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Articolo metodologico

Un flusso di lavoro pratico per l'analisi dei dati di transcriptomica spaziale: dall'acquisizione dei dati alle analisi avanzate

195 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/70188

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21 agosto 2026

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1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro riproducibile per l'analisi di dati di transcriptomica spaziale, guidando l'utente dall'acquisizione di dati pubblici e dal controllo di qualità basato su Seurat, attraverso integrazione, rilevamento di caratteristiche spaziali, deconvoluzione del tipo cellulare, annotazione di regioni di interesse e analisi della comunicazione cellula-cellula, con punti di controllo pratici che supportano un'esecuzione trasparente.

Abstract

La trascrittomica spaziale (ST) analizza l'espressione genica su scala genomica preservando il contesto spaziale bidimensionale delle molecole di mRNA all'interno di sezioni di tessuto, consentendo studi sull'architettura tissutale e sulla biologia associata al microambiente. Tuttavia, l'analisi della ST rimane complessa poiché l'importazione dei dati, il controllo di qualità, l'integrazione, la deconvoluzione, le statistiche spaziali e la visualizzazione richiedono spesso ambienti software multipli e scelte di parametri riproducibili. Questo protocollo presenta un flusso di lavoro computazionale pratico per dataset pubblici di ST in R, partendo dall'acquisizione dei dati e dalla configurazione del software, per proseguire con il caricamento dei dati basato su Seurat, controllo di qualità, normalizzazione, integrazione multiplo, clustering e analisi dei geni variabili nello spazio. Il flusso di lavoro applica quindi strategie complementari di deconvoluzione, inclusa l'analisi SPOTlight guidata da riferimento e la modellizzazione a topic non supervisionata STdeconvolve, seguita dall'analisi della comunicazione cellulare spaziale basata su Giotto e dalla selezione interattiva di regioni di interesse (ROI) mediante un'applicazione personalizzata in Python Dash. Sottolineando l'esecuzione basata su script, le giustificazioni esplicite dei parametri, gli output attesi e i punti di controllo per la risoluzione dei problemi, il protocollo fornisce un quadro adattabile per dataset di ST basati su array standard e piattaforme correlate, dopo una valutazione dei parametri specifici per dataset e piattaforma.

Introduzione

La trasmissione spaziale del trascrittoma (ST) è una famiglia rivoluzionaria di tecnologie che misura l'espressione genica su scala genomica mantenendo le coordinate spaziali delle molecole di RNA messaggero (mRNA) all'interno di sezioni di tessuto. I metodi ST comprendono approcci basati sul sequenziamento che utilizzano matrici con codici a barre posizionali e approcci di imaging in situ che mappano i segnali trascrizionali all'interno di microambienti tissutali integri1,2. Preservando il contesto spaziale, la ST consente l'analisi dell'architettura tissutale, dell'organizzazione delle vicinanze cellulari, della comunicazione tra cellule e dei processi biologici associati al microambiente che non possono essere completamente risolti dopo la dissociazione del tessuto3.

La rapida crescita dei repository pubblici di dati ST ha creato opportunità senza precedenti per l'analisi secondaria e lo sviluppo di metodi3. Risorse come il database CROST curano centinaia di dataset trascrittomica risolta spazialmente provenienti da diverse specie e piattaforme tecnologiche, mentre collezioni specializzate come STOmicsDB si concentrano su metodologie specifiche quali Stereo-seq4,5. Nonostante l'abbondanza di dati, l'analisi computazionale rimane complessa a causa della struttura complessa dei dati spaziali, della diversità degli strumenti analitici e degli ostacoli tecnici nell'implementare flussi di lavoro riproducibili6,7,8,9,10,11.

