Applicazione avanzata dell'elettroforesi capillare nella rilevazione di proteine monoclonali sieroniche ad alta risoluzione

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'analisi delle proteine sieriche ad alta risoluzione utilizzando elettroforesi capillare. Sotto un campo elettrico ad alta tensione, le proteine sieriste migrano attraverso un capillare in base alla carica e alla mobilità elettroforetica. L'elettroferogramma risultante consente il rilevamento, la localizzazione e la quantificazione dei picchi proteici monoclonali.

Abstract

L'immunoglobulina monoclonale, nota anche come proteina M o paraproteina, è prodotta dalla proliferazione clonale di cellule plasmatiche o linfociti B e funge da biomarcatore chiave per le gammopatie monoclonali. La rilevazione e la quantificazione accurate della proteina M sierica sono essenziali per la diagnosi precoce della malattia, la classificazione clinica e il monitoraggio terapeutico. Questo protocollo descrive un metodo che utilizza l'elettroforesi capillare (CE) per la separazione ad alta risoluzione delle proteine sieriche. Le proteine vengono separate in un tampone alcalino sotto elettroforesi ad alta tensione e rilevate tramite l'assorbenza ultravioletta, generando elettroferogrammi che permettono una chiara visualizzazione e quantificazione dei picchi anomali delle proteine monoclonali. Rispetto ai metodi tradizionali, il CE offre una risoluzione migliorata della regione beta e consente un'analisi automatizzata e rapida con requisiti minimi di gestione del campione. Cinque elettroferogrammi rappresentativi hanno dimostrato migrazione della proteina M nelle regioni β1, β2 e γ, con livelli di proteina M pari a 0, 44,1% (45,8 g/L), 10,5% (8,6 g/L), 35,5% (28,4 g/L) e doppi picchi del 41,3% (46,0 g/L) e 12,4% (13,8 g/L). In uno studio retrospettivo su 700 campioni clinici di siero, la CE ha raggiunto un tasso di rilevamento positivo del 51,86%, rispetto al 52,86% per l'elettroforesi da immunofissazione (IFE). Utilizzando l'IFE come metodo di riferimento, l'EC ha dimostrato una sensibilità del 92,70% e una specificità del 93,94%. Questi risultati hanno confermato che la CE è un approccio rapido e automatizzato per lo screening e la quantificazione della proteina M sieroica nei laboratori clinici di routine.

Introduzione

I disturbi correlati alla proteina M sono caratterizzati dalla presenza di un'immunoglobulina monoclonale (proteina M) nel siero e/o nell'urina. Queste proteine sono tipicamente secrete da plasmoci clonali o linfociti B e sono principalmente associate a discrasie di cellule plasmatiche maligne o gammopatie monoclonali^{benigne 1,2}. Lo spettro clinico di queste condizioni include gammopatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS), plasmocitoma solitario (SPC), mieloma multiplo fumante (SMM), mieloma multiplo (MM), leucemia delle cellule plasmatiche (PCL), macroglobulinemia di Waldenström (WM), amiloidosi sistemica a catena leggera (AL), linfoma non Hodgkin a cellule B (B-NHL) e altri disturbi linfoproliferativi a cellule B (LPD)³. Uno studio retrospettivo condotto in Spagna ha riportato che, tra queste condizioni, la MGUS è la più diffusa, rappresentando il 54,1% dei casi, seguita da MM (31,3%) e altre gammopatie maligne (14,6%). È anche importante notare che la proteina M può essere prodotta in risposta a determinate condizioni non neoplastiche, come la sindrome^{nefrotica 5}.

