Sviluppo di nanovescicole mesenchimali avvolte nella membrana delle cellule staminali per un migliorato apporto genico

Summary

Questo protocollo mira a introdurre un metodo per produrre e purificare biomimetici extracellulari derivati dalle vescicole staminali mesenchimali (MSC) per la terapia genica. La nanovescicola è confinata da bilayer lipidici derivati dalla MSC e racchiude gli AAV ricombinanti che portano il gene di interesse nel lume. Questa nanovescicola offre un vettore potenziato per la trasmissione in vivo dei geni.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) derivate dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) rappresentano grandi promesse per applicazioni terapeutiche e medicina rigenerativa. Gli EV sono vescicole su scala nanometrica secernite da tutti i tipi cellulari conosciuti, trasportando carichi diversi tra cui proteine ancorate alla membrana, fattori solubili, specie multiple di RNA e metaboliti che regolano la fisiologia e il comportamento delle cellule riceventi. Sebbene gli EV derivati o ingegnerizzati da MSC possano fornire proteine terapeutiche e RNA, la consegna del DNA mediata dagli EV rimane difficile a causa della mancanza di meccanismi efficienti per selezionare le sequenze di DNA nelle vescicole. Lavori precedenti del nostro gruppo e di altri hanno dimostrato che i VE contenenti virus adenoassociati (AAV) permettono una somministrazione nucleare mirata e un'espressione genica sostenuta in vitro e in vivo. Tuttavia, la loro produzione e isolamento sono stati limitati da procedure a basso rendimento e che richiedono molto tempo. Qui, riportiamo lo sviluppo di nanovescicole avvolte nella membrana della MSC generate da un metodo di estrusione definito per dimensioni per una ritrasmissione efficiente dei geni. Queste vescicole, di circa 200 nm di diametro, imitano le proprietà degli EV naturali mentre racchiudono vettori AAV ricombinanti che trasportano sequenze geniche terapeutiche. Rispetto agli AAV convenzionali, le vescicole MSC ingegnerizzate miglioravano l'efficienza della somministrazione genica e raggiungevano rese significativamente superiori con tempi e costi ridotti rispetto agli EV-AAV naturalmente secreti. In sintesi, presentiamo una nuova piattaforma di nanovescicole a membrana basata su MSC che combina i vantaggi delle strutture che imitano le EV con il trasferimento genico mediato dall'AAV. Questo approccio migliora l'efficienza della consegna e la scalabilità della produzione, offrendo una strategia promettente per promuovere la terapia genica verso la traduzione clinica.

Introduction

La terapia genica rappresenta un approccio trasformativo per il trattamento delle malattie genetiche e acquisite, introducendo, sostituendo o silenziando specifici geni per ripristinare la normale funzione cellulare. Negli ultimi due decenni, i progressi nell'ingegneria dei vettori e nelle strategie di somministrazione hanno ampliato significativamente il panorama terapeutico della terapia genica. Tra i vari sistemi vettoriali sviluppati, il virus adeno-associato (AAV) è emerso come una delle piattaforme più di successo e ampiamente adottate grazie al suo profilo di sicurezza favorevole, alla trasduzione efficiente e all'espressione genica a lungo termine sia nelle cellule in divisione che in quelle non^{divise 1,2}. Ad oggi, molteplici terapie basate sull'AAV hanno ricevuto l'approvazione regolatoria per l'uso clinico, inclusi trattamenti per atrofia muscolare spinale, distrofie retiniche ed emofilia, segnando importanti tappe nella medicina^{traslazionale 3}. Il tropismo ampio e la bassa immunogenicità dei vettori AAV hanno inoltre permesso la loro applicazione su una varietà di tessuti, tra cui fegato, muscolo, sistema nervoso centrale e^{occhio 4}. Di conseguenza, l'AAV è diventato una piattaforma leader per la somministrazione in vivo di geni, supportando studi preclinici e clinici in corso che mirano a disturbi metabolici, neurologici e cardiovascolari.

Nonostante il suo notevole successo clinico, la terapia genica basata su AAV affronta diverse sfide intrinseche che continuano a limitarne l'applicazione più ampia. Un vincolo importante risiede nella limitata capacità di confezionamento genomico del capsid AAV (~4,7 kb), che ne limita l'uso per la somministrazione di geni terapeutici grandi o^{multipli 5,6}. Inoltre, la biodistribuzione e il tropismo cellulare dei vettori AAV sono in gran parte determinati dai loro sierotipi, ciascuno dei quali mostra affinità distinte per tessuti specifici. Sebbene siano state impiegate estese strategie di ingegneria dei capsidi e di esposizione peptidica per migliorare il targeting tissutale e l'efficienza della trasduzione, ottenere tropismi precisi e prevedibili in contesti biologici diversi rimane un ostacolo^{significativo 7}. Un'altra limitazione critica è la prevalenza di anticorpi neutralizzanti (NAb) preesistenti contro i sierotipi naturali di AAV nella popolazione umana. Anche titoli bassi di NAb possono ridurre sostanzialmente l'efficienza della trasduzione vettoriale, limitando l'idoneità del paziente e complicando la dosaggio^{ripetuto 8,9}. Sono state esplorate varie strategie, come la riprogettazione razionale della capside, i regimi immunosoppressivi e lo scambio plasmatico transitorio, per mitigare la neutralizzazione mediata dagli^{anticorpi 10,11}, ma questi approcci offrono solo sollievo parziale o transitorio. Collettivamente, queste limitazioni riducono l'efficacia terapeutica complessiva e la riproducibilità della somministrazione genica mediata da AAV in contesti clinici.

Negli ultimi anni, l'AAV avvolto da vescicola extracellulare (EV-AAV) è stato esplorato come vettore alternativo con il potenziale di superare diversi limiti chiave degli AAV^{convenzionali} 12,13,14,15. Durante il confezionamento vettoriale, una porzione delle particelle di AAV può essere secreta attraverso vie di traffico vescicolare e rimanere racchiusa in vescicole extracellulari. Si ritiene che questo processo coinvolga la proteina accessoria associata alla membrana (MAAP) codificata in AAV, che facilita l'uscita virale e promuove l'associazione alla^{membrana 16,17}. Le particelle EV-AAV risultanti mostrano una migliore efficienza di trasduzione e una maggiore resistenza agli anticorpi neutralizzanti rispetto all'AAV convenzionale, principalmente grazie alla membrana vescicolare che favorisce l'assorbimento cellulare e fornisce una parziale schermatura contro il riconoscimento degli^{anticorpi 18}. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, la produzione di EV-AAV rimane inefficiente. Tipicamente, solo una piccola frazione dei genomi vettoriali (circa 0,5%-12%) viene secreta nel mezzo di coltura come AAVs associati a EV, mentre la maggior parte rimane intracellulare o esiste come AAVs^{liberi 12,13}. Di conseguenza, è necessaria una produzione su larga scala per ottenere una resa vettoriale sufficiente. Inoltre, la generazione di EV-AAV è stata dimostrata principalmente utilizzando cellule produttrici HEK293T, i cui EV possono presentare una rapida clearance epatica, una breve dimezzavita circolare e potenziali problemi di biosicurezza. Queste limitazioni evidenziano la necessità di una strategia di avvolgimento della membrana più efficiente e personalizzabile, motivando lo sviluppo della piattaforma AAV avvolta dalla membrana cellulare (CME-AAV) presentata in questo studio.

