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Articolo metodologico

Metagenomica della frazione della dimensione virale del DNA per campioni di feci umane

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DOI:

10.3791/70187

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24 marzo 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo flessibile per generare metagenomi di frazione di dimensione virale (viromi) di alta qualità a partire da campioni di feci umane. Originariamente sviluppato per la viromica del suolo, qui questo protocollo è stato applicato con successo ai campioni di feci, permettendo una caratterizzazione robusta della virosfera intestinale umana.

Abstract

Comprendere la virosfera umana sana (la componente virale del microbioma) richiede misurazioni accurate della composizione delle comunità virali su una vasta gamma di tipi virali. Basandoci sull'esperienza precedente con metodi di ecologia delle comunità virali del suolo, qui dimostriamo una serie di approcci di laboratorio per arricchire ed estrarre DNA da virus extracellulari in campioni di feci umane. Viene presentato un protocollo primario funzionante, insieme a opzioni per deviazioni in diversi passaggi. L'approccio generale prevede l'aggiunta di un tampone liquido (predefinito: soluzione salina fosfatata tamponata potenziata con proteine, PPBS) per facilitare la rimozione delle particelle virali libere dalla matrice fecale, centrifugazione per separare la frazione liquida contenente particelle virali, filtrazione (predefinita: poro di 0,2 μm) per rimuovere la maggior parte delle cellule, concentrazione di particelle virali (predefinita: ultracentrifugazione), rimozione degli acidi nucleici liberi con nucleasi prima della lisi viriale, e poi estrazione del DNA per il sequenziamento. Sono inoltre indicate tecniche alternative, tra cui diversi buffer, dimensioni di filtro e metodi di concentrazione. Nel complesso, sono offerte molteplici opzioni per generare DNA viromico di alta qualità per il sequenziamento. Piuttosto che adattare l'approccio a specifiche attrezzature e risorse, la flessibilità del protocollo dovrebbe renderlo ampiamente applicabile in laboratori con apparecchiature standard di biologia molecolare variabili.

Introduzione

La viromica, ovvero il sequenziamento metagenomico non mirato della frazione di dimensione virale delle comunità miste, può fornire informazioni sulla diversità, evoluzione ed ecologia dei virus non coltivati. Dai primi tentativi di catalogare le comunità virali intestinali oltre 20 anni fa, che utilizzavano in particolare metodi sviluppati per campioni ambientali come l'acquadi mare 1, gli approcci viromici hanno continuato a permettere scoperte nell'ecologia virale all'interno del microbiomaumano 2. Tuttavia, non esiste un protocollo universale unico per la viromica e le variazioni nelle tecniche possono influenzare i risultati delsequenziamento 3,4, influenzando infine l'interpretazione delle dinamiche delle comunità virali e ostacolando i confronti tra gli studi. Protocolli ottimizzati, combinati con una comprensione approfondita di come le scelte metodologiche plasmino i profili di virome, sono necessari per caratterizzare in modo robusto la virosfera umana.

Sebbene non esista un protocollo universale per i viromici, la base generale dei metodi viromici prevede la separazione e concentrazione fisica delle particelle extracellulari simili a virus (virioni) in base alla loro dimensione e/o densità, alla rimozione degli acidi nucleici liberi (derivati in parte da detriti cellulari o da capsidi virali compromessi) prima della lisi virionale e l'estrazione di DNA e/o RNA per il sequenziamento. Alcune tecniche viromiche scelgono a favore o contro tipi virali specifici, sia come scelta intenzionale da parte dei ricercatori sia come limitazione metodologica non voluta. La siringa o la filtrazione a vuoto viene frequentemente utilizzata per rimuovere cellule microbiche e altri detriti, e la dimensione del filtro influisce intrinsecamente sulla qualità e la composizione del viroma recuperabile. Ad esempio, la filtrazione può aumentare la purezza delvirome 5, ma può escludere particelle viralipiù grandi 6,7. I metodi di concentrazione di virioni, come l'ultracentrifugazione, la precipitazione del polietilenglicole (PEG), l'ultracentrifugazione a gradiente di densità e l'ultrafiltrazione, presentano anch'essi compromessi tra purezza, portata e costidi attrezzatura 3,8. Le chemiche buffer multiple sono note per essere efficaci per la viromica. Potrebbero non avere impatti esagerati sulla caratterizzazione delvirome 9, ma i buffer di stoccaggio e risospensione possono comunque influenzare il recupero del virus e i profili del virome generati dall'analisi bioinformatica10,11. Infine, poiché le concentrazioni di acidi nucleici virali possono essere basse nei campioni naturali, molti studi scelgono di amplificare il DNA virale prima della costruzione della libreria (ad esempio, tramite amplificazione a spostamento multiplo (MDA) o amplificazione a singolo primer indipendente dalla sequenza (SISPA)). Tuttavia, alcune di queste tecniche introducono un bias significativo12,13. In generale, sebbene molti metodi di viroma possano generare con successo le virome, protocolli ottimizzati che riconoscono i bias e sono in parte standardizzati permetteranno una ricerca accurata e riproducibile sulle virome.