Per affrontare i limiti derivanti dall'uso di un singolo ambiente software, viene qui presentato un flusso di lavoro computazionale integrato che sfrutta strumenti analitici complementari. Gli ecosistemi esistenti per l'analisi di dati ST comprendono principalmente Seurat, Giotto e framework basati su Python come Squidpy6,7,12. Sebbene strumenti basati su Python come Squidpy offrano funzionalità estese per l'analisi di grafi spaziali, consolidare la principale pipeline computazionale all'interno di un unico ambiente linguistico riduce gli ostacoli tecnici legati all'interoperabilità tra linguaggi. Di conseguenza, la pipeline principale è implementata principalmente in R per minimizzare tali difficoltà tecniche. All'interno di questo flusso di lavoro basato su R, Seurat viene utilizzato per il caricamento dei dati, il controllo di qualità, la normalizzazione, la riduzione della dimensionalità, la visualizzazione e l'integrazione di campioni multipli, riflettendo il suo uso comune nei flussi di lavoro di trascrittomica singola-cellula e spaziale. Successivamente, Giotto viene impiegato per la costruzione di reti spaziali e per l'analisi della comunicazione cellulare basata su ligandi-recettori. Pertanto, questa pipeline collega la pre-elaborazione e l'integrazione basate su Seurat con l'analisi spaziale basata su Giotto, mantenendo esplicito e riproducibile il trasferimento dei dati tra i due insiemi di strumenti.

All'interno di questo framework, vengono implementate due strategie complementari di deconvoluzione: SPOTlight, un metodo guidato da riferimento che utilizza dati di scRNA-seq per stimare le proporzioni dei tipi cellulari, e STdeconvolve, un metodo di modellazione argomentale non supervisionato che identifica modelli trascrizionali latenti8,11. Gli output forniscono visioni complementari dell'eterogeneità cellulare spaziale, ma non sono considerati una validazione incrociata quantitativa a meno che gli utenti non eseguano l'analisi di concordanza facoltativa descritta nel protocollo. Un'applicazione Python Dash personalizzata, Select Spatial Spots, è integrata per l'annotazione interattiva di regioni di interesse (ROI) ed esporta file di annotazione standard basati su coordinate che possono essere utilizzati in analisi successive.

Per quanto riguarda l'applicabilità pratica, questo flusso di lavoro è concepito principalmente per dati ST basati su array standard (ad esempio, Visium con risoluzione di 55 µm) e potrebbe essere adattato ad altri tipi di tessuto dopo una valutazione dei parametri. Prima dell'analisi, è necessario considerare alcune limitazioni fondamentali. In primo luogo, il modulo di deconvoluzione guidata da riferimento richiede un riferimento scRNA-seq di alta qualità e corrispondente al tessuto in esame. In secondo luogo, piattaforme subcellulari o quasi monocellulari potrebbero richiedere una pre-elaborazione modificata, un'aggregazione spaziale dei bin o una segmentazione cellulare basata su immagini prima dell'integrazione2. Il dataset rappresentativo del colon di topo viene utilizzato come caso dimostrativo per mostrare come il flusso di lavoro possa valutare domini spaziali e l'organizzazione tissutale definita da marcatori, piuttosto che come prova di compatibilità universale della piattaforma.

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Protocollo

Tutti i set di dati biologici analizzati in questo protocollo sono disponibili pubblicamente e utilizzati esclusivamente a scopo dimostrativo. Gli accessi specifici ai dati e i repository di origine sono indicati nei passaggi pertinenti. I set di dati originali sono stati generati dai ricercatori responsabili nel rispetto delle linee guida etiche istituzionali applicabili a ciascuno studio di origine. Consultare la Tabella dei Materiali per verificare tutte le versioni richieste di software e pacchetti R.

Requisiti hardware: La memoria computazionale necessaria per questo flusso di lavoro aumenta in base al numero di campioni e di punti analizzati. Per un dataset tipico di trascrittomica spaziale (ad esempio, circa 3.000 punti per campione su un massimo di tre campioni), una workstation standard con un minimo di 16 GB di RAM è sufficiente per eseguire il pipeline. Tuttavia, si raccomanda vivamente di disporre di almeno 32 GB di RAM o più per garantire prestazioni e stabilità ottimali, in particolare durante le fasi computazionali più gravose in termini di memoria, come la normalizzazione SCTransform e la fattorizzazione della matrice durante la deconvoluzione.

