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Articolo di ricerca
Questo studio ha utilizzato il sequenziamento del rRNA 16S per confrontare il microbiota intestinale tra controlli sani, pazienti con disturbo di personalità non trattati e pazienti con DP trattati con piribedil, e ha identificato differenze nella composizione microbica associate al trattamento con piribedil.
Questo studio mirava a determinare se la terapia con piribedil alteri il microbiota intestinale dei pazienti con morbo di Parkinson (PD), fornendo un riferimento teorico per comprendere le alterazioni del microbiota intestinale indotte dal piribedil e le loro potenziali implicazioni cliniche. I campioni fecali sono stati analizzati utilizzando il sequenziamento genico del gene 16S ribosomale RNA (16S rRNA). Sono stati effettuati confronti tra pazienti con MP che hanno assunto piribedil (gruppo piribedil), pazienti con MP che non hanno assunto piribedil (gruppo PD) e controlli sani (gruppo blank). Rispetto al gruppo blank, l'abbondanza relativa di Staphylococcus, Rhodococcus e altri generi era più alta nel gruppo PD, mentre l'abbondanza relativa di Achromobacter e Delftia era inferiore. Inoltre, l'abbondanza relativa di Achromobacter, Delftia e Stenotrophomonas era maggiore nel gruppo piribedil rispetto al gruppo PD, mentre l'abbondanza relativa di Staphylococcus, Rhodococcus e altre specie era inferiore. Rispetto agli individui sani, il microbiota intestinale dei pazienti con DP ha mostrato cambiamenti significativi. Il microbiota intestinale dei pazienti che assumono piribedil differisce significativamente da quello dei pazienti non trattati. Questi risultati suggeriscono un'associazione tra piribedil e microbiota intestinale alterato nei pazienti con PD.
L'incidenza del morbo di Parkinson (PD) sta aumentando gradualmente; tuttavia, la sua eziologia e patogenesi non sono ancora state completamente chiarite. Ulteriori studi hanno indicato che il microbiota intestinale è strettamente correlato all'insorgenza e allo sviluppo della DP. He et al.1hanno documentato che la composizione del microbiota intestinale nei pazienti con Parkinson differisce da quella delle persone sane, e che un aumento dei patogeni intestinali può essere associato all'insorgenza della DP. Scheperans et al.2hanno confermato che l'abbondanza relativa di Prevotella e Bacteroides nell'intestino dei pazienti con PD è ridotta, e che questi generi batterici sono fortemente associati alla funzione della barriera intestinale.
Diversi studi hanno indagato la connessione tra il microbiota intestinale e la DP. Le ricerche suggeriscono che la disbiosi possa svolgere un ruolo cruciale nella fisiopatologia della DP, influenzando i sintomi motori e non motori attraverso molteplici meccanismi, tra cui infiammazione e disturbimetabolici 3. Inoltre, è stato dimostrato che i trattamenti farmacologici per la DP alterano la composizione del microbiomaintestinale 4,5, sottolineando la complessa interazione tra farmaci e microbioma intestinale.
In quanto agonista non selettivo dei recettori della dopamina, il piribedil è fondamentale nella gestione della DP; Può migliorare i sintomi motori nei pazienti stimolando i recettori della dopamina6. Tuttavia, il suo uso clinico è spesso limitato da reazioni avverse, principalmente sintomi gastrointestinali come nausea, vomito e disagioaddominale. Il meccanismo sottostante di questi effetti collaterali rimane incerto e se siano correlati a cambiamenti nel microbiota intestinale indotti dal piribedil è ancora sconosciuto.
Il legame tra il microbiota intestinale e le reazioni avverse ai farmaci ha suscitato un interesse crescente negli ultimi anni. Hill-Burns et al.8hanno analizzato il microbiota intestinale nei pazienti con DP e hanno scoperto che la diversità microbiota intestinale era associata alla risposta alla terapia farmacologica. Inoltre, gli agonisti della dopamina possono influenzare la motilità intestinale e la composizionemicrobica 9. Si ritiene che i meccanismi dietro questi cambiamenti riguardino alterazioni nel tempo di trasporto intestinale, che a loro volta influenzano la diversità e l'abbondanza microbica. Inoltre, il microbiota intestinale può influenzare l'assorbimento e il metabolismo dei farmaci, influenzando così l'efficacia e gli effetti collaterali di questi farmaci. Tuttavia, manca ancora una ricerca sistematica su se e come il piribedil, un agente comunemente usato per il morbo di Parkinson, moduli la struttura del microbiota intestinale, così come sull'associazione tra tali spostamenti microbici e le loro reazioni avverse gastrointestinali.