Questo articolo presenta un flusso di lavoro flessibile per generare virome da campioni di feci umane. Adattato dalle tecniche comprovate di viromicidel suolo 14,15,16, questo protocollo include diversi passaggi che facilitano la modifica, permettendo ai ricercatori di adattarlo alle proprie attrezzature e alle proprie esigenze di ricerca. Il metodo standard delle viromiche del suolo descritto di seguito, applicato con successo sia a campioni di terra che a quelli di feci congelate, produce viromi di alta qualità senza un passaggio di amplificazione del DNA virale prima della costruzione della biblioteca. Le proposte per modifiche al protocollo sono state testate in misura variabile in altri studi, ma i loro effetti specifici a valle sulle sequenze di viroma delle feci umane non sono stati esaminati qui.

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Protocollo

Tutti i soggetti reclutati per la raccolta di campioni di feci hanno fornito il consenso informato. I protocolli di raccolta dei campioni sono stati approvati dal Consiglio di Revisione Istituzionale dell'Università della California, Davis, e gli studi sono conformi alla Dichiarazione di Helsinki. Questo protocollo è adattato da Emerson et al. (2022)17.

1. Preparazione dei materiali

  1. Prepara soluzione salina tamponata con fosfato potenziata con proteine (PPBS, 10x PBS, 1% K-citrate, 150 mMMgSO 4, 2% albumina sierica bovina (BSA))18.
    NOTA: Altri tamponi comunemente usati nei protocolli viromici sono il magnesio salino (SM)19 e il tampone primo di potassio-citratomodificato (AKC') 11.
    1. Aggiungi 10 mL di 10x PBS, 10 g di K-citrate, 18,05 g diMgSO 4 anidro in una bottiglia di vetro autoclavabile da 1 L e riempi fino a 1 L con acqua da laboratorio ultra-pura. Regolare il pH a 6,5 (tipicamente richiede circa 50 μL di 6 M HCl o circa 100 μL di 2 M HCl). Lascia una barra di mescolare all'interno della bottiglia per l'uso nel Passo 1.1.2.
    2. Autoclave la bottiglia con il buffer e una bottiglia vuota di vetro autoclavabile da 1 L. Dopo l'autoclav, una volta che il tampone si raffredda a temperatura ambiente, posizionalo su una piastra magnetica di mescolamento e aggiungi lentamente 20 g di BSA direttamente nella bottiglia, aggiungendo circa 5 g di BSA alla volta (per evitare schiuma, minimizzare l'agitazione eccessiva della soluzione, ad esempio inizia con una velocità di mescolamento lenta e aumenta gradualmente).
    3. Filtra l'intero volume del tampone attraverso un filtro a vuoto sterile da 0,22 μm nella bottiglia vuota autoclavata da 1 L dello Passo 1.1.2. Conserva il buffer a 4 °C fino all'uso.
      NOTA: Il buffer PPBS può essere conservato a 4 °C per circa 3 mesi, ma non è stabile a lungo termine se conservato sopra lo zero.
  2. Prepara i tubi dell'ultracentrifuga.
    NOTA: Questo protocollo utilizza l'ultracentrifugazione per concentrare i virioni. Altri approcci comuni includono la precipitazione del polietilenico glicole (PEG), l'ultracentrifugazione a gradiente di densità (ad esempio, gradienti di cloruro di cesio) e l'ultrafiltrazione.
    1. Per pulire i tubi delle ultracentrifughe, prima strofini i tubi usando acqua da laboratorio ultra-pura. Poi risciacqua i tubetti con acqua di laboratorio ultra-pura.
    2. Riempi i tubetti con 1 M di NaOH e lascia in ammollo per almeno 1 ora (può lasciarli in ammollo tutta la notte). Pulisci i tappi ultracentrifughe in plastica/gomma e i loro o-ring immergendoli in 1 M NaOH.
      NOTA: Non immergere i tappi metallici a vite nel NaOH.
    3. Dopo l'ammollo, risciacqua tre volte con acqua di laboratorio ultra-pura, seguita da un risciacquo con acqua di grado biologico molecolare senza nucleasi. Asciuga i tubi invertendoli e battendo delicatamente, oppure lasciali asciugare completamente durante la notte. Etichetta ogni tubo dell'ultracentrifuga con un identificatore del campione.
  3. Pre-raffredda il rotore dell'ultracentrifuga a 4 °C lasciandolo in frigorifero o nella stanza fredda per tutta la notte.

