Sviluppo e Validazione di un Metodo Rapido LC-MS/MS per la Quantificazione del Carfilzomib nel plasma di pazienti con mieloma multiplo

Summary

Questo studio mirava a sviluppare e convalidare un metodo rapido e sensibile di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la quantificazione del carfilzomib nel plasma umano. Il metodo completamente validato supporta il monitoraggio terapeutico dei farmaci nei pazienti con mieloma multiplo, consentendo così un'ottimizzazione personalizzata della dose.

Abstract

Il carfilzomib, un inibitore del proteasoma di seconda generazione, richiede il monitoraggio terapeutico dei farmaci (TDM). Questo studio mirava a sviluppare e convalidare un metodo sensibile e robusto per cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la quantificazione del carfilzomib nel plasma umano. I campioni di plasma sono stati processati tramite precipitazione proteica con acetonitrile (ACN). La separazione cromatografica è stata ottenuta su una colonna C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm) mantenuta a 40 °C, con una fase mobile composta da ACN e 10 mmol/L di acetato di ammonio in acqua (80:20, v/v) erogati a una portata di 0,35 mL/min. Il metodo ha dimostrato un'eccellente linearità su un intervallo di concentrazione compreso tra 2,00 e 1000,00 ng/mL. Inoltre, sono state osservate elevate precisioni e accuratezze intragiornate e intergiornaliere, con tassi di recupero per il carfilzomib che variano dall'84,1% al 93,0%. Questo metodo convalidato di LC-MS/MS consente una determinazione accurata, efficiente e sensibile delle concentrazioni di carfilzomib nel plasma di pazienti con mieloma multiplo, supportando così l'ottimizzazione della terapia a base di carfilzomib.

Introduction

Il mieloma multiplo (MM) è una malignità ematologica caratterizzata dalla proliferazione clonale delle cellule plasmatiche nel^{midollo osseo 1}. Rappresenta la seconda malignità ematologica più comune a^{livello globale 2}, rappresentando circa il 10% di tutti i tumori ematologici³. Nel corso degli anni, i progressi nella terapia farmacologica, inclusa l'introduzione di inibitori del proteassoma, farmaci immunomodulatori e anticorpi monoclonali, hanno portato a risultati terapeutici migliorati. Tuttavia, una percentuale significativa (20%-30%) dei pazienti con MM continua a sperimentare sfide come la sopravvivenza senza progressione breve (PFS^)4,5 reazioni avverse (ADR), resistenza ai farmaci e^{ricaduta 6}.

^{Bortezomib, il primo inibitore del proteassoma7}, ha trasformato il panorama terapeutico della MM. Nonostante la sua efficacia, la maggior parte dei pazienti sviluppa infine una malattia recidiva o refrattaria, spesso accompagnata da resistenza al bortezomib ^8,9 e da tassi ridotti di risposta al trattamento^{e sopravvivenza 10,11}. Queste sfide sottolineano l'urgente necessità di approcci terapeutici innovativi per migliorare gli esiti nella MM. Il Carfilzomib, un inibitore del proteasomo di seconda generazione approvato dalla FDA, offre un profilo farmacocinetico più stabile, consentendo una soppressione sostenuta dell'attività simile alla chimotripsina e offrendo potenti effetti antimieloma. È generalmente indicato per i pazienti con MM che hanno seguito almeno due linee terapeutiche precedenti, incluso il trattamento con bortezomib e un farmaco^{immunomodulatore 1,11}. Le ricerche hanno dimostrato che il carfilzomib raggiunge un'inibizione proteasomica più robusta nelle cellule del mieloma rispetto al bortezomib e possiede la capacità di superare la resistenza al bortezomib^12,13.

