Articolo metodologico

Stabilimento e analisi del rigetto acuto mediato da anticorpi nel trapianto cardiaco murino

DOI:

10.3791/70191

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13 febbraio 2026

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1Organ Transplantation Research Institution, Division of Kidney Transplantation, Department of Surgery, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo studio ha stabilito un modello pratico di topo di rigetto acuto mediato da anticorpi dopo trapianto cardiaco, caratterizzato da una robusta produzione di DSA, cambiamenti patologici tipici e una sopravvivenza moderata allotrapetto.

Abstract

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Un fattore importante che contribuisce al fallimento dell'allotrapiante nei riceventi di trapianto cardiaco è il rigetto mediato dagli anticorpi (AMR). Il modello AMR del topo, quindi, rappresenta uno strumento vitale per decifrarne i meccanismi sottostanti e favorire lo sviluppo di trattamenti innovativi. In questo studio, i topi riceventi sono stati divisi in tre gruppi: non sensibilizzati (NS), presensibilizzati (PS) e presensibilizzati con trattamento con ciclosporina A (PS + CsA). Il gruppo NS, che ha mostrato una sopravvivenza media allotrapianto di 6,8 ± 0,7 giorni, non ha mostrato alcun aumento dei livelli seronici di DSA e colorazione negativa dell'allotrapianto C4d entro quattro giorni dal trapianto cardiaco (TC), suggerendo una patologia dominata dal rigetto cellulare acuto. Questo studio ha stabilito un modello AMR acuto presensibilizzando i riceventi con trapianto cutaneo (ST) una settimana prima della TAC, preattivando così il sistema immunitario. Questo approccio ha indotto con successo un fenotipo grave di AMR, come dimostrato da una breve sopravvivenza allotrapo di 2,8 ± 0,4 giorni, un aumento significativo dei livelli di DSA-IgG dopo ST e post-TC, e segnali patologici precoci di vasculite e estesa deposizione di C4d entro 12 ore dalla TAC. Tuttavia, l'estrema severità di questo modello ne limita l'applicazione più ampia. Per minimizzare l'attivazione concomitante delle cellule T indotta dalla ST e stabilire un modello acuto di AMR più specifico, questo studio ha somministrato ciclosporina A. Di conseguenza, il gruppo PS + CsA ha mostrato un tempo di sopravvivenza allotrapo di 5,2 ± 0,4 giorni. I livelli sierici di DSA-IgG erano significativamente elevati al settimo giorno dopo la ST e sono rimasti alti entro cinque giorni dalla TAC. La valutazione patologica al secondo giorno post-TAC ha confermato una significativa vasculite e deposizione di C4d, risultati che collettivamente soddisfano i criteri diagnostici per l'AMR acuta moderatamente grave. In conclusione, questo studio ha stabilito un modello murino altamente pratico e traducibile di AMR acuta dopo la TAC, definito da una produzione robusta di DSA, cambiamenti patologici caratteristici e una sopravvivenza moderata allotrapo.

Introduzione

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Il trapianto cardiaco (TC) rimane la terapia di riferimento per le malattie cardiache in faseterminale 1. Sebbene la sopravvivenza mediana post-trapianto superi ora i 13 anni, il fallimento dell'innesto a lungo termine rimaneinevitabile 2. Il rigetto mediato dagli anticorpi (AMR) è un fattore importante che contribuisce alla perdita tardiva del trapianto dopo laTAC 3. Studi hanno dimostrato che l'incidenza della perdita di innesto dovuta alla RAM supera quella causata dal rigetto mediato dalle cellule T, e il rischio di fallimento dell'innesto nella RAM a insorgenza tardiva è circa il doppio di quella dell'AMRprecoce 4,5. Pertanto, l'identificazione precoce e l'intervento tempestivo per la RAM sono fondamentali per migliorare la sopravvivenza dell'innesto.

La RAM è guidata da anticorpi specifici del donatore (DSA), che causano fallimento dell'innesto tramite attivazione del complemento, infiammazione vascolare e lesioniischemiche 6. Il legame della DSA all'endotelio vascolare innesca danni endoteliali, favorisce la trombosi e induce risposte infiammatorie sia acute che croniche. I principali meccanismi della lesione mediata dalla DSA coinvolgono la citotossicità dipendente dal complemento e le vie cellulari di citotossicità dipendenti daglianticorpi 7. Sebbene siano state sviluppate terapie mirate come l'anticorpo anti-C5 eculizumab e l'agente depauperante delle cellule B rituximab, gli esiti clinici nella RAM in stadio avanzato rimangonoinsoddisfacenti 7,8,9. Pertanto, ulteriori indagini meccanicistiche utilizzando modelli animali acuti sono essenziali per comprendere meglio la progressione della malattia e identificare nuovi bersagli terapeutici.