Il test della proteina M svolge un ruolo fondamentale nella diagnosi e nel monitoraggio dei disturbi correlati alla^{proteina M 6}. Tuttavia, la diagnosi precoce rimane una sfida clinica, poiché i pazienti con MM sono spesso asintomatici nelle fasi iniziali, portando a un ritardo della diagnosi in una fase relativamente avanzata della malattia. Circa l'1% degli individui con MGUS progredisce annualmente verso una condizione maligna, più comunemente verso MM, WM o^{SPC 7}. Sebbene si ritenga che quasi tutti i casi di MM evolvano dalla MGUS, meno del 10% dei pazienti con MM ha una storia documentata di diagnosi precedente di MGUS. Di conseguenza, l'identificazione tempestiva della proteina M nel siero e/o nelle urine può fornire indizi preziosi per una diagnosi precoce di questi disturbi, fondamentale per migliorare la sopravvivenza e la prognosi del paziente. Le ricerche indicano che i pazienti con MGUS identificati tramite screening attivo sperimentano meno complicazioni rispetto a quelli diagnosticati^{incidentalmente 8}. Durante il monitoraggio terapeutico, le informazioni riguardanti l'isotipo e il modello di migrazione elettroforetica della proteina M sono essenziali per distinguere tra la ricorrida della proteina monoclonale originale e l'emergere di bande oligoclonali o di una proteina M^{reattiva secondaria 9}. La comparsa di una nuova proteina M, spesso osservata dopo un trapianto autologo di cellule staminali, è generalmente considerata un indicatore prognostico favorevole per la maggior parte dei^{pazienti 10}. In linea con questa osservazione, i dati comparativi di sopravvivenza indicano che i pazienti che sviluppano una proteina M secondaria mostrano una sopravvivenza complessiva mediana di 115,3 mesi, a differenza di 31,0 mesi tra coloro che non lo^{fanno 11}.

L'elettroforesi proteica è una tecnica analitica altamente sofisticata. Sono disponibili diversi metodi per il rilevamento della proteina M sierica, tra cui elettroforesi proteica sierica (SPE), IFE, immunotipizzazione dell'elettroforesi capillare (IT), analisi a catena leggera libera (FLC), rilevamento a catena pesante e leggera (HLC) e spettrometria di massa (MS). Ogni approccio offre vantaggi distinti pur affrontando limitazioni intrinseche. La SPE può essere ulteriormente suddivisa in elettroforesi su gel di agarosio (AGE) e CE. AGE, che utilizza un mezzo a base di agarosio, è un metodo semplice ed economico adatto a una separazione e analisi rapide. Tuttavia, è limitata da una sensibilità relativamente bassa, con un limite tipico di rilevamento di 0,3-0,5 g/^{L 12}, che può portare al fallimento nel rilevare proteine M a basso volume o bassa concentrazione. Inoltre, la tecnica è suscettibile a piegamento e deformazione delle bande, che compromettono la riproducibilità.

L'IFE è ampiamente riconosciuto come il standard d'oro per la tipizzazione delle proteine M. Dopo l'elettroforesi iniziale, vengono applicati anticorpi specifici (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, κ, λ) per formare bande immunoprecipitate, consentendo l'identificazione del tipo di immunoglobulina e del sottotipo della catena leggera. L'IFE può rilevare la proteina M a concentrazioni basse come 0,05-0,15 g/L, fornendo una sensibilità superiore a 10 volte quella della SPE. Nonostante questo vantaggio, è necessario un pretrattamento specializzato per alcuni campioni, come quelli contenenti polimeri della proteina M, per garantire la dissociazione con β-mercaptoetanolo. Un trattamento inadeguato può portare a risultati fuorvianti. Inoltre, i pazienti sottoposti a nuove terapie combinate (ad esempio, regimi contenenti daratumumab, bortezomib, desametasone e talidomide/lenalidomide) possono fornire risultati IFE falsamente^{positivi 13}. Un limitamento chiave dell'IFE è che fornisce solo risultati qualitativi, poiché non può quantificare i livelli della proteina M ed è quindi inadatto al monitoraggio dell'efficacia^{terapeutica 14}. Tra i pazienti trattati, i risultati IFE possono rimanere positivi anche se la concentrazione di proteine M diminuisce durante il trattamento di successo.