I metodi più utilizzati per quantificare le concentrazioni di farmaci nelle matrici biologiche includono la cromatografia liquida ad alta prestazione-deteczione ultravioletta (HPLC-UV), il saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA) e la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS⁾¹⁴. Sebbene HPLC-UV offra semplicità operativa e basso costo, la sua utilità è limitata da una sensibilità e selettività relativamente basse. Di conseguenza, la quantificazione accurata degli analiti target, in particolare a basse concentrazioni o all'interno di matrici biologiche complesse, rimane una^{sfida 15}. ELISA dimostra un'elevata sensibilità. Tuttavia, la sua applicazione presenta diverse limitazioni, tra cui un lungo processo di sviluppo, la dipendenza da anticorpi di alta qualità e la suscettibilità alla reattività incrociata con composti strutturalmente simili presenti nel campione. Questi fattori collettivamente compromettono la specificità del saggio¹⁶. Al contrario, LC-MS/MS offre una selettività eccezionale, una sensibilità superiore e una rapida capacità analitica. Questi vantaggi lo rendono la metodologia di riferimento per il monitoraggio terapeutico dei farmaci (TDM) e le indagini^{farmacocinetiche 17}. Il carfilzomib presenta caratteristiche di un'estesa legame proteica plasmatica, scarsa stabilità in vivo e un indice terapeutico ristretto. La tecnologia LC-MS/MS può eseguire un'analisi quantitativa rapida del composto bersaglio, ridurre efficacemente l'effetto matriciale e fornire una base scientifica per una somministrazione clinica precisa del farmaco.

Il livello di esposizione al farmaco carfilzomib è strettamente correlato al suo effetto terapeutico e ADR^18,19. Il Carfilzomib ha una proprietà dipendente dalla^{dose 20}, e il suo livello di esposizione aumenta positivamente con la dose nell'organismo, il che può influenzare direttamente il suo effetto terapeutico. Uno studio ha mostrato che il tasso di risposta completa (CR) di carfilzomib nel trattamento della MM era del 28%, il tasso di risposta parziale molto buona (VGPR) era del 73% e il tasso complessivo di risposta (ORR) era del 93%²¹. Inoltre, rispetto al gruppo di controllo, l'incidenza di cardiotossicità nei pazienti trattati con carfilzomib è aumentata significativamente, mentre non vi è stata una modifica significativa della neuropatia periferica. Un altro studio ha anche menzionato l'efficacia e la sicurezza del carfilzomib nel trattamento della MM e ha confermato che il carfilzomib può aumentare il rischio di cardiotossicità migliorando al contempo l'effetto^{terapeutico 22}. Pertanto, l'efficacia e le ADR del carfilzomib sono legate al livello di esposizione. Ad oggi, sono stati riportati pochi metodi LC-MS/MS validati per la quantificazione del carfilzomib nel plasma umano, in particolare quelli che soddisfano rigorosi criteri di validazione bioanalitica (ad esempio, linee guida della FDA). Gli studi esistenti si concentrano principalmente su modelli animali o altre matrici^{biologiche 23,24}, evidenziando una lacuna nei saggi clinicamente applicabili per la TDM nei pazienti con MM.

Pertanto, è urgente stabilire un saggio rapido, preciso e sensibile per monitorare le concentrazioni di carfilzomib nei pazienti con MM, al fine di ottimizzarne l'utilità terapeutica e il profilo di sicurezza. In questo lavoro, abbiamo sviluppato e validato un metodo affidabile LC-MS/MS in grado di quantificare il carfilzomib nel plasma umano entro 3 minuti, dimostrando eccellente sensibilità e riproducibilità. Sviluppato per la TDM del carfilzomib in MM, questo metodo supporta l'ottimizzazione della dose e la valutazione dell'esposizione-risposta. Gli utenti devono essere consapevoli dell'instabilità del farmaco nel plasma; Una quantificazione accurata richiede l'elaborazione del campione entro 4 ore dal prelievo del sangue.

Protocol

Questo protocollo di ricerca è stato approvato dal Comitato Etico del Secondo Ospedale dell'Università Medica Navale (Ospedale Changzheng di Shanghai). Tutti i pazienti iscritti allo studio hanno firmato il consenso informato.

1. Strumentazione LC-MS/MS

1. Utilizzare un sistema di cromatografia liquida ad ultra-alte prestazioni (UHPLC) collegato a uno spettrometro di massa a quadrupolo triplo dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI) per lo sviluppo del metodo e l'analisi del campione.
2. Configura il sistema UHPLC per includere un degasser online, una pompa binaria, un autocampionatore e un forno a colonna.
3. Effettuare l'acquisizione e l'elaborazione dei dati utilizzando il software di acquisizione dati del produttore dello strumento.