2. Purificazione e concentrazione di virioni

  1. Pesa le feci in un tubo conico sterile, privo di DNasi, RNasi e DNA, da 50 mL.
    NOTA: La quantità di feci utilizzata può dipendere dalla quantità di materiale campione disponibile. Qui sono stati utilizzati 2 g di feci. Se il materiale campione inutilizzato deve essere conservato congelato, si considera di aliquotare l'intero campione prima del congelamento per minimizzare i futuri cicli di congelamento-discongelamento.
  2. Aggiungere 8 mL di buffer PPBS direttamente nei tubi conici contenenti le feci (conico #1). Sospezione completa tramite vortice.
  3. Scuoti i tubi a 300 giri/min a 4 °C per 10 minuti.
    NOTA: Se necessario, lo scuotimento può essere fatto a temperatura ambiente, ma si raccomanda 4 °C.
  4. Centrifuga campiona in conico #1 a 4.000 x g a 4 °C per 10 minuti.
    NOTA: Usa un rotore oscillante a secchio, se possibile, per facilitare la separazione verticale della densità e facilitare i passaggi successivi.
  5. Scendere con cura il soprantantante in una nuova sterile conica da 50 mL (conica #2) e conservare a 4 °C (il sovrantantante qui contiene i virioni). Non scartare il tubo conico che contiene il pellet (conico #1), poiché viene usato nuovamente nello Passo 2.6.
  6. Ripeti i passaggi 2.2-2.5 altre due volte (così che il campione nella conica #1 abbia subito un totale di 3 volte risospensione con buffer, 3 volte scuotimento e 3 volte centrifugazione) e continua a raccogliere il soprandanante nella conica #2.
    NOTA: Tre colpi dovrebbero accumulare un totale di ~24 mL di soprannatante.
  7. Centrifugare il tubo conico da 50 mL contenente il sovrantato accumulato (conico #2) per 8 minuti a 10.000 x g a 4 °C.
  8. Esegui un secondo ciclo di centrifugazione. Per prima cosa, decantare il sovrantagente dalla conica #2 in un nuovo tubo conico da 50 mL (conico #3). Centrifuga conica #3 per 8 minuti a 10.000 x g a 4 °C.
  9. Utilizzando la filtrazione con siringa, filtra sequenzialmente il surnante dalla conica #3, evitando il pellet al fondo o vicino al tubo. Prefiltrare utilizzando un filtro sterile a siringa polieterosulfone (PES) da 5,0 μm, seguito da un filtro sterile a siringa PES da 0,20 μm, direttamente in un tubo ultracentrifuga.
    NOTA: Lo scopo del pre-filtraggio con filtri da 5,0 μm è ridurre l'ostruzione dei filtri da 0,20 μm. Potrebbe comunque essere necessario scartare e sostituire i filtri della siringa se si ostruiscono. La filtrazione può essere eseguita in un unico passaggio impilando il filtro da 5 μm sopra quello da 0,20 μm, collegato a una singola siringa e direttamente in un tubo ultracentrifuga. Le membrane PES sono preferite, poiché altri materiali possono trattenere virioni (ad esempio, fibra di vetro) o ostruirsi più rapidamente (ad esempio, fluoruro di polivinilidene, PVDF). 0,45 μm è un'altra dimensione comune del filtro.
  10. Controlla la massa di tutti i tubi dell'ultracentrifuga con il contenuto del campione, e accoppia i tubi nell'ultracentrifuga in base alla massa. Se necessario, aggiungere PPBS al tubo più leggero di ogni coppia per equalizzare il peso (entro un margine di errore di 0,05 g per tubi accoppiati).
  11. Ultracentrifuga a 112.000 x g a 4 °C sotto vuoto per 2 ore e 25 minuti.
    NOTA: A seconda del rotore utilizzato, la durata dello spin varierà (secondo il coefficiente sedimentario (s) = 58). Consulta la Tabella dei Materiali per il rotore utilizzato qui. Prima di rimuovere i tubi dall'ultracentrifuga, annota l'orientamento di ciascun tubo nel rotore per aiutare a localizzare la pellet virale. A volte, dopo l'ultracentrifugazione, il pellet virale non è visibile e bisogna prestare particolare attenzione nella rimozione del surnatante nel passaggio successivo.