Al contrario, l'IT impiega buffer capillari come mezzo di separazione, offrendo una risoluzione superiore rispetto all'IFE convenzionale. Tuttavia, il processo richiede faticose fasi di pretrattamento del campione, come la miscelazione degli antisiero, che prolungano il flusso di lavoro complessivo di rilevazione. Le FLC, che sono catene leggere immunoglobuline (κ e λ) non legate a catene pesanti, vengono quantificate direttamente nel siero tramite anticorpi che mirano ai loro epitopi della "zona nascosta", fornendo un'elevata sensibilità per la rilevazione di disturbi correlati alla catena leggera con un limite di rilevamento basso come 10–30 mg/L. Nella MM, livelli elevati di FLC sierici sono correlati al carico tumorale e permettono una valutazione più precoce della risposta al trattamento, grazie alla loro emivita più breve rispetto alle immunoglobuline^{intatte 15}. Tuttavia, la sua applicazione clinica dovrebbe essere combinata con altri metodi diagnostici, come l'elettroforesi, per escludere altre condizioni e garantire una valutazione completa. Ad esempio, una funzione renale compromessa può portare a livelli falsamente elevati della catena luminosa. Gli saggi HLC rappresentano un altro approccio quantitativo che utilizza anticorpi che mirano agli epitopi sia sulle catene costanti che leggere dell'immunoglobulina. Questo progetto consente la quantificazione separata delle coppie immunoglobuline specifiche per isotipo (ad esempio, IgGκ e IgGλ), e il rapporto HLC derivato funge da indicatore sensibile della clonalità. Tuttavia, i risultati possono essere influenzati dai livelli di immunoglobuline policlonali di fondo, e il metodo può essere meno affidabile nell'analisi di varianti complesse della M-proteina. La SM offre una sensibilità eccezionale e consente una caratterizzazione proteomica approfondita delle proteine M. Tuttavia, la sua applicazione è limitata da elevati costi di attrezzature, procedure analitiche lunghe e competenze specializzate richieste per l'interpretazione dei dati.

La CE è una potente tecnica analitica di separazione che impiega capillari elastici in silicea fusa come canali di separazione e un campo elettrico diretto ad alta tensione come forza motrice. Garantisce una separazione ad alta risoluzione sfruttando le differenze nella mobilità elettroforetica e/o nel comportamento di partizionamento degli analiti bersaglio. Dalla sua nascita, la tecnologia è passata da configurazioni a singolo capillare a array capillari ad alta produttività e dispositivi microfluidici miniaturizzati. Le sue applicazioni ora spaziano in campi diversi, tra cui analisi farmaceutica, diagnostica biomedica e clinica, test per la sicurezza alimentare e caratterizzazione^{bioterapeutica 16,17}. La CE è sempre più riconosciuta come uno strumento cruciale per lo screening e l'analisi quantitativa delle proteine M. Determina la percentuale di proteina M rispetto alla proteina totale, che può poi essere moltiplicata per la concentrazione totale di proteine per calcolare i livelli assoluti di proteine M. In particolare, il suo esito minimo di campioni lo rende particolarmente adatto per l'analisi di campioni preziosi o a volume limitato.

La CE offre tre vantaggi tecnici chiave. In primo luogo, la sua elevata sensibilità analitica (0,1–0,5 g/L) consente la rilevazione efficace delle proteine M a bassa concentrazione, riducendo così il rischio di diagnosi errate in condizioni come MGUS e malattie a catena leggera. In secondo luogo, il flusso di lavoro completamente automatizzato elimina gli errori di interpretazione soggettiva insiti nei metodi tradizionali di colorazione a base di gel. Infine, il tempo di analisi è significativamente ridotto a 15–20 minuti, nettamente più breve rispetto ai 60–90 minuti richiesti per l'elettroforesi convenzionale. Come tecnica analitica fondamentale tra l'elettroforesi a zona e la cromatografia liquida, la CE esegue la separazione elettroforetica in una soluzione libera. In un campo elettrico applicato, le molecole proteiche sono principalmente separate da un flusso elettroosmotico all'interno di un tampone alcalino a un pH specifico. Dopo la diluizione con un buffer dedicato, i campioni vengono iniettati all'anodo capillare ad alta tensione per avviare una separazione rapida ed efficiente delle proteine, e poi rilevati al catodo a 200 nm. Dopo ogni ciclo analitico, i capillari vengono sottoposti a pulizia automatica e a un rifornimento del tampone per processare i campioni successivi. La separazione delle proteine avviene nel seguente ordine: gamma-globulina, beta-2-globulina, beta-1-globulina, alfa-2-globulina, alfa-1-globulina e albumina, permettendo l'identificazione di anomalie in una o più frazioni di proteine sieriche. In particolare, il CE fornisce una risoluzione migliorata all'interno della regione beta, separandola distintamente in componenti globuline beta-1 e beta-2, fornendo così informazioni cliniche più^{dettagliate 18}. Guidata dall'integrazione dell'intelligenza artificiale e dai progressi continui nel rilevamento multiparametro, la CE è pronta a evolversi in una modalità di screening di prima linea per il rilevamento della proteina M. Pertanto, questo protocollo descrive l'uso dell'elettroforesi capillare per la rilevazione rapida, la localizzazione e l'analisi quantitativa delle proteine monoclonali sieroniche nei campioni clinici.