2. Condizioni cromatografiche liquide

1. Ottenere la separazione cromatografica utilizzando una colonna ZORBAX-SB_{C 18} (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm).
2. Mantieni la temperatura della colonna a 40 °C.
3. Condurre eluzione isocratica con una fase mobile composta dal 20% di 10 mmol/L di acetato di ammonio in acqua e 80% di ACN.
4. Imposta la portata a 0,35 mL/min.
5. Garantire forme di picco simmetriche e tempi di ritenzione adeguati sia per l'analita che per lo standard interno (IS) in queste condizioni.
   NOTA: Il Carfilzomib-d8 è stato selezionato come IS per la sua somiglianza strutturale con il carfilzomib, che garantisce un recupero di estrazione, un comportamento cromatografico e un'efficienza di ionizzazione comparabili.
6. Imposta la durata totale a 3,0 minuti.

3. Condizioni della spettrometria di massa

1. Fai funzionare lo spettrometro di massa in modalità ESI negativa.
2. Imposta la tensione capillare a -6000 V.
3. Impiega l'azoto sia come gas di nebulizzazione che come gas di essiccazione.
4. Utilizzare azoto ad alta purezza come gas di collisione a una pressione di 0,2 MPa.
5. Mantieni la pressione del nebulizzatore a 20 psi.
6. Riscalda il gas di essiccazione a 400 °C e somministralo a una portata di 10 L/min.
7. Imposta la temperatura del gas di guaina a 350 °C, con una portata di 12 L/min.
8. Acquisire dati in modalità monitoraggio a reazione multipla (MRM).
9. Acquisire spettri ionici di prodotto del carfilzomib (Figura 1A) e dell'IS (Figura 1B) per illustrarne i modelli di frammentazione.
10. Usa la modalità MS2 Scan per identificare l'ione genitore.
11. Usa la modalità SIM MS2 per ottimizzare la tensione del frammentatore.
12. Utilizzare la modalità Ione Prodotto per determinare l'Energia di Collisione (CE) ottimale.
13. Dettagliare i parametri ottimizzati della spettrometria di massa per carfilzomib e l'IS (Tabella 1).

4. Campioni di calibrazione e controllo qualità

1. Prepara una soluzione standard di carfilzomib (1,0 mg/mL) pesando con precisione 2,0 mg di carfilzomib in una fiaschetta volumetrica da 2 mL e sciogliendola in 2 mL di metanolo (MeOH).
   ATTENZIONE: MeOH è infiammabile e tossico. Durante il funzionamento, dovrebbe essere fatto in una cappa per evitare l'inalazione di vapori o il contatto con la pelle. Utilizza dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti e protezioni per occhi e viso.
2. Conserva la soluzione di stocco a -80 °C.
3. Generare soluzioni operative tramite diluizione seriale della soluzione stock con il 10% di MeOH per ottenere concentrazioni di 100,0 μg/mL, 10,0 μg/mL e 1,0 μg/mL.
4. Stabilire standard di calibrazione pungendo plasma vuoto con le soluzioni operative.
5. Diluire il plasma spiked con plasma a vuoto in un rapporto di 1:9 (v/v) per ottenere concentrazioni finali di 2,0, 5,0, 50,0, 200,0, 500,0, 750,0 e 1000,0 ng/mL.
6. Preparare indipendentemente i campioni di controllo qualità (QC) utilizzando lo stesso metodo a concentrazioni di 5,0 ng/mL (basso), 200,0 ng/mL (medio) e 750,0 ng/mL (alto).