1. Acquisizione dei dati e preparazione della struttura delle directory

  1. Ottenere set di dati pubblici di transcriptomica spaziale (ad esempio, accessione GEO GSE169749, con data di invio 26 marzo 2021 e ultima data di aggiornamento 6 marzo 2022) e dati di riferimento di RNA-seq a singola cellula (ad esempio, accessione GEO GSE264408, con data di invio 19 aprile 2024 e ultima data di aggiornamento 10 dicembre 2024).
  2. Scaricare l'archivio dei dati grezzi (ad esempio, GSE169749_RAW.tar) dal repository ed estrarre l'archivio.
    NOTA: Per il set di dati rappresentativo utilizzato in questo protocollo, la directory estratta contiene più file per ogni campione, i cui nomi di file includono tipicamente l'accession number del campione GEO (ad esempio, GSM5213483).
  3. Organizzare i file in una struttura di directory standardizzata compatibile con Seurat Load10X_Spatial funzione.
    1. Creare una directory principale per i dati (ad esempio, ./data/).
    2. Creare una sottodirectory dedicata per ogni campione (ad esempio, ./data/sample_A1/).
    3. Trasferire (copiare o spostare) i seguenti file essenziali per ogni campione nelle rispettive sottocartelle.
      1. Posizionare il filtered_feature_bc_matrix.h5 inserire nella sottodirectory principale del campione.
      2. Crea un spaziale/ sottocartella all'interno di ogni directory del campione
      3. Inserire i seguenti file nella spaziale/ sottocartella: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz e tissue_hires_image.png.gz.
    4. Decomprimere il .gz file nella spaziale/ cartella. Assicurarsi che i nomi originali dei file rimangano esattamente come richiesto dal Load10X_Spatial funzione (ad es., tissue_positions_list.csv).
      NOTA: La struttura finale, organizzata per un caricamento senza interruzioni, deve seguire questo schema, utilizzando il campione A1 come esempio:
      ./data/campione_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/campione_A1/spaziale/posizioni_tessuto_elenco.csv
      ./data/campione_A1/spaziale/fattori_di_scala_json.json
      ./data/campione_A1/spaziale/immagine_tessuto_alta_risoluzione.png

2. Configurazione dell'ambiente software

  1. Installare R (versione 4.4.3 o successiva).
  2. Acquisire gli script di analisi (1_ReadSpatialData.R fino a 8_Giotto_Communication.R) dal repository GitHub (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, al commit hash 2d85e18 per garantire la riproducibilità).
  3. Installare i pacchetti R richiesti da CRAN e Bioconductor eseguendo lo script setup.R.
    NOTA: Un elenco completo delle versioni specifiche dei pacchetti utilizzati in questo flusso di lavoro è fornito nella Tabella dei Materiali ed è disponibile anche nel file session_info.txt all'interno del repository GitHub associato (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
  4. Installare la Giotto Suite eseguendo i comandi di installazione forniti nella documentazione ufficiale.
    1. Accedere all'URL ufficiale di installazione per recuperare gli script di configurazione: https://giottosuite.com/articles/installation.html
    2. Inizializzare l'ambiente Python richiesto e le dipendenze di sistema seguendo le istruzioni passo dopo passo.
  5. Installare pacchetti aggiuntivi per una visualizzazione avanzata.
    1. Eseguire: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
  6. Installare lo strumento personalizzato Select Spatial Spots. Assicurarsi che il sistema operativo sia Windows, macOS o Linux e che sia installata la versione di Python 3.8 o successiva. Questo passaggio è facoltativo.
    1. Acquisire lo strumento accedendo al repository GitHub (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, al commit hash d20946e per garantire la riproducibilità) e scaricando il codice sorgente.
    2. Entrare nella directory dello strumento e installare le dipendenze Python: pip install -r requirements.txt
  7. Installare il pacchetto glmGamPoi eseguendo BiocManager::install("glmGamPoi") per accelerare la normalizzazione SCTransform.
    NOTA: Il flusso di lavoro principale richiede soltanto i pacchetti elencati nei passaggi 2.1–2.3 e 2.6. Il pacchetto Rfast2 viene utilizzato per velocizzare il calcolo della statistica di Moran's I. I pacchetti facoltativi del passaggio 2.5 servono per generare grafici pronti per la pubblicazione con un tema in stile prism (ggprism) e per accedere a una tavolozza di colori adatta ai daltonici (colorBlindness). Lo strumento del passaggio 2.6 abilita la funzionalità interattiva di selezione dei punti. Eseguire il comando sessionInfo() e salvare l'intero output della console in un file di testo. Questo documento registra esattamente le versioni del software e le dipendenze dei pacchetti, elementi fondamentali per garantire la riproducibilità a lungo termine.

3. Caricamento dei dati spaziali e controllo di qualità (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. Caricare i dati spaziali negli oggetti Seurat.
    1. Utilizzare Read10X_Image per caricare manualmente l'immagine tissutale ad alta risoluzione, specificando image.dir e image.name.
    2. Utilizzare Load10X_Spatial con il parametro image impostato sull'oggetto immagine creato al punto 3.1.1 per creare l'oggetto Seurat.
  2. Calcolare le metriche di controllo qualità.
    1. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali utilizzando PercentageFeatureSet con il pattern ^mt-.
  3. Visualizzare e interpretare i dati in base alle metriche di controllo qualità.
    1. Generare grafici a violino di nCount_Spatial, nFeature_Spatial e percent.mt utilizzando VlnPlot.
    2. Creare grafici spaziali delle caratteristiche per queste metriche utilizzando SpatialFeaturePlot per identificare i punti al di fuori dell'area del tessuto.
      NOTA: Punto di controllo visivo: i punti al di fuori dell'area del tessuto mostrano tipicamente un numero basso di conteggi UMI (nCount_Spatial < 500) e una bassa rilevazione genica (nFeature_Spatial < 200).
    3. A scopo dimostrativo, applicare filtri per rimuovere i punti di bassa qualità (ad esempio, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Questo è un passaggio opzionale.
      NOTA: L'obiettivo principale del controllo qualità nella trascrittomica spaziale è identificare e annotare gli artefatti tecnici, come i punti al di fuori del tessuto. Per i dati dimostrativi del colon Visium, nFeature_Spatial > 200 e nCount_Spatial > 500 rimuovono i punti a bassa complessità o di fondo. Per tessuti con contenuto ridotto di RNA o sezioni degradate, esaminare i grafici a violino e i grafici spaziali delle caratteristiche prima di aumentare le soglie; per tessuti densi o con alto numero di UMI, potrebbero essere appropriate soglie più stringenti. Evitare di filtrare esclusivamente in base a valori elevati di espressione, a meno che non siano visibili doppietti, piegature del tessuto o chiari artefatti. Il filtraggio spesso non è raccomandato poiché rimuove fisicamente posizioni spaziali, il che potrebbe alterare la continuità della struttura tissutale nelle analisi spaziali successive.

4. Pre-elaborazione, integrazione e raggruppamento dei dati (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. Normalizzare e pre-elaborare i singoli campioni.
    1. Applicare la normalizzazione SCTransform a ciascun campione separatamente con assay = Spatial.
  2. Integrare più campioni.
    1. Preparare l'elenco degli oggetti normalizzati con SCT per l'integrazione. Assicurarsi che ogni oggetto abbia un assay "RNA" copiando l'assay "Spatial": spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​NOTA: Copiare l'assay "Spatial" in uno slot assay "RNA" standard rappresenta una soluzione necessaria per garantire la compatibilità con le funzioni di integrazione successive, originariamente progettate per oggetti Seurat a singola cellula.
    2. Utilizzare SelectIntegrationFeatures e PrepSCTIntegration per identificare le caratteristiche variabili condivise.
    3. Trovare gli ancoraggi di integrazione utilizzando FindIntegrationAnchors con normalization.method = "SCT".
    4. Integrare i dati utilizzando IntegrateData con normalization.method = "SCT".
  3. Eseguire la riduzione della dimensionalità e il clustering sull'assay integrato.
    1. Eseguire PCA sui dati integrati utilizzando RunPCA.
    2. Determinare il numero ottimale di componenti principali (PC) per l'analisi successiva calcolando la varianza cumulativa spiegata. Identificare il punto del gomito in modo programmato (ad esempio, il punto in cui la varianza cumulativa supera il 90% e il guadagno marginale scende al di sotto dello 0,1%), utilizzando il codice in 3_IntegrationAndClustering.R, righe 36-38. Il numero risultante di PC sarà indicato in seguito come pc.use.
    3. Eseguire RunUMAP con dims = 1:pc.use.
    4. Effettuare il clustering delle cellule utilizzando FindNeighbors con dims = 1:pc.use e FindClusters con resolution = 0,5. Modificare la risoluzione solo dopo aver verificato la stabilità dei cluster e la coerenza dei geni marcatore.
    5. Eseguire l'analisi dell'espressione differenziale tra gruppi di interesse (ad esempio, "B1_colon_d14" rispetto a "A1_colon_d0") utilizzando la funzione FindMarkers.
      ​NOTA: Controllo visivo: un'integrazione corretta mostrerà un adeguato mescolamento dei campioni nel grafico UMAP, mantenendo al contempo cluster biologicamente distinti.
  4. Identificare i geni variabili nello spazio.
    1. Per ciascun campione originale, eseguire FindSpatiallyVariableFeatures utilizzando il metodo "moransi" sull'assay "SCT" per calcolare l'autocorrelazione spaziale.

5. Pre-elaborazione dei dati di riferimento a singola cellula (4_scDataPreProcessing.R)

  1. Leggere la matrice di conteggio dell'RNA-seq a singola cellula utilizzando Read10X e creare un oggetto Seurat.
  2. Eseguire il controllo di qualità standard, la normalizzazione e il clustering.
    1. Calcolare la percentuale di letture mitocondriali (percent.mt) e filtrare le cellule (ad esempio, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
    2. Normalizzare i dati utilizzando SCTransform, impostando vars.to.regress = "percent.mt".
    3. Eseguire PCA, UMAP e raggruppare le cellule utilizzando il metodo dinamico di selezione dei componenti principali descritto al punto 4.3.2.
  3. Assegnare l'annotazione dei tipi cellulari.
    1. Calcolare i punteggi dei moduli per i geni marcatore canonici dei tipi cellulari utilizzando AddModuleScore.
    2. Assegnare l'annotazione ai cluster in base ai punteggi dei moduli e alle conoscenze biologiche disponibili. In alternativa, importare annotazioni pre-calcolate dai metadati.

6. Deconvoluzione guidata da riferimento con SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. Preparare i dati per SPOTlight.
    1. Convertire l'oggetto Seurat annotato a singola cellula e l'oggetto Seurat spaziale in oggetti SingleCellExperiment.
    2. Normalizzare in scala logaritmica i dati a singola cellula utilizzando logNormCounts.
  2. Eseguire la deconvoluzione con SPOTlight.
    1. Identificare i geni ipervariabili (HVGs) sui dati a singola cellula utilizzando modelGeneVar e getTopHVGs.
    2. Calcolare i geni marcatore per tipo cellulare utilizzando scoreMarkers e filtrare per marcatori ad alta qualità (ad esempio, mean.AUC > 0,8).
    3. Sottocampionare il riferimento a singola cellula per ogni tipo cellulare a un numero gestibile (ad esempio, 50 cellule) per ridurre il tempo computazionale.
    4. Eseguire la deconvoluzione utilizzando la funzione SPOTlight con weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster" e gene_id = "gene".
  3. Visualizzare ed esportare i risultati.
    1. Estrarre la matrice risultante dalla deconvoluzione (proporzioni dei tipi cellulari per spot).
    2. Utilizzare plotSpatialScatterpie per visualizzare la composizione cellulare sulle coordinate spaziali.
    3. Aggiungere i risultati della deconvoluzione ai metadati dell'oggetto Seurat spaziale utilizzando AddMetaData. Risultato atteso: una matrice di deconvoluzione con colonne contenenti le proporzioni dei tipi cellulari per ogni spot spaziale, grafici scatterpie spaziali che mostrano la composizione cellulare locale e un oggetto Seurat contenente le proporzioni di deconvoluzione come metadati.

7. Deconvoluzione indipendente dal riferimento con STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

  1. Preparare i dati spaziali.
    1. Estrarre la matrice di conteggio grezza dall'oggetto spaziale Seurat utilizzando GetAssayData con slot = "counts".
    2. Rimuovere i punti e i geni di bassa qualità utilizzando cleanCounts di STdeconvolve (ad esempio, min.lib.size = 100).
  2. Identificare i tipi cellulari latenti.
    1. Filtrare ulteriormente il corpus per i geni espressi in una frazione minima di punti utilizzando restrictCorpus (ad esempio, removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
    2. Adattare un modello Latent Dirichlet Allocation (LDA) su un intervallo di numeri di argomenti potenziali (K) (ad esempio, Ks = seq(2, 9, by = 1)) utilizzando fitLDA.
    3. Selezionare il modello ottimale in base alla perplessità minima utilizzando optimalModel con opt = "min".
  3. Analizzare e visualizzare i risultati.
    1. Estrarre le proporzioni dei tipi cellulari (argomenti) (theta) e i profili genici (beta) dal modello ottimale utilizzando getBetaTheta.
    2. Per facilitare l'interpretazione biologica degli argomenti deconvoluti, importare le annotazioni delle regioni di interesse (ROI) generate dallo strumento "Select Spatial Spots" (vedere passaggio 9.3.3). Utilizzare queste annotazioni come parametro groups nella funzione vizAllTopics per proiettare le proporzioni dei tipi cellulari deconvoluti nuovamente sulle coordinate spaziali e codificare i punti per colore in base al loro ROI. Questo è un passaggio facoltativo.
      NOTA: Risultato atteso: STdeconvolve dovrebbe restituire valori theta che rappresentano le proporzioni degli argomenti per ogni punto e valori beta che rappresentano i profili genici per ciascun argomento. Se gli utenti desiderano confrontare quantitativamente i risultati non supervisionati di STdeconvolve con gli output guidati da riferimento di SPOTlight (dal Passaggio 6), possono esportare entrambe le matrici di proporzioni (theta da STdeconvolve e la matrice SPOTlight) e calcolare metriche di correlazione o concordanza per ogni punto (ad esempio, correlazione di Pearson o Spearman) utilizzando funzioni R standard. Il confronto quantitativo tra SPOTlight e STdeconvolve è facoltativo e non è richiesto per l'esecuzione del flusso di lavoro principale; tuttavia, le matrici di output pertinenti sono disponibili dai Passaggi 6.3.1 e 7.3.1 per gli utenti che desiderano effettuare tale analisi.

8. Comunicazione spaziale tra cellule mediante Giotto(8_Giotto_Communication.R)

  1. Convertire l'oggetto Seurat in un oggetto Giotto.
    1. Utilizzare la funzione createGiottoObject, fornendo la matrice dei conteggi grezzi e le coordinate spaziali.
  2. Pre-elaborare l'oggetto Giotto e aggiungere i risultati della deconvoluzione.
    1. Normalizzare i dati utilizzando normalizeGiotto.
    2. Aggiungere le annotazioni dei tipi cellulari (ad esempio, il tipo cellulare principale ottenuto dalla deconvoluzione SPOTlight) ai metadati cellulari utilizzando addCellMetadata.
  3. Inferire la comunicazione cellula-cellula informata spazialmente.
    1. Creare una rete spaziale utilizzando createSpatialNetwork con method = "Delaunay" e name = "Delaunay_network".
    2. Caricare un database di ligandi-recettori nell'ambiente R. Assicurarsi che l'oggetto caricato sia formattato come un data frame con due colonne distinte che rappresentano i simboli genici del ligando e del recettore (ad esempio, una rete murina precompilata da Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versione v6, pubblicata il 7 aprile 2025).
    3. Eseguire exprCellCellcom con cluster_column = "celltype_major" per identificare interazioni significative ligando-recettore tra tipi cellulari che sono in prossimità spaziale. Risultato atteso: una tabella contenente coppie ligando-recettore, combinazioni di tipi cellulari sorgente e bersaglio, valori di log2 fold-change e valori di P aggiustati; conservare le interazioni significative (ad esempio, p.adj < 0,05) per la visualizzazione.

9. Selezione interattiva di spot con selezione di spot spaziali (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. Preparare i dati per lo strumento interattivo.
    1. Estrarre le coordinate spaziali dall'oggetto Seurat utilizzando GetTissueCoordinates.
  2. Formattare ed esportare i dati.
    1. Formattare il frame di dati delle coordinate in modo che contenga esattamente le intestazioni di colonna: CELL_ID, X e Y.
    2. Esportare il frame di dati formattato in un file CSV.
  3. Eseguire l'analisi della regione di interesse (ROI).
    1. Avviare l'applicazione personalizzata Dash Select Spatial Spots e caricare il file CSV.
    2. Selezionare interattivamente i punti in base alla posizione spaziale.
    3. Esportare l'elenco dei punti selezionati e le relative etichette di gruppo/ROI assegnate in un nuovo file CSV. Risultato previsto: un file CSV contenente gli identificatori dei punti, le coordinate X/Y e le etichette di gruppo/ROI assegnate, che possono essere associati nuovamente all'oggetto Seurat tramite CELL_ID.

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Risultati

Implementazione del flusso di lavoro e integrazione dei dati illustrano le caratteristiche principali dei tessuti

Il flusso di lavoro computazionale è stato applicato ai dati di trascrittomica spaziale del colon del topo per illustrare gli output attesi in ciascuna fase analitica. Come mostrato nello schema del flusso di lavoro (Figura 1), la procedura è iniziata con l'acquisizione dei dati e il controllo di qualità, in cui i grafici delle caratte...

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Discussione

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro computazionale completo per l'analisi dei dati di trascrittomica spaziale, che coniuga profondità analitica e accessibilità pratica. L'approccio passo dopo passo guida i ricercatori attraverso l'intero percorso analitico, dalla acquisizione iniziale dei dati fino ad analisi spaziali avanzate, sottolineando al contempo i punti critici decisionali e i potenziali ostacoli.

Diversi passaggi del protocollo richiedono particolare attenzione a causa del ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano gli sviluppatori e i manutentori dei pacchetti Seurat, Giotto e SPOTlight per il supporto e la documentazione forniti. Si riconosce inoltre con gratitudine il contributo dei repository di dati pubblici e dei ricercatori che hanno generosamente condiviso i loro set di dati.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)Visualizzazione avanzata dei dati
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)Analisi di reti spaziali e comunicazione tra cellule
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)Composizione e disposizione dei grafici
R software Fondazione R per il Calcolo Statisticov4.4.3Ambiente principale di esecuzione (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)Controllo qualità e visualizzazione a singola cellula
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)Modellazione della varianza a singola cellula e rilevamento di marcatori
Select Spatial Spots (Strumento Python personalizzato)LeafLightv1.0.0 (GitHub)Selezione interattiva di regioni di interesse spaziali (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)Pre-elaborazione, integrazione e raggruppamento dei dati spaziali
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)Strutture dati per dati a singola cellula e spaziali
SingleCellExperimentSquadra principale di Bioconductorv1.28.1 (Bioconductor)Contenitore standardizzato per dati scRNA-seq
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)Deconvoluzione spaziale guidata da riferimento
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)Modellazione non supervisionata di argomenti latenti
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)Pacchetto principale per manipolazione e formattazione dei dati

Riferimenti

  1. Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
  2. Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
  3. Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
  4. Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
  5. Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
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