Protocollo

Il protocollo dello studio è stato esaminato e approvato dal Comitato di Revisione Etica dell'Ospedale Popolare Provinciale del Guangdong (Numero di approvazione: KY2025-176-01). Tutti i partecipanti hanno fornito un consenso informato scritto prima della raccolta del campione.

1. Preparazione dei materiali

NOTA: Il kit di reattivi deve essere conservato a 2–30 °C e ha una durata di conservazione fino a 3 anni.

1. Conservare il buffer di funzionamento a 2–8 °C e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso. Una volta aperta, la soluzione rimane stabile fino a 3 mesi. Usa questa soluzione come tampone corrente per la separazione delle proteine sieriche nell'elettroforesi capillare.
   NOTA: Il buffer di funzionamento è pronto all'uso con un pH di 9,9 ± 0,5. Il kit di reagenti contiene tre bottiglie da 700 mL di tampone alcalino utilizzate come tampone di riproduzione per la separazione delle proteine sieriche.
2. Diluire 75 mL di scorriaggio concentrato a 750 mL con acqua deionizzata prima dell'uso. Conserva la soluzione diluita per il risciacquo a temperatura ambiente. Una volta aperta, la soluzione rimane stabile fino a 3 mesi. Usa questa soluzione per pulire i tubi capillari dopo l'elettroforesi.
   NOTA: La soluzione per il risciacquo contiene idrossido di sodio ed è utilizzata per la pulizia dei capillari.
   ATTENZIONE: La soluzione per il risciacquo contiene idrossido di sodio, una sostanza corrosiva che può causare gravi ustioni. In caso di contatto visivo, risciacquo immediatamente con molta acqua e cerca assistenza medica. Se la pelle o i vestiti si contaminano, rimuovi immediatamente gli indumenti contaminati. Indossa sempre l'abbigliamento protettivo adeguato e usa protezioni per occhi e viso.
3. Conserva le coppe dei reagenti nella confezione sigillata originale a 2–30 °C in un luogo pulito e asciutto. Usa le coppe dei reagenti per la diluizione del campione su strumenti completamente automatizzati.
4. Conserva il filtro sigillato in un luogo asciutto a temperatura ambiente (15–30 °C). Usa i filtri usa e getta per filtrare le soluzioni tampone e l'acqua deionizzata.
5. Conservare la soluzione per la pulizia dei capillari (vedi Tabella dei Materiali) a 2–8 °C ed evitare le precipitazioni.
   NOTA: Ogni bottiglia di concentrato per la pulizia dei capillari (25 mL/bottiglia) contiene enzimi proteolitici, tensioattivi e altri additivi. Gli additivi non sono pericolosi alla concentrazione di applicazione e sono necessari per prestazioni ottimali. La soluzione previene l'ostruzione dei capillari e mantiene prestazioni ottimali.
6. Utilizzare acqua deionizzata filtrata con pori di dimensione ≤ 0,45 μm, conducibilità inferiore a 3 μS/cm e resistività superiore a 0,33 MΩ·cm. Cambia l'acqua ogni giorno per prevenire la contaminazione microbica. Usa quest'acqua per pulire i tubi capillari dell'analizzatore di elettroforesi.
7. Prepara una soluzione di ipoclorito di sodio contenente il cloro disponibile al 2–3%. Usa questa soluzione per la pulizia del campione e la sonda per rimuovere le proteine adsorbite. Conserva la soluzione clorurata funzionante a temperatura ambiente in un contenitore chiuso. La soluzione rimane stabile fino a 3 mesi. Non conservare vicino alla luce solare, al calore, alle fonti di accensione, agli acidi o all'ammoniaca.