3. Risospensione di pellet virali e trattamento con DNasi

  1. Rimuovere il surnatante sia decantando sia usando una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet, che può essere fragile (il pellet contiene i virioni concentrati).
    NOTA: Come indicato nel Passo 2.11, il pallino può essere visibile o meno, ma spesso si può vedere un pallino marrone o giallo delle dimensioni di un foro.
  2. Tratta i campioni con DNasi.
    NOTA: Se scegli di non trattare campioni con DNasi, procedi al Passo 4 e segui "Se il trattamento con DNase non è stato eseguito". Consulta la Discussione per le considerazioni sull'esecuzione del trattamento con DNasi.
    1. Risospendere il pellet in 100 μL di acqua di grado biologico molecolare priva di nucleasi, in un tubo microcentrifuga marcato da 1,5 mL.
    2. Realizzare il mix master del trattamento con DNasi aggiungendo 10 μL di tampone di reazione DNasi e 10 μL di DNasi per ogni campione da trattare. Pipetta per mescolare accuratamente.
      NOTA: Preparare abbastanza master mix per il trattamento DNasi per reazioni aggiuntive, a modo di tenere conto della potenziale perdita di volume durante la pipetazione nello Passo 3.2.3.
    3. Aggiungere 20 μL del mix master del trattamento DNasi ai virioni sospesosi. Mescola bene con una pipettatura delicata. Incubare a 37 °C per 30 minuti.
    4. Aggiungere 10 μL di soluzione di DNasi stop per inattivare le nucleasi. Vortice brevemente.

4. Estrazione degli acidi nucleici virali

  1. Esegui l'estrazione del DNA utilizzando il kit di estrazione del DNA indicato nella Tabella dei Materiali.
    NOTA: Apporta due modifiche alle istruzioni del produttore. 1) Dopo il Passaggio 1 della procedura del kit, riscaldare il tubo a sfera contenente i virioni nel buffer CD1 a 65 °C per 10 minuti, poi procedere con l'estrazione secondo le istruzioni del produttore. 2) Durante la fase di eluzione del DNA (fase 16 della procedura del kit), incubare le colonne a temperatura ambiente per 5 minuti dopo aver aggiunto C6.
    1. Se è stato eseguito un trattamento con DNasi: Dopo che le nucleasi sono state inattivate (nel Passo 3.2.4), utilizzare l'intero volume come input per l'estrazione del DNA (ad esempio, nel passo 1 della procedura del kit di estrazione del DNA, aggiungere questo volume al tubo a sfera contenente 800 μL di CD1). Assicurati di non lasciare alcuna soluzione (questa soluzione contiene i virioni).
    2. Se il trattamento con DNase non è stato eseguito: Aggiungere 100 μL di acqua di grado molecolare priva di nucleasi, al tubo ultracentrifuga contenente il pellet dello Passo 3.1. Raschia delicatamente il pellet e risospendi. Usa il pellet sospeso come input per l'estrazione del DNA.

5. Quantificazione del DNA

  1. Quantifica il DNA estratto con il metodo preferito basato sulla fluorescenza.
    NOTA: Le resa di DNA del Virome raramente sono abbastanza elevate per una quantificazione basata sull'assorbenza; Tuttavia, questo può comunque essere utile per identificare contaminanti chimici.
  2. Per la conservazione a breve termine, conservare il DNA a -20 °C dopo la quantificazione. Per conservazione a lungo termine, conservare a -80 °C. Il DNA è ora pronto per la preparazione e il sequenziamento della biblioteca. Consulta la Tabella dei Materiali per il kit di preparazione della biblioteca e la piattaforma di sequenziamento utilizzata qui.

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Risultati

Uno sforzo esplorativo che ha applicato questo protocollo a un singolo campione di feci congelate (processato in triplicata tecnica per le virome) insieme a due campioni di terreno ha dimostrato la sua efficacia nel produrre virome di alta qualità da diversi tipi di campione. Utilizzando dati di sequenziamento filtrati per qualità e contig assemblati de novo generati da questo protocollo, le sequenze virali presunte sono state identificate utilizzando uno strumento open...

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Discussione

Questo protocollo presenta un metodo relativamente semplice e adattabile per generare le virome. Dimostrato nei suoli14, 15, 16 e 21, viene applicato con successo qui a campioni di feci umane. Questo protocollo ripristina al meglio virus extracellulari e intatti del DNA e non è progettato per recuperare intenzionalmente virus intracellulari o profagi (anche se ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i dottori Sean Adams, Trina Knotts e Mohamed R. Ali (University of California, Davis School of Medicine) per aver raccolto e fornito il campione di feci in conformità con i protocolli IRB e gli standard etici. Ringraziamo il dottor Matthew R. Olm (University of Colorado, Boulder) per la collaborazione nell'analisi del campione di feci. Questa ricerca è stata finanziata dal NIH Common Fund (Human Virome Program), Premio # U01DE034198. LSH è stato inoltre parzialmente sostenuto dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE), Ufficio della Scienza, Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale (BER), Genomic Science Program, numero di premio DE-SC0023127 (sovvenzione a JBE, PI Sydney Glassman).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Albumina Sirica Bovina (BSA) Polvere Priva di DNasi e ProteasiBioReagenti FisherBP9706100Per la ricetta PPBS (Passo 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016Kit di estrazione del DNA (Passo 4.1)
Kit di libreria KAPA DNA HyperPrepRochen/aLe librerie generate da questo kit sono state sequenziate utilizzando la piattaforma Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Solfato di magnesio (MgSO4), anidro, ≥ 99.5%Sigma-AldrichM7506Per la ricetta PPBS (Passo 1.1)
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, senza RNasiInvitrogenAM9624Per la ricetta PPBS (Passo 1.1)
Filtri a siringa a membrana di polietersolfone (PES), sterili, 28 mm, 0,2 & mu; mCorning431229Per la filtrazione con siringa (Passo 2.9)
Tubi centrifughe conici in polipropilene, sterili, 50 mLOlympus Plastics28-108
Monoidrato di Citrato di Potassio (Cristallino/Certificato)Fisher ChemicalP222Per la ricetta PPBS (Passo 1.1)
Qubit  Tubi per il testInvitrogenQ32856Per la quantificazione del DNA (Passo 5.1)
Fluorometro Qubit 4InvitrogenQ33238Per la quantificazione del DNA (Passo 5.1)
Kit di quantificazione del dsDNA per qubitInvitrogenQ32850Per la quantificazione del DNA (Passo 5.1)
RNasi RNasi RQ1 DNasiPromegaPR-M6101Include il buffer di reazione, la DNasi e la soluzione di stop
Supor polietersolfone idrofilo (PES) filtri a membrana sterili, 32 mm, 5,00 e micro; m Cytiva (precedentemente Pall Lab)28150-956Per la filtrazione con siringa (Passo 2.9)
Rotore ultracentrifuga: Rotore ad angolo fisso Type 50.2 Ti, 50.000 giri/min, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Utilizziamo anche il Beckman Coulter Type 70 Ti Fixed Angle Titanium Rotor (Cat. 337922). Centrifuga per 3 ore se usi la 70 Ti.
Tubi ultracentrifughe: 26,3 mL Bottiglia di policarbonato con assemblaggio tappo, 25 x 89mmBeckman Coulter355618Compatibile con i rotori Beckman Coulter Type 50.2 Ti (Cat. 337901) e Type 70 Ti (Cat. 337922)
Ultracentrifuga: Beckman Instruments Optima LE-80K Ultracentrifuga a pavimentoBeckman Coulter365668Utilizziamo anche la Beckman Coulter L8-70M Ultracentrifuga Refrigerata (Cat. 344196)

Riferimenti

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