Il modello eterotopico vascolarizzato del topo è una piattaforma ben consolidata per lo studio della TAC, in particolare nella lesione e rigetto diischemia-reperfusione 10,11,12. La funzione dell'innesto viene tipicamente monitorata dalla palpazione addominale quotidiana dell'intensità del battito cardiaco, che riflette lo stato funzionale e definisce l'insufficienza dell'innesto13. Tuttavia, i modelli convenzionali spesso non rilevano l'insorgenza della RAM poco dopo il trapianto e quindi richiedono una presensibilizzazione per indurre la formazione di DSA e scatenare l'AMR acuta. Inoltre, i ceppi di topo differiscono nella reattività immunitaria; ad esempio, i topi C57BL/6 mostrano una maggiore attivazione del complemento, mentre i topi BALB/c preferiscono risposte sbilanciate verso Th214,15. Di conseguenza, sia la strategia di presensibilizzazione sia la selezione del ceppo del destinatario sono determinanti critici delle prestazioni del modello.

In studi precedenti, questo team ha utilizzato diversi ceppi di ratto per il trapianto renale dopo il trapianto cutaneo (ST), ha stabilito un modello AMR e analizzato le sue caratteristiche, accumulando notevoleesperienza 16,17,18. Nel 2021, questo team ha ulteriormente sviluppato un modello murino AMR acuto indotto da ST nella TAC per la ricerca fondamentale, che ha dimostrato grandestabilità 19. A differenza della presensibilizzazione relativamente inefficiente tramite trasfusione di sangueallogenea 20 o dell'infusione di linfociti della milza più complessa e lunga21, ST offre un protocollo di sensibilizzazione robusto, stabile e semplice. Questo modello facilita la rilevazione precoce post-trapianto di livelli elevati di DSA sierici e lesioni allotrapiante osservabili da AMR acuta, rendendolo particolarmente adatto per studi interventistici su AMR acuta. Tuttavia, l'AMR acuta indotta dalla ST è tipicamente grave, causando danni tissutali significativi che spesso mascherano la progressione di una lesione cronica. Questo studio mira a fornire una descrizione dettagliata della metodologia e delle procedure utilizzate per stabilire questa modalità, analizzare le caratteristiche immunologiche e patologiche del modello e riassumere l'esperienza pratica.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in rigorosa conformità con i regolamenti di gestione sperimentale degli animali del Guangdong, la Dichiarazione di Helsinki e i principi delle 3R. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato di Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (numero di approvazione JENNIO-IACUC-2024-A027). Maschi Balb/c e topi C57BL/6 (6-8 settimane, con un peso 20-25 g), tutti di grado specifico da patogeno (SPF), sono stati ottenuti da una fonte commerciale. I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono dettagliati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli animali

  1. Ospita il topo di grado SPF nel sistema appropriato della struttura animale.
  2. Dividere i topi in tre gruppi sperimentali come descritto nella Figura 1
    1. Gruppo non sensibilizzato (NS): Utilizzare topi Balb/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi per la TAC.
    2. Gruppo presensibilizzato (PS): Utilizzare topi Balb/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi per ST, seguiti dalla TAC una settimana dopo.
    3. Presensibilizzato + gruppo ciclosporina A (PS + CsA): Usare topi Balb/c come donatori e topi C57BL/6 come riceventi per ST, seguiti dalla TAC una settimana dopo. Dal giorno della ST, iniettare sottocutaneamente i topi riceventi con CsA a 2 mg/(kg·g) fino al fallimento dell'innesto o alla raccolta del campione dell'innesto.

2. Preparazione preoperatoria

  1. Assicurati che i topi donatori non siano privati di cibo o acqua prima dell'intervento, mentre i topi riceventi siano a digiuno per 8 ore ma non privi di acqua.
  2. Anestesia
    1. Mettere il topo in una camera di induzione anestesica per l'induzione (concentrazione di isoflurano: 3%-4%; Portata: 300-500 mL/min) (seguendo protocolli approvati dall'istituzione). Scuoti la camera di induzione per verificare se l'animale è completamente anestetizzato.
      NOTA: Se l'animale viene girato su un fianco e non tenta di tornare in posizione prona, indica anestesia completa.
    2. Dopo aver regolato la concentrazione di mantenimento sulla piattaforma chirurgica, rimuovere il topo dalla camera di induzione, fissare il naso nella maschera anestetica (concentrazione di isoflurano: 1,0%-2,5%; Portata: 100-200 mL/min), e controllare se il topo è completamente anestetizzato (premere la zampa o la coda con un dito; se non c'è risposta, indica anestesia completa).