2. Raccolta di campioni

1. Assicurati che i pazienti digiunino per almeno 8–12 ore prima del prelievo di sangue.
2. Chiedi ai pazienti di riposare in posizione seduta o supina per 10–15 minuti per stabilizzare l'emodinamica.
3. Prepara i seguenti materiali: aghi venosi usa e getta, tubi di raccolta del sangue a vuoto (tubi sieri), laccio emostatico, cotton cotton fioc sterili, disinfettante al 75% di alcol o iodoforo, benda adesiva medica e contenitore per rifiuti biologici.
   NOTA: La vena cubitale mediana nella fossa gomitata è il sito preferito per la puntura.
4. Applicare un laccio emostatico 3–5 cm sopra il punto della puntura per ingorgare adeguatamente la vena.
5. Disinfettare la pelle con alcol al 75% o iodoforo in un motivo centrifugo a spirale dal centro verso l'esterno, coprendo un'area di ≥5 cm di diametro, e lasciare che il disinfettante si asciughi naturalmente all'aria senza toccare nuovamente l'area.
6. Tieni l'ago con il bisello verso l'alto con un angolo di 15–30° rispetto alla pelle e perfora la parete della vena e della pelle in modo fluido.
7. Osservando il ritorno del sangue, fissa l'ago e collega il tubo a vuoto. Lascia che il sangue riempia passivamente il tubo sotto pressione negativa, senza compressione manuale, per prevenire l'emolisi.
8. Dopo la prelieva, prima rilascia il laccio emostatico, poi estrai delicatamente l'ago e applica subito pressione sul punto della puntura con un cotton fibun sterile per 3–5 minuti per garantire l'emostasi.
9. Posiziona il campione raccolto in posizione verticale a temperatura ambiente e lascia che il sangue coaguli naturalmente.

3. Valutazione della qualità del campione

1. Campioni di siero centrifugo a 2.095 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
2. Sottoporre i campioni di siero a una rigorosa valutazione della qualità visiva sotto una luce naturale adeguata su uno sfondo bianco uniforme.
3. Valuta l'emolisi esaminando il colore e la nitidezza del surnadante. Classificare come non emolisi se il soprantantante appare chiaro e giallo, mentre qualsiasi scolorimento rosa o rosso indica emolisi da lieve a grave.
   NOTA: L'emolisi può produrre una doppia zona alfa-2. La frazione di beta-2 può diminuire in campioni di siero invecchiati o impropriamente conservati.
4. Ispezionare interferenze fibrinogeniche controllando la presenza di filamenti di fibrina visibili, coaguli o reti gelatinose all'interno del soprandante, così come separazione di fase incompleta, opacità o segnali analitici incoerenti.
   NOTA: Il fibrinogeno migra in posizione beta-2 (spalla su beta-2 o sovrapposta alla zona beta-2, con un possibile aumento di questa frazione). In alcuni campioni (plasma, siero non completamente defibrinato o pazienti in trattamento anticoagulante), il fibrinogeno può interferire con l'analisi e portare a interpretazioni imprecise, come il sospetto di una banda monoclonale o un aumento della frazione di beta-2.
5. Escludere campioni che mostrano emolisi, interferenza da fibrinogeni o altre anomalie pre-analitiche una volta rilevate dall'analisi.
6. Prelevare un nuovo campione di sangue seguendo protocolli standardizzati di flebotomia e di elaborazione, garantendo un tempo di coagulazione adeguato e parametri di centrifugazione standardizzati. Utilizzare solo campioni con aspetto soddisfacente—trasparenti, privi di emolisi, fibrina, lipemia o contaminazione—per i test successivi.
7. Testare i campioni separati di siero il prima possibile a temperatura ambiente. Se non è possibile un test immediato, conservare i campioni a 2–8 °C per un massimo di 10 giorni e a -20 °C per un massimo di 30 giorni. Non congelare e scongelare ripetutamente i campioni.
   NOTA: Evita i campioni di plasma. Quando si analizzano campioni di plasma invecchiati (cosa non raccomandata), componenti labili come il complemento C3 si degradano nel tempo, quindi la zona beta-2 corrisponde essenzialmente al fibrinogeno.
8. Prima dei test, riporta i campioni alla temperatura ambiente e mescolali accuratamente. Assicurati che i campioni congelati siano completamente scongelati prima dell'uso.
   NOTA: Usa campioni di proteine sierie non diluite. Alcuni sieri refrigerati possono diventare viscosi o torbidi, in particolare quelli contenenti crioglobuline o criogel. Utilizzare direttamente campioni contenenti poliimmunoglobuline senza ulteriori pretrattamenti.