Nel presente studio, abbiamo confrontato la struttura del microbiota intestinale tra i controlli sani, i pazienti con disturbo di personalità non trattati e i pazienti con la disfunzione di Parkinson trattati con piribedil. Abbiamo ipotizzato che il trattamento con piribedil sia associato a differenze nella composizione del microbiota intestinale nei pazienti con PD e che questi cambiamenti microbici possano essere collegati ad effetti collaterali gastrointestinali associati al piribedil. Il nostro obiettivo era identificare specifiche alterazioni microbiche associate al piribedil ed esplorarne la possibile associazione con effetti collaterali gastrointestinali, fornendo così una base teorica per comprendere il meccanismo delle reazioni avverse correlate al piribedil.
Il microbiota intestinale è una direzione importante per la ricerca sulla patogenesi della PD11. Osservando gli effetti del piribedil sul microbiota intestinale nei pazienti con DP, questo studio aiuta a chiarire il significato clinico dei cambiamenti del microbiota intestinale correlati ai farmaci e fornisce un riferimento per ottimizzare l'uso clinico e la gestione della sicurezza del piribedil.
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Questo studio è stato esaminato dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese dell'Anhui (Numero di revisione etica: 2025AH-101, Data di approvazione etica: 2025-07-02).
Argomenti di ricerca
Sono stati iscritti pazienti con Parkinson e controlli sani presso il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese dell'Anhui. Sono stati raccolti campioni fecali freschi per l'analisi di follow-up. Venivano raccolti nuovi campioni fecali, allicitati in tubi EP sterili, immediatamente congelati in azoto liquido e poi conservati a −80 °C per una conservazione a lungo termine. I criteri di inclusione dei pazienti con MP erano i seguenti: (1) diagnosi clinicamente diagnosticata; (2) età >70 anni; (3) per il gruppo Piribedil: iniziava la monoterapia con piribedil dopo l'inserimento e non aveva mai avuto esposizione precedente a questo farmaco; per il gruppo con Parkinson: non seguire trattamenti con farmaci anti-Parkinson; (4) nessun'altra grave malattia sistemica, come gravi malattie cardiache, epatiche, renali o cancro. Prima dell'iscrizione, è stato ottenuto un consenso informato scritto da ciascun partecipante. I criteri di esclusione erano i seguenti: (1) gravi complicazioni della DP, come grave disfunzione motoria; (2) recentemente ricevuto un trattamento antibiotico; (3) la presenza di altre condizioni di salute che possono influenzare i risultati dello studio, come la malattia infiammatoria intestinale, la sindrome dell'intestino irritabile, ecc.; (4) allergico al piribedil. I soggetti sani di controllo (gruppo Blank) erano individui di età simile (età >70 anni) senza storia di malattie neurologiche o gastrointestinali maggiori.
Tutti i partecipanti erano tenuti a mantenere le proprie abitudini alimentari regolari prima dell'iscrizione. Nessuno aveva ricevuto probiotici, prebiotici, integratori di fibre alimentari o altri integratori nutrizionali. Inoltre, tutti i partecipanti non avevano ricevuto alcun trattamento antibiotico per almeno tre mesi prima della raccolta del campione. Durante lo studio non è stato effettuato alcun intervento dietetico standardizzato, ma a tutti i partecipanti è stato istruito a mantenere uno stile di vita e una dieta stabili per minimizzare i potenziali effetti di confusione sul microbiota intestinale.
Raggruppamento di ricerca
Questa coorte di studio è stata suddivisa in tre gruppi: gruppo Parkinson (n = 10): campioni fecali raccolti da pazienti affetti da morbo di Parkinson che non assumevano farmaci anti-Parkinson. Gruppo Piribedil (n=10): campioni fecali raccolti da pazienti affetti da morbo di Parkinson dopo 21 giorni consecutivi di trattamento con piribedil (50 mg, due volte al giorno). Gruppo di controllo vuoto (n=5): campioni fecali raccolti da individui sani.