3. Presensibilizzazione tramite ST (per i Gruppi 2 e 3)

  1. Prelievo della pelle della coda donatrice
    1. Disinfettare la pelle caudal dei topi donatori anestetizzati con alcol al 75%.
    2. Usare un bisturi per amputare la coda (al terzo distale), fissare il moncone con le pinze della mano sinistra e usare il bisturi nella mano destra per tagliare la pelle tra le vene della coda, esponendo il tendine bianco sottostante. Poi, fissa il coccige con una pinza, usa pinze curve per bloccare la pelle all'incisione e rimuovi con cura.
    3. Inserire la pelle scrostata in un becher contenente soluzione salina sterile e gelata, con il tessuto rivolto verso il basso. Taglia un pezzo di pelle di 1,0 cm × 1,0 cm per un uso successivo.
  2. ST dorsale ricevente
    1. Rasi il pelo dalla zona dorsale dei topi riceventi anestetizzati con un tagliacapelli, disinfetta con alcol al 75% e posiziona un drappo sterile.
    2. Usa un bisturi per incidere la pelle, afferra i bordi con una pinza dentata e taglia un pezzo di pelle leggermente più grande di 1,0 cm × 1,0 cm con forbici per creare il letto di innesto.
    3. Posizionare l'innesto di pelle donatore sul letto con il lato del tessuto verso il basso. Dopo aver tagliato l'innesto, sutura la pelle donatrice alla pelle ricevente al microscopio usando 8-0 filo di nylon, assicurando che la pelle donatrice sia posizionata in modo uniforme sul letto dell'innesto.
    4. Copri la ferita con una benda adesiva sterile e metti il topo in una gabbia di alloggio dopo che ha ripreso conoscenza.

4. TAC

  1. Prelievo del cuore da donatore
    1. Rasi il pelo dal petto e dall'addome dei topi donatori anestetizzati con un tagliacapelli, disinfetta con alcol al 75% e posiziona un drappo sterile.
    2. Eseguire un'incisione addominale mediana con un bisturi, esponendo il segmento superiore della vena cava inferiore, e iniettare 1 mL di soluzione fisiologica fredda eparinizzata da 50 U/mL (4 °C) nella vena cava inferiore usando una siringa.
    3. Usa forbici per il tessuto per aprire la cavità toracica ed esporre il cuore. Isolare l'aorta ascendente e seporla prima del suo primo ramo; isolare l'arteria polmonare e trasectarla nella sua biforcazione; legare la vena cava inferiore e il tessuto connettivo all'ilo polmonare usando suture 6-0 non traumatiche; Tagliare il tessuto distale nel sito della legatura con forbici e rimuovere il cuore.
    4. Inserisci rapidamente il cuore prelevato in 2 mL di soluzione ipertonica di citrato adenina (HCA) e conservalo in una miscela di acqua ghiacciata per un uso successivo. Eutanasia il topo donatore utilizzando il metodo della lussazione cervicale.
  2. Ricevitore CT
    1. Radere il pelo dall'addome dei topi riceventi anestetizzati con un tagliacapelli, disinfettare con alcol al 75% e posizionare una copertura sterile.
    2. Solleva la pelle con una pinza dentata e fai un'incisione mediana nella parete addominale dal processo xifoide alla base della vescica usando forbici di tessuto. Metti una garza sterile e umida su entrambi i lati dell'incisione per proteggerla.
    3. Usa cotton bab sterili per spingere le anse intestinali sul lato destro dell'incisione e avvolgile con garze umide. Dopo aver dissezionato bruscamente il peritoneo, esponi la vena cava inferiore e l'aorta addominale, lega le vene lombari e usa una pinza vascolare per fermare il flusso sanguigno alle estremità distale e prossimale dell'aorta e della vena cava.
    4. Al microscopio, si usano microforbici per incidere la parete venosa di circa 2 mm, corrispondendo al diametro dell'arteria polmonare cardiaca donatrice; Analogamente, incidere la parete arteriosa di 1-2 mm, corrispondendo al diametro dell'aorta cardiaca ascendente del donatore.
    5. Prendi il cuore donatore ed esegui un'anastomosi laterale tra l'arteria polmonare cardiaca donatrice e la vena cava inferiore del ricevente utilizzando suture 12-0 non traumatiche. Analogamente, eseguire un'anastomosi laterale tra l'aorta ascendente cardiaca del donatore e l'aorta addominale del ricevente (quando si fa l'ultimo nodo, si utilizza soluzione salina per far uscire l'aria dal lume; durante l'anastomosi si gocciola intermittente di soluzione salina a 4 °C sulla superficie del cuore donatore per raffreddarlo).
    6. Rilasciare la pinza vascolare e ripristinare l'apporto sanguigno al cuore (si vede la normale impennazione delle arterie coronarie, il cuore diventa rosa e riprende a battere entro 1-2 minuti). Dopo aver reinserito i circuiti intestinali, chiudi la cavità addominale con punti di nylon 4-0.
      NOTA: Se il sanguinamento intraoperatorio supera 0,5 mL, somministrare soluzione fisiologica normale per via sottocutanea per mantenere il volume di liquido.
    7. Postoperatorio, posizionare i topi su una piattaforma di riscaldamento a 37 °C per il monitoraggio. Quando il topo destinatario riprende conoscenza, rimettilo nella gabbia di alloggio. Il topo riprende il normale mangiare e bere dopo l'intervento.