5. Preparazione del campione

1. Pretratta i campioni di plasma (100 μL) aggiungendo 20 μL di una soluzione di acido fosforico al 4%.
   ATTENZIONE: L'acido fosforico è corrosivo. Indossa guanti, occhiali protettivi e camice da laboratorio per evitare il contatto visivo e di pelle. In caso di contatto, risciacqua immediatamente con abbondanti quantità d'acqua.
2. Miscelazione vortice del campione per 2 minuti alla massima velocità utilizzando un mixer vortice standard da laboratorio.
3. Aggiungere 200 μL di ACN, assicurandosi che contenga una soluzione IS a una concentrazione di 200,0 ng/mL, alla^{miscela di 25}.
   ATTENZIONE: L'ACN è infiammabile, volatile e tossico. Tutte le operazioni devono essere eseguite in una cappa e tenute lontane da fonti di calore e fiamme. Utilizza dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti e protezioni per occhi e viso.
4. Vortice di nuovo la miscela combinata.
5. Centrifugare la miscela a 12.500 ×g per 10 minuti a 4 °^{C 25}.
6. Raccogli 100 μL del soprantantante.
7. Combinare il soprantantante da 100 μL con 100 μL di acqua.
8. Trasferire la soluzione risultante in una fiala HPLC dotata di un inserto di vetro.
9. Iniettare 10 μL della soluzione finale nel sistema LC-MS/MS per l'analisi.

6. Valutazione della specificità

1. Valutare la specificità confrontando le risposte di carfilzomib e IS in sei diversi lotti di plasma a vuoto, plasma con IS-spiked, campione al limite inferiore di quantificazione (LLOQ) e campioni di plasma autentici.
2. Si considera l'interferenza accettabile se la risposta è inferiore al 15% del LLOQ per l'analita e inferiore al 5% della risposta IS.

7. Valutazione della linearità

1. Valutare la linearità analizzando tre serie di standard di calibrazione in giorni diversi (almeno due giorni).
2. Utilizzare un modello di regressione lineare pesata a minimi quadrati per generare curve di calibrazione basate su almeno sei standard di calibrazione.
3. Definisci lo standard di concentrazione più bassa come LLOQ.
4. Richiedere concentrazioni retrocalcolate per ogni standard entro ± 15% dei loro valori nominali, con una tolleranza di ± 20% per il LLOQ.

8. Determinazione della precisione e dell'accuratezza

1. Determinare la precisione e la precisione intra-giornata e inter-giornata analizzando cinque repliche di campioni QC a tre livelli di concentrazione e il campione LLOQ in almeno due giorni diversi.
2. Esprimi la precisione come deviazione standard relativa (RSD%), richiedendo che sia ≤ 15% per i campioni QC e ≤ 20% per il LLOQ.
3. Esprimi l'accuratezza come errore relativo (RE%), richiedendo che sia entro ± 15% per i campioni QC e ± 20% per il LLOQ.

9. Recupero e determinazione dell'effetto matriciale

1. Determinare il recupero confrontando l'area di picco di carfilzomib spikeata nel plasma prima dell'estrazione con l'area di picco di carfilzomib inserita nella matrice estratta alla stessa concentrazione.
2. Valutare l'effetto matriciale confrontando l'area di picco del carfilzomib inserito nella matrice estratta con l'area di picco del carfilzomib in una soluzione ordinata alla stessa concentrazione.
3. Indicare un impatto costante della matrice di plasma vuoto sul segnale dell'analita se il RSD% per il fattore di effetto della matrice è inferiore al 15%.

10. Valutazione del carryover

1. Valutare il trasferimento iniettando un campione vuoto immediatamente dopo il più alto standard di calibrazione per rilevare eventuali residui di analita dall'iniezione precedente.
2. Si considera accettabile il carryover se la risposta del carfilzomib nel campione vuoto è inferiore al 20% del LLOQ e inferiore al 5% della risposta IS.

11. Valutazione dell'effetto diluizione

1. Valutare l'effetto diluizione diluendo campioni di plasma con punte con concentrazioni superiori al limite superiore di quantificazione (ULOQ) con plasma a vuoto per portare la concentrazione all'interno dell'intervallo di calibrazione.
2. Confronta la concentrazione misurata con quella nominale.

12. Valutazione della stabilità

1. Valutare la stabilità analizzando campioni di QC a tre livelli di concentrazione in diverse condizioni di conservazione.
2. Conserva i campioni di QC a temperatura ambiente e analizza dopo 6 ore.
3. Conserva i campioni processati nell'autocampionatore e analizza alle ore 0, 2, 4 e 6.
4. Sottoporre i campioni di QC a tre cicli di congelamento-scongelamento alternando la conservazione a −20 °C e temperatura ambiente, poi analizza.
5. Conservare i campioni di QC a −80 °C per due mesi, poi analizzare.
6. Confrontare le concentrazioni misurate con i valori nominali e confermare che le deviazioni sono entro il ±15% (RE%).

13. Iscrizione dei pazienti e raccolta di campioni

1. Ottieni il consenso scritto informato da tutti i pazienti.
2. Iscrivete i pazienti con MM e trattateli con carfilzomib.
3. Prelevare i campioni di sangue subito dopo la somministrazione del farmaco (infusione endovenosa per oltre 30 minuti).
4. Ottenere campioni di plasma centrifugando i campioni di sangue raccolti in tubi EDTA-3K a 4500 ×g per 10 minuti a 4 °C.

Results

Ottimizzazione LC-MS/MS

Per ottimizzare la rilevazione del carfilzomib, i valori di risposta dell'analita sono stati confrontati sia con modalità di ionizzazione positiva che negativa. La modalità di ionizzazione negativa ha fornito una risposta più alta per il carfilzomib rispetto a quella positiva ed è stata quindi selezionata per analisi successive. Abbiamo confrontato le prestazioni delle colonne C₈, C₁₈ e T3-C_18...

Discussion

A differenza dei metodi tradizionali HPLC-UV ed ELISA, LC-MS/MS offre una selettività, sensibilità e velocità eccezionali, affrontando efficacemente i limiti dei suoi predecessori. Questi vantaggi consolidano il suo ruolo come tecnica di riferimento per l'analisi dei farmaci in biomatrici complesse, in particolare per le indagini TDM e^{farmacocinetiche 17}. Abbiamo sviluppato e validato un metodo LC-MS/MS per quantificare il carfilzomib nel plasma umano. Un vantaggi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN)	Compagnia Merck (Darmstadt, Germania)	34888	Grado LC-MS
Acetato di ammonio	Compagnia Merck (Darmstadt, Germania)	9689	Purezza dell'analisi: ≥ 99.0%
Bilancio dell'analisi	Sartorius (Germania))		Precisione: 0,01 mg
Colonna analitica	Agilent Technologies (USA)		Agilent ZORBAX SB-C18, 2.1 e volte; 100 mm, 3,5 & micro; m
Carfilzomib	Shanghai yuanye biotecnologia (Shanghai, Cina)	868540-17-4	Analizza il campione standard, purezza > 99%
Carfilzomib-d8	Shanghai yuanye biotecnologia (Shanghai, Cina)		Analizza il campione standard, purezza > 98%
Software per l'acquisizione dati	Agilent Technologies (USA)		Software di elaborazione dati Agilent Masshunter (versione 6.0)
Software di analisi dei dati	Agilent Technologies (USA)		Software di analisi quantitativa Agilent MassHunter (versione 10.1)
Acqua distillata	Shenzhen Watsons Distilled Water Co., Ltd (Shenzhen, Cina)	Grado LC-MS
Fiale e fiale HPLC; Inserti	Shanghai Titan Technology Co., Ltd. ((Shanghai, Cina))		-
Sistema di cromatografia liquida	Agilent Technologies (USA)		La serie Agilent 1200 include pompe binarie, degasser online, campionatore automatico e scatola di temperatura a colonna.
Metanolo (MeOH)	Compagnia Merck (Darmstadt, Germania)	1.06035	Grado LC-MS
Micropipette	Eppendorf (Germania)		Intervalli di misura multipli (ad esempio, 10 e micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L)
Ufficio & Software statistico	-		Microsoft Office 365; GraphPad Prism 9.5
Acido fosforico	Compagnia Merck (Darmstadt, Germania)	49685	Purezza dell'analisi, 85%
Centrifuga refrigerata	Eppendorf (Germania)		Per campioni centrifugati a 4° C
Spettrometro di massa a quadrupolo triplo	Agilent Technologies (USA)	G6475AA	Serie Agilent 1200, equipaggiata con sorgente di ionizzazione elettrospray (ESI)
Miscelatore a vortice	Labnet  (USA)	S0200	Velocità regolabile