Questo protocollo descrive i passaggi necessari per la colonizzazione di topi con pks+ Escherichia coli in condizioni non infiammatorie, nonché metodi non invasivi per la validazione della colonizzazione e la valutazione dell'espansione di pks+ E. coli nelle feci.
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Articolo metodologico
Colonizzazione con Escherichia coli di Murine pks+ in condizioni non infiammatorie
In questo articolo
Sommario
Abstract
pks+ Escherichia coli è sempre più implicata nello sviluppo del cancro colorettale (CRC), in particolare tra un sottoinsieme in rapida espansione di pazienti più giovani con CRC a esordio precoce. I ceppi di pks+ E. coli producono la genotossina colibactina, nota per causare rotture a doppio filamento del DNA e mutazioni nelle vie di proliferazione e differenziazione cellulare associate al CRC. Questo articolo illustra un metodo per la colonizzazione di pks+ E. coli nei topi in condizioni non infiammatorie, dalla preparazione dell'inoculo batterico fino alla validazione della colonizzazione. Dopo l'incubazione notturna, il ceppo di pks+ E. coli NC101 viene somministrato ai topi condizionati agli antibiotici tramite gavage orale. La colonizzazione nelle feci viene valutata quantificando il numero di unità formatrici di colonie gram-negative (CFU) fermentanti di lattosio e tramite amplificazione quantitativa per PCR. Utilizzando questo protocollo, è stato dimostrato che, dopo la colonizzazione riuscita di topi C57BL/6 con E. coli NC101, l'integrazione con la fibra alimentare inulina ha promosso la crescita di pks+ E. coli, riflessa in un maggiore recupero delle CFU, maggiore abbondanza della famiglia Enterobacteriaceae e livelli aumentati di clbP Gene. In sintesi, questo modello consente lo studio di trattamenti preventivi e terapeutici rivolti a un patobionte chiave coinvolto nello sviluppo del CRC.
Introduzione
Il microbiota intestinale è noto per svolgere un ruolo significativo nella salute e nelle malattie dell'ospite, con la disbiosi microbica intestinale, ovvero una crescita eccessiva di alcuni batteri potenzialmente patogeni (patobioti), identificati come caratteristiche di diversi stati patologici, tra cui malattie cardiovascolari, malattie infiammatorie intestinali (IBD) ecancro 1. pks+ Escherichia coli è un patobionte arricchito nei campioni di tessuto colonico di pazienti conIBD 2 e cancro colorettale (CRC)3 rispetto a individui sani. L'attività pro-tumorigena di pks+ E. coli è collegata all'espressione del cluster genico polichetide sintasi (pks) e alla produzione della genotossina colibactina4. La libactina si trasloca nel nucleo delle cellule epiteliali del colon, portando alla formazione di rotture a doppio filamentodel DNA 5 e mutazioni nelle principali vie associate alCRC 6. La colonizzazione di pks+ E. coli ha dimostrato di contribuire all'inizio deltumore 7 e alla progressionetumorale 3 in modelli preclinici di CRC associata alla colite (CAC). Recentemente, la mutagenesi indotta dalla colibactina è stata associata a CRC 8,9 in esordio precoce. L'incidenza della CRC a esordio precoce, che si verifica in coloro sotto i 50 anni, è aumentata negli ultimi decenni, con il potenziale di invertire la diminuzione complessiva attuale dei tassi diCRC 9.