4. Procedure operative

1. Accendere l'analizzatore automatico di elettroforesi capillare (vedi Tabella dei Materiali) e il sistema informatico collegato. Aspettare che lo strumento sia completamente inizializzato.
   NOTA: La lunghezza capillare e il diametro interno sono rispettivamente 17,5 cm e 25 μm. La tensione di separazione varia da 8.000 a 10.000 V. Si utilizza l'iniezione elettrocinetica e la temperatura di separazione è mantenuta a circa 25 °C. Il tempo totale di esecuzione è di circa 10 minuti per campione.
2. Avvia il software PHORESIS (vedi Tabella dei Materiali) installato sul computer per l'elaborazione dei dati.
3. Dall'interfaccia software, seleziona il programma PROTEIN (E) 6 e poi inserisci la bottiglia buffer in funzione nello strumento.
   NOTA: Questo programma è un protocollo preimpostato calibrato in fabbrica specificamente progettato per la frazionazione delle proteine sieriche. Tutti i parametri sono preconfigurati nel software PHORESIS dello strumento senza necessità di modifiche manuali.
4. Se necessario, inserire la bottiglia di reagente contenente la soluzione detergente risolubilizzata all'interno dello strumento.
5. Montare una nuova coppa di reagente sulla piattaforma di caricamento automatica dell'analizzatore di elettroforesi capillare.
6. Installare una nuova cassa di rifiuti nella posizione standard di smaltimento dei rifiuti dell'analizzatore di elettroforesi capillare per le coppe di reagente usate.
7. Carica i rack dei campioni nell'analizzatore attraverso l'apertura sul lato destro (capacità massima: 15 rack).
   NOTA: Ogni rack può ospitare fino a 8 provette campione. Il codice a barre su ogni provetta deve essere visibile attraverso l'apertura del rack.
8. Usa il sample rack n. 0 per il siero di controllo. Utilizzare il controllo qualità di terze parti basato sulla media cumulativa e sul coefficiente di variazione calcolati da 20 punti dati di test.
9. Rimuovi il rack dei campioni completato dal vassoio di scarico sul lato sinistro. Rimuovere e gettare la scatola dei rifiuti contenente le tazze dei reagenti usati se necessario.
   ATTENZIONE: Maneggiare con cautela le coppe di reagente usate, poiché potrebbero contenere campioni biologici.
10. Posizionare la soluzione di pulizia capillare in posizione S2 nella camera secondaria del reagente. Clicca su Manutenzione e Pulizia nella schermata degli strumenti, poi seleziona Avvia Capiclean.
11. Inserire una soluzione di ipoclorito di sodio al 2-3% nella camera del reagente secondario (posizione T1). Clicca su Manutenzione e Pulizia nella schermata dello strumento e seleziona Avvia la Decontaminazione.
    NOTA: L'intero processo di pulizia capillare dura automaticamente 45 minuti.
12. Avvia la sequenza di pulizia almeno una volta a settimana.

5. Analisi dei risultati

1. Dopo aver completato ogni esecuzione di analisi, trasmetti i dati grezzi dallo strumento al software per l'elaborazione. Il software genera un elettroferogramma che viene visualizzato sullo schermo del computer.
2. Analizza l'elettroferogramma e quantifica le intensità relative di assorbenza di ciascuna banda proteica a una lunghezza d'onda di 200 nm utilizzando il software.
   NOTA: Basandosi sulle concentrazioni proteiche totali misurate dall'analizzatore biochimico completamente automatizzato, il software calcola la concentrazione di ciascuna banda proteica.
3. Utilizzare gli elettroferogrammi generati per la valutazione visiva e l'identificazione di bande anomale.
   NOTA: Di default, il sistema visualizza gli elettroferogrammi in modalità di ridisegno.
4. Utilizzare una modalità standard per presentare elettroferogrammi iniziali derivati da dati grezzi se necessario.
   NOTA: Gli intervalli di riferimento dell'analizzatore elettroforetico capillare sono stati stabiliti tramite analisi statistica di 246 adulti sani (sia maschi che femmine) con livelli normali di trigliceridi (Tabella 1). Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca i propri standard.

6. Spegnimento degli strumenti

1. Al termine di ogni sequenza di analisi, avviare la procedura di spegnimento dell'analizzatore di elettroforesi capillare per conservare il capillare in condizioni ideali.
   1. Per avviare la procedura di spegnimento, seleziona "Spegnimento" dal menu principale o utilizza il rack di spegnimento fornito con l'analizzatore.
   2. Premi "Spegnimento" nel menu principale. Nella finestra mostrata sullo schermo, premi per avviare la procedura. Il processo di spegnimento inizierà automaticamente al completamento del programma di analisi in corso.
   3. Il rack di spegnimento è etichettato "ESTINZIONE/ARRESTO CAPILLARI 3 & MC". Inserisci questo rack all'estremità della coda del rack campione e lo strumento avvierà automaticamente la procedura di spegnimento.
      NOTA: Quando la procedura di spegnimento è completata, lo strumento viene spento e lo schermo si spegne.
2. Usa l'interruttore fisico sul retro dello strumento per scollegare l'analizzatore dalla rete elettrica.
3. Rimuovi tutte le bottiglie di reagente dalle due camere di reagente e conservale nelle condizioni di conservazione raccomandate. I guasti comuni, le possibili cause e le soluzioni dell'analizzatore elettroforesi completamente automatizzato sono forniti nella Tabella Supplementare 1.