Sequenziamento ribosomale dell'RNA 16S
Il sequenziamento è stato eseguito su una piattaforma di sequenziamento, come riportato in altri studi12,13. In breve, il DNA microbico totale è stato isolato da campioni fecali utilizzando il metodo del dodecile solfato di sodio (SDS) 14,15,16. L'integrità del DNA estratto è stata verificata tramite elettroforesi in gel di agarosio all'1%, e la concentrazione e la purezza del DNA sono state determinate con uno spettrofotometro. La regione ipervariabile V3-V4 del gene batterico 16S rRNA è stata amplificata dal DNA genomico utilizzando i primer degenerati 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') e 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') con termociclatore a catena della polimerasi (PCR). L'amplificazione del gene batterico 16S rRNA è stata effettuata nelle seguenti condizioni termiche: un primo passaggio di pre-denaturazione a 94 °C per 2 minuti, seguito da 28 cicli con denaturazione a 94 °C per 30 secondi, ricottura a 55 °C per 30 secondi e allungamento a 72 °C per 30 secondi. Un'estensione finale fu effettuata a 72 °C per 10 minuti, e la reazione fu poi mantenuta a 4 °C. Le miscele PCR contengono 2× miscela master PCR da 25 μL, primer diretto (10 μM) 2 μL, primer inverso (10 μM) 2 μL, DNA modello 10 ng e infineddH 2O fino a 50 μL. Le reazioni PCR sono state eseguite in triplice. Le miscele PCR contengono 2× master mix PCR da 25 μL, primer diretto (10 μM) 2 μL, primer inverso (10 μM) 2 μL, DNA modello di 10 ng e infineddH 2O fino a 50 μL. Le reazioni PCR sono state eseguite in triplice. Il prodotto PCR è stato estratto da gel di agarosio al 2% e purificato utilizzando un kit di estrazione gel. Il kit di preparazione della libreria Universal Plus DNA per MGI V2 è stato utilizzato per costruire la libreria: (1) collegamento splinter; (2) Utilizzare la schermatura magnetica a perle per rimuovere i segmenti auto-contigui delle giunzioni; (3) Arricchimento dei modelli di libreria tramite amplificazione PCR; (4) Sfere magnetiche per recuperare prodotti PCR; (5) Ciclizzazione dei prodotti PCR. Dopo la validazione della libreria, veniva eseguita la sequenziazione.
Punti di controllo qualità: Checkpoint 1 (Raccolta campioni): I campioni venivano congelati immediatamente dopo la raccolta e conservati a −80°C. Qualsiasi campione con segni visibili di scongelamento o contaminazione veniva scartato. Checkpoint 2 (estrazione del DNA): Purezza accettabile: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Integrità verificata da una singola banda ad alto peso molecolare su gel di agarosio all'1%. Checkpoint 3 (amplificazione PCR): Una singola banda a ~460bp su gel di agarosio al 2% indica un'amplificazione riuscita (primer 341F/806R, regione V3-V4); Se assenti o non specifiche, regolare la temperatura di ricottura o la concentrazione del modello. Per la preparazione della biblioteca era necessaria una concentrazione di recupero ≥0,5 ng/μl. Checkpoint 4 (Preparazione e sequenziamento della libreria): eseguito dalla struttura di sequenziamento seguendo i loro protocolli standard validati; non è stato applicato alcun checkpoint interno aggiuntivo (ad esempio, dimensionamento del bioanalizzatrice).
Sicurezza e smaltimento dei rifiuti: durante la gestione dei campioni venivano indossati guanti e camici da laboratorio. Le superfici di lavoro venivano pulite con il 70% di etanolo. Tutti i consumabili contaminati (punte, tubi, gel) sono stati autoclavati (121°C, 20 min) prima di essere smaltiti come rifiuti biopericolosi.
Bioinformatica
Le letture di sequenziamento grezzo del gene 16S rRNA sono state inizialmente demultiplexate, sottoposte a filtraggio di qualità tramite fastp (versione 0.20.0) e assemblate tramite FLASH (versione 1.2.11) secondo criteri di screening standardizzati. In breve: (i) Le sequenze grezze a 300 punti base sono state ridotte quando il punteggio medio di qualità è sceso sotto 20 entro una finestra scorrevole di 50 punti base. Le letture con lunghezze troncate inferiori a 50 bp o contenenti basi ambigue venivano rimosse; (ii) L'assemblaggio della sequenza veniva eseguito solo per sovrapposizioni superiori a 10 pb, con il rapporto massimo di disadattamento della regione sovrapposta fissato a 0,2. Le letture non spariate che non sono state assemblate sono state eliminate; (iii) I singoli campioni venivano suddivisi in base a sequenze di codici a barre e primer per la successiva regolazione dell'orientamento. L'abbinamento dei codici a barre veniva eseguito con un allineamento esatto, mentre l'abbinamento dei primer permetteva un massimo di 2 disallineamenti di nucleotidi. Le letture del rRNA 16S sono state analizzate utilizzando la pipeline Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (versione 1.8.0)17. Le sequenze di tag venivano aggiunte alle letture a fine accoppiata usando FLASH (versione 1.2.11)18. Il trimming è stato eseguito utilizzando UPARSE (versione 7.0.1090) con una lunghezza minima di 200 bp e una qualità media di 25, seguito da