Il ruolo di pks+ E. coli nello sviluppo del CRC, così come in altri aspetti della salute dell'ospite mediati dal microbiota, continua a essere chiarito. Inoltre, diversi fattori hanno dimostrato influenzare l'espressione genica pks, tra cuiinfiammazione 10, concentrazioni di ferroluminale 11 e fattori alimentari12,13, aprendo la strada a interventi mirativi al microbiota. Qui è descritto un metodo per la colonizzazione intestinale di pks+ E. coli tramite gavage orale nei topi utilizzando un ceppo murino del ceppo di pks+ E. coli NC101 (E. coli NC101). Altri modelli hanno valutato gli effetti di E. coli NC101 su infiammazione e carcinogenesi in topi privi di germi (GF) monocolonizzati tramite gavage orale e tamponerettale 3, in modelli geneticamente suscettibili (IL-10-/-) dicolite 3,14, e in modelli chimicamente indotti di infiammazione del colon e alterazione della barrieraintestinale 15. Tuttavia, la colonizzazione economica con pks+ E. coli può essere ottenuta anche in condizioni non infiammatorie in topi privi di patogeni specifici (SPF) pretrattati con antibiotici per creare una nicchia di colonizzazione edespansione 14,16,17. Sono inoltre presentati vari metodi per la rilevazione e quantificazione di pks+ E. coli nelle feci di topo, tra cui l'amplificazione quantitativa per PCR (qPCR) del gene clbP, la valutazione qPCR dell'abbondanza della famiglia Enterobacteriaceae e il recupero delle unità formative di colonie (CFU) su mezzi agar MacConkey specifici per batteri fermentatori di lattosio gram-negativi. Questi metodi possono essere utilizzati in modo intercambiabile o in combinazione per confermare la presenza di pks+ E. coli e la produzione di colibactina a fini di validazione o per valutare le differenze nell'espansione di pks+ E. coli in risposta a interventi mirativi al microbiota.
Qui, questo protocollo viene utilizzato per valutare l'effetto della fibra alimentare inulina sulla colonizzazione e l'espansione di pks+ E. coli tramite qPCR e sul recupero delle CFU. L'inulina è un prebiotico che ha dimostrato di promuovere la crescita di specie benefiche di Bifidobacterium e Lactobacillus nell'intestino, oltre ad aumentare la produzione di acidi grassi a catena corta, che svolgono un ruolo importante nell'omeostasiintestinale 18. Tuttavia, è stato dimostrato che l'inulina favorisce anche la crescita della produzione di pks+ E. coli e colibactina, portando a un aumento della tumorigenesi in un modello di poliposi adenomatosa coli (Apc)Min/+ CRC trattato con DSS. Questo esperimento valuta l'espansione di pks+ E. coli in risposta all'inulina dietetica in un modello murino senza infiammazione o una barriera intestinale compromessa.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite secondo le linee guida del Canadian Council of Animal Care dopo l'approvazione da parte del Comitato Istituzionale per la Cura degli Animali del Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM). I topi di sette settimane sono stati ottenuti da una fonte commerciale e sono stati acclimatati per una settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Una rappresentazione schematica di questo metodo è presentata nella Figura 1. I dettagli degli animali, reagenti e attrezzature utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Figura 1: Schema della preparazione e colonizzazione di pks+ E.coli. Giorno (D)-4: Quattro giorni prima della gage, iniziare a prendere antibiotici per i topi. D-1: 24 ore prima della gavage, rimuovere gli antibiotici. Prepara la coltura di E. coli pks+ per l'incubazione notturna. D0: Preparare l'inoculo batterico pks+ E. coli. Somministrare il pks+ E. coli o un veicolo di controllo (soluzione salina) ai topi tramite gavage orale il prima possibile dopo la preparazione dell'inoculo. D7+ Raccogliere feci dai topi per la rilevazione e quantificazione della colonizzazione da pks+ E. coli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Trattamento antibiotico
- Diluire ampicillina, colistina e streptomicina in acqua potabile sterile fino a una concentrazione finale di 1 mg/mL per ampicillina, 1 mg/mL per la colistina e 5 mg/mL per la streptomicina.
- Consentire l'accesso ad libitum agli antibiotici nell'acqua potabile per 3 giorni.
- Rimuovere gli antibiotici e ripristinare l'accesso all'acqua sterile per un periodo di lavaggio di 24 ore prima della goffa con l'inoculo NC101 di E. coli.
NOTA: La soluzione antibiotica deve essere preparata fresca per ogni esperimento. Bisogna monitorare un'adeguata assunzione della soluzione antibiotica. Se necessario, può essere aggiunto un dolcificante all'acqua.
2. Preparazione dell'inoculo NC101 di E. coli (fino a n = 12 topi)
NOTA: I passaggi 2.1-2.8 devono essere eseguiti con la tecnica asettica.
- Prepara e autoclave il brodo di lisogenesi (LB).
- Striscia E. coli NC101 da stock di glicerolo su una piastra agar LB utilizzando un anello inoculante sterile. Incubare durante la notte a 37 °C.
- Inoculare 5 mL di brodo sterile LB in un tubo di coltura con una singola colonia dalla piastra agar LB utilizzando un anello inoculante. Incubare durante la notte a 37 °C in uno shaker da banco a 150 giri/min.
- Centrifuga il tubo di coltura a 1500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovi e scarta il surnante, evitando il pellet batterico, che apparirà come un deposito biancosporco alla base del tubo.
- Risospendere il pellet batterico in 5 mL di soluzione salina sterile allo 0,9%.
- Lava ripetendo i passaggi dal 4 al 6.
- Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) usando un densimetro cellulare e regolare il OD600 a 0,625 (~1 x 10,8 CFU/mouse) usando soluzione salina sterile.
NOTA: Per evitare contaminazioni batteriche del brodo nel passo 3, incubare un tubo separato da 2-3 mL di brodo sterile LB durante la notte. Il brodo dovrebbe rimanere trasparente dopo l'incubazione notturna, indicando l'assenza di contaminazione batterica. Se il diametro di apertura600 è inferiore a 0,625, ripetere i passaggi 4-6, utilizzando un volume minore per risospendere il pellet. Per garantire una dosaggio accurata di E. coli NC101, le diluizioni seriali del liquido del gavage devono essere impiattate e coltivate durante la notte. Il numero di CFU per ogni diluizione può essere utilizzato per stimare la quantità iniziale di CFU nella sospensione batterica.
3. Gavage orale di E. coli NC101
- Agita delicatamente l'inoculo batterico per garantire una distribuzione equa dei batteri.
- Inserisci l'ago del gavage su una siringa da 1 mL e riempi con 0,2 mL di inoculo batterico, rimuovendo eventuali bolle d'aria.
- Rimuovi il topo dalla gabbia e spalma delicatamente ma con fermezza la pelle afferrando la pelle da appena dietro le orecchie fino alle scapole, usando il pollice e il lato dell'indice. Fissa la coda con il dito medio o anulare dalla stessa mano.
- Tieni il topo in posizione verticale e inserisci l'ago del garagio sul lato della bocca. Fai scorrere l'estremità dell'ago del garante lungo il palato e nell'esofago e nello stomaco, spingendo delicatamente la testa del topo per estendere il collo. Se si avverte resistenza, rimuovi l'ago del gavage. Rimuovi il mouse con la pelle del colmo se necessario prima di riprovare.
- Iniettare lentamente l'inoculo batterico (0,2 mL) e ritirare l'ago, seguendo lo stesso angolo dell'inserimento.
- Riporta il topo nella gabbia e procedi con i topi rimasti.
NOTA: L'inoculo batterico deve essere somministrato il prima possibile dopo la preparazione. I topi di controllo dovrebbero ricevere 0,2 mL di soluzione salina sterile allo 0,9% (veicolo). La lunghezza appropriata, il calibro e il diametro della sfera dell'ago a gavage dovrebbero essere determinati in base al peso corporeo medio dei topi in ogni esperimento. Controlla il ritmo respiratorio e l'attività del topo dopo 5 minuti e prima di lasciare la struttura per animali. Se si osserva difficoltà respiratoria/difficoltà respiratorie, sopportare il topo seguendo un protocollo approvato. Il goffe orale dovrebbe essere eseguito solo da personale di ricerca formato. Un'esecuzione impropria della gavaga orale può portare a gravi complicazioni o alla morte dovuta a perforazione esofagea o iniezione del liquido della gavaga nei polmoni. Quando eseguita da personale di ricerca esperto, non si prevede alcuna mortalità con questa procedura. I topi utilizzati per questo esperimento dovrebbero essere ospitati in condizioni SPF. Per prevenire la contaminazione tra gabbie, dovrebbero essere utilizzate gabbie ventilate singolarmente e i topi devono essere manipolati in un armadietto di sicurezza biologica. Prima di aprire ogni gabbia, le mani e l'esterno del coperchio devono essere puliti con un disinfettante appropriato (ad esempio, perossido di idrogeno accelerato). I requisiti DPI per la manipolazione dei topi utilizzati in questo protocollo includono un camice (usa e getta o riutilizzabile) e guanti. La struttura per animali ospiti può richiedere ulteriori DPI. Tutte le manipolazioni che coinvolgono topi di controllo devono essere eseguite per prime.
4. Raccolta di campioni fecali
- Raccogli una pallina fecale da ogni topo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL facendo il colmo con la pelle del topo come descritto nel passo 3.3. Il topo dovrebbe defecare immediatamente. In alternativa, metti il topo in una gabbia pulita e vuota e attendi fino a 30 minuti prima che avvenga la defezione.
- Congelare il campione a colpi di scatto mettendo il tubo nell'azoto liquido. Conservare il campione a -80 °C fino a ulteriori analisi.
NOTA: La rilevazione di ClbA o la quantificazione di ClbP nelle feci tramite PCR in tempo reale dovrebbe essere effettuata prima dell'inizio dell'esperimento per verificare che i topi non siano stati colonizzati con pks+ E. coli. Per mantenere la colonizzazione oltre una settimana, può essere necessario il virus batterico ricorrente senza la presomministrazione di antibiotici (passaggi 2.1-3.6), a seconda delle condizioni sperimentali. La quantificazione di E. coli NC101 nelle feci tramite recupero della CFU o PCR in tempo reale dovrebbe essere eseguita almeno settimanalmente per tutta la durata dell'esperimento al momento dell'implementazione di questo protocollo per la prima volta, al fine di ottimizzare la frequenza del dosaggio.
5. Estrazione del DNA dei batteri fecali
- Estrarre il DNA batterico da campioni di feci raccolti utilizzando un kit di estrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore.
- Misura la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro e regola la concentrazione di DNA a 5 ng/μL.
6. Conferma della colonizzazione tramite la rilevazione dei geni clbA ed E. coli 16S
- Eseguire l'amplificazione simultanea dei geni dell'RNA ribosomale (rRNA) di ClbA ed E. coli 1S (Tabella Supplementare 1) tramite PCR utilizzando un master mix e uno strumento appropriati per la PCR seguendo le istruzioni del produttore.
- Visualizzare i geni clbA ed E. coli 16S nei topi colonizzati da E. coli NC101 tramite elettroforesi gel di agarosio comedescritto in precedenza 19. I topi non colonizzati dovrebbero non avere la banda clbA .
7. Quantificazione di E. coli NC101 tramite recupero della CFU
NOTA: Esegui i passaggi 7.1-7.7 utilizzando la tecnica asettica.
- Pesa un tubo vuoto da 1,5 mL per microcentrifuga.
- Aggiungi circa 20 mg di feci al tubo della microcentrifuga da 1,5 mL e registra il peso del tubo con il campione aggiunto.
- Aggiungi 200 μL di soluzione salina sterile allo 0,9% a ciascun tubo.
- Aspetta 10-15 minuti che le feci si ammorbidiscano a temperatura ambiente e fai un vortice in ogni tubo per 5 minuti alla massima velocità per ottenere una sospensione omogenea. Piccole particelle di cibo non digerito saranno visibili.
- Trasferire 100 μL di ciascuna sospensione in una piastra di agar MacConkey e distribuire uniformemente l'omogeneato usando uno spreader a forma di L.
- Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
- Contare il numero di colonie rosa e normalizzare in base al peso di ogni pellet fecale e al volume placcato.
NOTA: L'agar MacConkey seleziona i batteri gram-negativi. Inoltre, i batteri che possono fermentare il lattosio (come E. coli) formano colonie rosa, mentre quelli che non possono formare colonie incolore o gialle. Solo le colonie rosa dovrebbero essere conteggiate ai fini di questo protocollo. Se il numero della colonia è troppo elevato per essere contato, possono essere eseguite diluizioni seriali dell'omogeneato iniziale usando soluzione salina sterile allo 0,9%. Considera il fattore di diluizione quando calcoli il numero di colonie per campione.
Peso del pellet = peso del tubo della microcentrifuga con il campione di pellet - peso del tubo vuoto della microcentrifuga.
8. Quantificazione del gene clbP
- Eseguire l'amplificazione dei geni clbP e universali del rRNA 16S (Tabella Supplementare 1) tramite PCR quantitativa utilizzando un master mix appropriato e uno strumento per la PCR in tempo reale seguendo le istruzioni del produttore.
9. Quantificazione delle Enterobacteriaceae
- Eseguire l'amplificazione dei geni Enterobacteriaceae e dell'RNA universale 16S (supplementare) tramite PCR quantitativa utilizzando un master mix appropriato e uno strumento per la PCR in tempo reale.
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Risultati
L'amplificazione e la visualizzazione dei geni clbA ed E. coli 16S nelle feci all'estremità tramite PCR ed elettroforesi su gel hanno mostrato che, sebbene entrambi i geni fossero visibili nei topi colonizzati con E. coli NC101, solo il gene E. coli 16S era visibile nei topi di controllo, confermando che E. coli NC101 non era presente (Figura 2B).
Comeprevisto, 15
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Discussione
Gli effetti pro-cancerogeni della pks+ E. coli produttrice di colibactina sono stati recentemente associati sia all'aumento dellaCRC 9 precoce sia all'adozione di una dieta "in stile occidentale" 12, fattori che continueranno a influenzare le tendenze della CRC nei prossimi decenni. La maggior parte dei modelli di colonizzazione di pks+ E. coli è mostrata nel contesto del cancro associato alla colite, che non consente la c...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione dei Canadian Institutes of Health Research [CIHR, grant CSV-198232]. Ringraziamo la struttura per animali del CRCHUM. Le figure venivano create usando BioRender.com.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina sterile allo 0,9% | Baxter | JF7634 | |
| Dieta personalizzata al 10% di inulina | Teklad | TD.240286 | Risultati rappresentativi |
| 50 ppm FeS04 (Dieta senza fibre) personalizzata | Teklad | TD.120515 | Risultati rappresentativi |
| Femmina di topi B6 di 8-12 settimane | Laboratori Charles River | C57BL/6 | Risultati rappresentativi |
| Ampicillina sale sodico | Wisent Inc | 400-110 XG | |
| Centrifuga da banco | Fisher scientifico | 75004381 | |
| Misuratore di densità cellulare | Biochrom | 80-2116-30 | |
| Tubo di coltura, 13 mL | Sarstedt | 62.515.006 | |
| ECNC101 | N/A | N/A | Donato dal Dr. Christian Jobin, Università della Carolina del Nord a Chapel Hill & nbsp; |
| Ago Gavage, 38mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | Non più disponibile - Un'alternativa potenziale è disponibile presso Instech Labs (FTP-22-38) |
| Shaker orbitale incubante | VWR | 980153 | |
| Anello inoculante | Fisher scientifico | 22-363-595 | |
| Espanditore a forma di L | Fisher scientifico | 14-665-230 | |
| Brodo di lisogenesi | Wisent Inc | 800-060 LG | Aggiungi 35g di polvere e 1 litro d'acqua. Autoclave prima di usarlo. |
| Brodo di lisogenesi agar | Wisent Inc | 800-011 LG | Aggiungi 35g di polvere e 1 litro d'acqua. Autoclave prima di usarlo. |
| Agar MacConkey | Becton Dickinson | 211387 | Aggiungi 50g di polvere MacConkey a 1L d'acqua. Autoclave prima di usarlo. |
| Kit di estrazione del DNA microbico | Qiagen | 47016 | |
| Incubatore microbiologico | Fisher scientifico | 150152633 | |
| Tubo a microcentrifuga, 1,5 mL | UltiDent Scientific | 73-M150-C | |
| Rotore PCR - Tubi a striscia genetica | UltiDent Scientific | 73-V100-RG | |
| Piastra di Petri | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PCR in tempo reale SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| Ciclatore termico PCR in tempo reale | Ricerca Corbett | RG-3000A | |
| Tubo a vite, 15mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Colistimethate | Fresenius Kabi | C309306 | |
| Sale solfato di streptomicina | Millipore Sigma | S9137 | |
| Tubo scorrevole per tubercolina, 1 mL | Becton Dickinson | 309659 | |
| Vortice | Fisher scientifico | 12-812 |
Riferimenti
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