5. Cure postoperatorie e monitoraggio

  1. Osservazione delle condizioni generali
    1. Assicurati di osservare quotidianamente lo stato doloroso del topo dopo l'intervento, se si tratta di ridotta appetito, minore attività, leccatura o grattamento eccessivo della ferita, o aumento dell'aggressività.
    2. Assicurati di osservare quotidianamente la ferita chirurgica dopo l'intervento, controllando la presenza di rossori, gonfiore, essudati o sintomi di infezione purulenta. Se necessario, pulire e disinfettare la ferita.
  2. Osservazione della sopravvivenza dell'innesto cardiaco
    1. Assicurati osservazione e palpazione quotidiane per controllare e registrare la forza del battito cardiaco trapiantato. Se necessario, anestetizzare il topo e praticare un'incisione per osservare il battito cardiaco.
      NOTA: Quando il battito cardiaco del cuore trapiantato si ferma completamente, viene registrato come insufficienza dell'innesto e viene annotato il tempo di sopravvivenza.

6. Valutazioni post-operatorie

  1. Rilevamento del livello DSA
    1. Nel gruppo NS, prescolare i campioni di sangue nei giorni postoperatori 0, 4 e 7 dopo la TAC per monitorare i livelli di DSA dopo il trapianto. Nel gruppo PS, raccogliere campioni nei giorni 0, 4 e 7 dopo ST e nei giorni 1 e 3 dopo la TAC per valutare la dinamica della DSA dopo la presensibilizzazione. Nel gruppo PS+CsA, prelevare sangue nei giorni 0, 4 e 7 dopo ST e nei giorni 1, 3 e 5 dopo la TAC per valutare gli effetti di CsA sui livelli di DSA.
    2. Centrifugare il campione di sangue intero dal topo ricevente e raccogliere il siero (2000 x g, 10 min, 4 °C); diluire il siero 10 volte con PBS e incubarlo con cellule di milza di topo donato a 37 °C per 30 minuti.
    3. Dopo centrifugazione a 350 × g e 4 °C per 5 minuti, si scarta il soprandante. Lavare le cellule pipettando delicatamente 1 mL di PBS e ripetere questo passaggio due volte dopo la centrifugazione successiva.
    4. Incubare le cellule con l'anticorpo IgG anti-topo con fluoresceina isotiocianato (FITC) e con anticorpo IgM anti-topo di ficoeritrina (PE) a 4 °C per 1 ora.
    5. Dopo aver lavato le cellule con PBS, risospendile a una concentrazione di 5 × 106 /mL.
    6. Utilizzare la citometria a flusso per rilevare separatamente i due anticorpi e analizzare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per valutare i livelli di DSA (IgG, IgM) nel topo ricevente (Impostazioni parametri: acquisire 10.000 eventi per l'analisi. Usa FSCA vs. SSCA per escludere i detriti, poi applica FSCA vs. FSCH gating per rimuovere i doppietti. Includere un controllo negativo e regolare la tensione di ogni canale per posizionare la popolazione negativa nell'intervallo 100-10 1 ).
  2. Esame istopatologico dell'innesto cardiaco
    1. Raccogliere innesti a 6 ore, 12 ore, 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 4 giorni e 5 giorni dopo la TAC. Dopo la prelieva, fissare i trapianti al 4% di paraformaldeide, inserirli regolarmente nella paraffina, sezionare e colorare con ematossilina-eosina (H&E). Osserva i cambiamenti patologici degli innesti sotto un microscopio lucico 400x.
  3. Colorazione C4d
    1. Taglia i campioni incastonati in paraffina in sezioni da 4 μm, appiattisci le sezioni in acqua a 42 °C e asciugale in forno a 60 °C per 30 minuti.
    2. Deparaffina e idrata il tessuto utilizzando sequenzialmente xilene I, xilene II, etanolo e acqua deionizzata.
    3. Immergi le sezioni in soluzione di recupero dell'antigene EDTA, riscalda a 95-100°C per circa 15 minuti e raffredda a temperatura ambiente.
    4. Incubare le sezioni con soluzione di perossido di idrogeno al 3% a temperatura ambiente per 10-15 minuti per inattivare la perossidasi endogena.
    5. Diluire gli anticorpi anti-C4d (1:200) con diluente anticorpale e incubare con le sezioni a 4 °C durante la notte. Dopo l'incubazione, lavare le sezioni con PBS.
    6. Aggiungi gli anticorpi secondari corrispondenti e incuba a temperatura ambiente per 30 minuti, poi lava con PBS.
    7. Aggiungi la soluzione di cromogeno DAB e incuba a temperatura ambiente per 30 secondi per la colorazione.
    8. Esegui la controcolorazione con ematossilina, disidrata con etanolo, immergi nello xilene e monta con resina neutra.
    9. Osserva i risultati della colorazione degli innesti sotto un microscopio luminoso 400x.

7. Analisi statistica

  1. Usa la deviazione media ± standard per presentare tutti i dati.
  2. Utilizzare il test t per confronti di gruppo di dati continui con distribuzione normale, mentre utilizzare il test Mann-Whitney U per confronti di gruppo di dati continui che non seguono una distribuzione normale.
  3. Utilizzare l'analisi di Kaplan-Meier per confrontare il tempo di sopravvivenza degli alografi cardiaci tra gruppi.
  4. Usa SPSS versione 27.0 per analizzare statisticamente tutti i dati e considera un P-valore di <0.05 come statisticamente significativo.

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Risultati

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Tempo di sopravvivenza allotrapo cardiaco
Al momento dell'istituzione con successo del modello murino, i tempi di sopravvivenza dell'innesto tra i gruppi sono stati valutati utilizzando l'analisi di Kaplan-Meier. Come previsto, i topi del gruppo PS hanno mostrato una sopravvivenza media significativamente più breve degli allografi cardiaci rispetto a quelli del gruppo NS (2,8 ± 0,4 giorni contro 6,8 ± 0,7 giorni, P < 0,01), attribuibile alla RAM acuta. Per facilitare ...

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Discussione

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Attualmente, i trattamenti per la RAM in stadio avanzato rimangono inefficaci e mancano metodi affidabili per la sua diagnosi precoce 22,23,24,25. Per colmare questa lacuna, questo studio ha stabilito un modello topino AMR acuto per facilitare l'indagine meccanicistica. I destinatari sono stati presensibilizzati con ST e somministrati CsA per sopprimere l'aTCMR...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82200847), dal Science and Technology Project della città di Guangzhou (n. 2024A03J0765) e dal Guangdong Medical Science Research Fund (n. A2025268).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpi monoclonali anti-C4DHycult Biotech (Paesi Bassi)HP8034Per immunoistochimica (rilevamento della deposizione del complemento)
Set completo di strumenti microchirurgiciGuangzhou Qihua Medical Equipment Co., Ltd.Utilizzato per eseguire chirurgia di trapianto cardiaco di topo
Microscopio chirurgico stereoscopico a zoom continuoBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKUtilizzato per eseguire chirurgia di trapianto cardiaco di topo
Ciclosporina ANovartis Pharmaceuticals (Svizzera)H20100673Utilizzato per inibire la TCMR nei topi riceventi
Anticorpo IgG anti-topo FITCBio Legend (USA)406001Utilizzato per la quantificazione citometrica a flusso dei livelli DSA-IgG
Citometro a flussoBecton Dickinson, USABD FACScaliburUtilizzato per la valutazione dei livelli di DSA siero nei topi riceventi
Anticorpo IgM anti-topo PEBio Legend (USA)406507Utilizzato per la quantificazione citometrica a flusso dei livelli DSA-IgM
Sistema di anestesia per gas per piccoli animaliAnhui Zhenghua Bio-Instrument Equipment Co., Ltd.ZH-MZJEquipaggiato con isoflurano per anestesia generale
Pinze Bulldog VascolariROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TUtilizzato per bloccare il flusso sanguigno durante il trapianto cardiaco

Riferimenti

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