un clustering a un cutoff del 97% per generare unità tassonomiche operative (OTU)19. Le letture rappresentative OTU sono state classificate tassonomicamente tramite RDP Classifier 2.2, con un limite di confidenza ≥0,6. Le abbondanze di tag e letture sono state determinate tramite confronto utilizzando USEARCH global20. L'identificazione delle sequenze chimeriche si basava su confronti con il database Gold utilizzando UCHIME (v4.2.40)21. L'analisi delle coordinate principali (PCoA) è stata successivamente condotta sul dataset sparso basato sulla dissimilanza di Bray–Curtis, con la soglia di somiglianza delle sequenze fissata al 97% per il clustering. Le OTU rappresentative e i relativi profili tassonomici sono stati ulteriormente analizzati utilizzando il software R (versione 3.1.1). L'algoritmo di dimensione dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (LEfSe), basato sulla dimensione dell'effetto dell'analisi discriminante lineare (LDA), è stato applicato per selezionare biomarcatori con abbondanza differenziale significativa a livello OTU. Questo metodo enfatizza sia la significanza statistica sia la rilevanza biologica identificando prima le caratteristiche con differenze coerenti tra i gruppi (utilizzando il test di Kruskal-Wallis per il confronto multigruppo) e poi stima la dimensione dell'effetto di ciascuna caratteristica differenzialmente abbondante usando LDA. Un punteggio LDA >2,0 è definito come un'abbondanza significativamenteaumentata 22.
Metodi statistici
Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando SPSS. I dati normalmente distribuiti sono stati analizzati utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). I dati che non seguivano la distribuzione normale venivano analizzati utilizzando il test di somma dei ranghi di Wilcoxon. Tutti i dati quantitativi sono stati espressi come media ± errore standard (SE) per parametri conformi a una distribuzione normale, mentre i dati non normalmente distribuiti sono stati presentati come mediana con intervallo interquartile. Un p-valore < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Differenze nella diversità microbica associate al trattamento con piribedil
I risultati del controllo qualità dell'estrazione del DNA (intervallo di concentrazione, purezza) sono forniti nella Tabella Supplementare 1. Il controllo qualità dell'amplificazione PCR (dimensione della banda, concentrazioni di recupero) è mostrato nella Tabella Supplementare 2. Le metriche di controllo qualità del sequenziamento (conteggio di lettur...
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Il morbo di Parkinson è il secondo disturbo neurodegenerativo più comune a livello mondiale, preceduto solodall'Alzheimer 23. Dal 1970, il piribedil, come agonista dei recettori della dopamina, è stato ampiamente utilizzato nel trattamento della PD24. Tuttavia, nella pratica clinica, il piribedil può causare alcune reazioni avverse, come nausea, vomito e fastidio gastrointestinale. Ricerche in crescita dimostrano che lo sviluppo del morbo d...
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Gli autori affermano che non esistono interessi in conflitto.
Questa ricerca è stata supportata dal Progetto di Finanziamento per i Candidati di Riserva per i Leader Accademici della Provincia di Anhui (n. 2022H287), dal Progetto di Talenti Eccezionali per l'Igiene e la Salute della Provincia di Anhui (n. ahsjhmypygc20230074), dal Progetto di Ricerca Scientifica della Provincia di Anhui sull'Eredità e l'Innovazione della Medicina Tradizionale Cinese (2025CCCX017) e dal Progetto Speciale per l'Integrazione Base-Clinica dell'Università di Medicina Cinese dell'Anhui (JCLCA2025009).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (generale) | non applicabile | grado di biologia molecolare |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (non fornito) | |
| Centrifugatrice di congelamento ad alta velocità da banco | Hunan Kosei | GTR116C | |
| Reagenti per l'estrazione del DNA (SDS, fenolo, cloroformio, etanolo) | (generale) | non applicabile | |
| Piattaforma di sequenziamento DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Apparecchio per elettroforesi su gel | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Sistema di imaging per gel | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| Software LEfSe | (open source) | versione online | |
| Spettrofotometro NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| Macchina PCR | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F e 806R (sintetizzati) | (sintesi personalizzata) | non applicabile | |
| Software QIIME | (open source) | http://qiime.org | versione 1.8.0 |
| Fluorometro Quantus | Promega | E6150 | |
| Fluorometro Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (sodio dodecil solfato) | (generale) | non applicabile | |
| Software UPARSE | (open source) | http://drive5.com/uparse | versione 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit per MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |