NEB	B7002S
10 e volte; Buffer di riparazione terminale	NEB	B6002S
10 e volte; T4 DNA ligase buffer	NEB	B0202S
10 e volte; Buffer TBE	Invitrogen	AM9863
Provette a fondo rotondo da 14 mL	Corning	352057
2 e volte; Mix master PCR	NEB	M0541
20 e volte; Buffer SSC	Invitrogen	AM9770
200-μ Tubi L PCR	Sangon Biotech	F611541-0010
Bottiglie di stoccaggio in PET quadrato da 250 mL	Corning	431531
2-Mercaptoetanolo (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! ATTENZIONE: β-ME è tossica; Usalo sempre in una cappa a fumo.
Tubi da 2 mL	Eppendorf	22431048
3 M Acetato di sodio pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M acetato di potassio	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Bottiglie quadrate in PET da 500 mL	Corning	431532
Bilanciamento analitico	Sartorius	BP211D
Contatore automatico delle celle	Counterstar	IC1000
Sistema automatico di elettroforesi capillare	Biottico	C100100
Sonde biotinilate	GENEWIZ		Consulta Tabella 1
Polvere bloccante	Invitrogen	T2015
Bridge linker oligos	GENEWIZ		Consulta Tabella 1
Incubatore CO2	Thermo Scientific	51033549
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
Kit di preparazione della libreria di DNA V2 per Illumina	Vazyme	TD501
Kit per la purificazione del DNA	Zymo	D4013
Dulbecco' S fosfato salino tamponato (DPBS) (1 e volte;)	Gibco	14190250
Cocktail inibitore proteasi privo di EDTA	Roche	11836170001
EGS (Etilenglicole bis[succini Midylsuccinate])	Thermo Scientific	21565
Buffer di eluzione	Qiagen	19086
Alcol etilico, puro	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Soluzione di formaldeide	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! ATTENZIONE: Il formaldeide è tossico; Usalo sempre in una cappa a fumo.
Formamide	Invitrogen	AM9342
Sistema di imaging a gel	Tanon	3500R
Glicina	Invitrogen	50046-1kg
Glicogeno con colorante blu	Invitrogen	AM9516
Cartuccia ad alta sensibilità	Biottico	C105105
Tubi a blocco di fase ad alta densità (1,5 mL)	Qiagen	129046
Kit di analisi fluorometrica ad alta sensibilità dsDNA	Invitrogen	Q32851
Index kit V2 per Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB)	Thermo Scientific	21334
Alcool isopropilico	Sigma-Aldrich	I9030	! ATTENZIONE: L'alcol isopropilico è tossico; Usalo sempre in una cappa a fumo.
Cartuccia a base di kilo	Biottico	C105106
Frammento di Klenow (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Perle magnetiche	Beckman	A63881
Rack di separazione magnetica & nbsp; per tubo da 15 mL	Invitrogen	12301D
Rack di separazione magnetica & nbsp; per tubo da 2 mL	Invitrogen	12321D
Rack di separazione magnetica per tubo PCR	NEB	S1515S
Incubatore microbiologico	Thermo Scientific	IMH180
Microscopio	Nikon	Eclipse TS2
Mixer	ELMI	RM-2L
N,N-Dimetilformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! ATTENZIONE: il DMF è tossico; Usalo sempre in una cappa a fumo.
Microcentrifuga non refrigerata	Eppendorf	5405000204
Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Quantificatore degli acidi nucleici	Invitrogen	D33226
Oscillatore orbitale	Cristallo	SYC-2102
Fenolo:Cloroformio:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Soluzione di proteinasi K	Invitrogen	AM2548
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	22628180
Incubatore refrigerato	Thermo Scientific	IMP180
Microcentrifuga refrigerata	Eppendorf	5404F1621754
Frigorifero	Haier	DW-25L262
Inibitore RNasi	Ambion	AM2696
Tubi da 15 mL senza RNasi	Invitrogen	AM12500
Tubi da 50 mL senza RNasi.	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Materiali	VCX130
Sfere magnetiche rivestite di sreptavidina C1	Invitrogen	65001
Sfere magnetiche rivestite di streptavinidina M-280	Invitrogen	11205D
T4 DNA ligasi	NEB	M0202S
DNA polimerasi T4	NEB	M0203S
pH del tampone TE 8.0	Invitrogen	AM9849
Thermal cycler	Bio-Rad	1851148
Termomiscelatore	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Congelatore a bassissima temperatura	Thermo Scientific	995
Concentratore a vuoto	TOMY	MV-100