7. Parametri di prestazione

1. Per determinare la sensibilità analitica della procedura di elettroforesi capillare, preparare e analizzare diluizioni seriali di un campione siero contenente una proteina anomala nella zona gamma a 1,198 g/dL. La massima diluizione con un'anomalia riconoscibile corrisponde a una concentrazione di 19 mg/dL della proteina anomala.
   NOTA: A seconda della posizione della proteina anomala e del fondo policlonale nella zona gamma, il limite di rilevamento può variare.
2. Valutazione dell'accuratezza – Correlazione interna
   1. Per garantire l'integrità del campione, processare tutti i campioni di siero (inclusi 18 campioni normali e 100 campioni patologici) in modo identico e maneggiarli secondo le stesse linee guida.
   2. Misurare i livelli di ciascuna frazione proteica sia tramite separazioni elettroforetiche ottenute con la procedura capillare elettroforetica sull'analizzatore sia con un'altra tecnica di elettroforesi capillare disponibile commercialmente per l'analisi proteica.
   3. Analizza i valori misurati da entrambe le procedure con una procedura statistica di regressione lineare. I risultati ottenuti hanno dimostrato una perfetta correlazione tra entrambe le procedure.

Risultati

Le posizioni di migrazione, le caratteristiche di picco e le percentuali relative di ciascuna banda proteica sono state analizzate quantitativamente rilevando l'assorbimento della proteina sierica. L'interpretazione clinica è stata successivamente eseguita sulla base della presenza e del modello delle bande anomale osservate nell'elettroferogramma. Un elettroferogramma capillare rappresentativo che mostra il normale schema di migrazione delle frazioni di proteine sieriche è mostrato nella Figura 1

Discussione

La SPE è una tecnica diagnostica fondamentale nei laboratori clinici, che separa le proteine sieriste in base alle differenze nei loro punti isoelettrici, nei pesi molecolari e nelle^{conformazioni 19}. Questo studio delinea sistematicamente un protocollo per la rapida rilevazione e quantificazione della proteina M sirica utilizzando la CE. Il protocollo evidenzia l'eccellente prestazione analitica del metodo, con i suoi principali vantaggi che sono l'elevata sensibi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
TAMPONE PROTEINA CAPI 3 (E) 6	SEBIA	2503	Buffer di scorrimento usato per la separazione delle proteine sieriche nell'elettroforesi capillare (indicato come tampone di scorrimento nel manoscritto).
Soluzione di lavaggio	SEBIA	2062	Soluzione diluita per risciacquo utilizzata per pulire i tubi capillari dopo l'elettroforesi.
Coppette reagenti	SEBIA	2582	Per diluizione del campione su strumenti completamente automatici.
CAPILLARI DI FILTRO	SEBIA		Filtro usa e getta usato per filtrare le soluzioni tampone e l'acqua deionizzata durante la pulizia dei capillari.
CAPICLEAN	SEBIA	2060	Per la pulizia dei tubi capillari degli strumenti CAPILLARYS 3 OCTA (indicati come soluzione capillare per la pulizia nel manoscritto)
Soluzione di ipoclorito di sodio	Fabbrica di Reagenti Chimici di Guangzhou	1703079	Per la pulizia della sonda campione.
Acqua deionizzata	Watsons	/	Utilizzato per il risciacquo capillare nell'analizzatore automatico di elettroforesi capillare.
Controllo qualità Randox	Randox	HN1530	Per il controllo qualità.
Analizzatore completamente automatizzato di elettroforesi capillare	SEBIA	CAPILLARI 3 OTTA 	Strumento utilizzato per l'analisi delle proteine sieriche ad alta risoluzione e ad alta produttività.
Software PHORESIS 9.30	SEBIA	/	Software utilizzati per l'acquisizione e l'analisi automatizzate dei pattern di elettroforesi.