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) e i loro veicoli elettrici sono stati ampiamente studiati per il loro potenziale rigenerativo e le proprietà immunitarie evasive dal sistema immune. Oltre alle terapie basate su cellule o EV secernuti naturalmente, studi recenti hanno dimostrato un approccio alternativo per una migliore somministrazione di farmaci utilizzando nanoparticelle avvolte da membrane^MSC 19,20,21. Il rivestimento a membrana MSC conferisce la capacità di targeting attivo, riduce la clearance immunitaria e prolunga il tempo di circolazione, i cui effetti sono probabilmente attribuiti alla composizione molecolare intrinseca delle membrane derivate dalla^{MSC 22,23}. Partendo da questo concetto, abbiamo utilizzato materiale a membrana derivato dalla MSC per costruire una nanovescicola AAV avvolta nella membrana cellulare (CME-AAV) per la somministrazione genica. Per ottenere questo obiettivo, frammenti purificati di membrana MSC sono stati miscelati con particelle ricombinanti di AAV e sottoposti a un processo di estrusione controllato, una tecnica originariamente sviluppata per la fabbricazione di^{liposomi 24,25}. Attraverso l'estrusione definita per dimensioni, i componenti della membrana si assemblano spontaneamente in vescicole su scala nanometrica che incapsulano particelle AAV. I CME-AAV risultanti sono stati ulteriormente purificati da AAV liberi e non incapsulati utilizzando centrifugazione basata su gradiente di densità. Questa strategia consente una preparazione efficiente e riproducibile di vettori AAV avvolti in membrana, che mostrano un'efficienza di trasduzione notevolmente migliorata rispetto agli AAV convenzionali e mantengono una resistenza comparabile agli anticorpi neutralizzanti degli EV-AAV. Sostituendo diversi transgeni, la piattaforma CME-AAV offre un ampio potenziale per il trattamento di varie malattie genetiche e acquisite.

Protocol

Tutte le procedure animali sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università Normale di Pechino a Zhuhai, Cina. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione e formazione di CME-AAV tramite estrusione definita in dimensione dei pori

1. Produzione di vettori AAV ricombinanti
   NOTA: Il protocollo di produzione AAV segue procedure precedentemente pubblicate e ampiamente utilizzate. Passaggi dettagliati di ottimizzazione e variazioni sono stati descritti in studi^{precedenti 12,26}.
   1. Coltivare HEK293T cellule in mezzo di crescita completo e mantenerle a una confluenza del 70%-80% il giorno della trasfezione.
   2. Preparare tre plasmidi che codificano (i) il vettore di trasferimento AAV che trasporta il transgene di interesse, (ii) i geni rep/cap AAV corrispondenti al sierotipo desiderato, e (iii) le funzioni auxiliari adenovirali.
   3. Co-trasfettare le cellule HEK293T con i tre plasmidi utilizzando un metodo di trasfezione consolidato (ad esempio, trasfezione a base di fosfato di calcio o polimero), seguendo la pratica standard di laboratorio.
   4. Incubare le cellule trasfectate per 48-72 ore per consentire l'assemblaggio e l'accumulo dell'AAV.
   5. Raccogliere cellule e coltivare il mezzo, e liberare particelle di AAV tramite ripetuti cicli di congelamento-disgelo o un metodo equivalente di lisi cellulare.
   6. Centrifugare il lisato a bassa velocità per rimuovere i detriti cellulari e raccogliere il soprandanante contenente particelle AAV.
   7. Purificare le particelle AAV utilizzando l'ultracentrifugazione a gradiente di densità o un altro approccio di purificazione consolidato.
   8. Sostituire vettori AAV purificati con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e conservare aliquote a −80 °C fino all'utilizzo.
2. Preparazione della frazione di membrana MSC
   NOTA: Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) sono state isolate in conformità con le linee guida istituzionali. Le cellule sono state coltivate ed espanse in condizioni consolidate o protocolli modificati in laboratorio. L'identità della MSC può essere confermata valutando l'espressione di marcatori fenotipici come CD73, CD90 e CD105 utilizzando la citometria a flusso. La multipotenza delle MSC è verificata dalla loro capacità di differenziarsi in osteoblasti, condrociti e adipociti in vitro. Le celle sono pronte per la raccolta quando raggiungono una confluenza del 70%-90%. Le seguenti procedure non sono necessariamente obbligate a essere eseguite in condizioni sterili.
   1. Rimuovere il mezzo di coltura e staccare le MSC dal piatto di coltura usando un raschietto a celle.
   2. Raccogliere le cellule staccate in un tubo conico contenente PBS e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C per pelletare le celle.
   3. Lava le cellule due volte con PBS, centrifugando ogni volta a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   4. Risospendere la pellet cellulare finale in PBS integrata con un cocktail di inibitori della proteasi.
   5. Sottoporre la sospensione cellulare a tre cicli di congelamento-disgelo per disturbare la membrana plasmatica e generare un lisato cellulare grezzo.
   6. Pipetta accuratamente il lisato per omogeneizzarlo, poi centrifuga a 1.000 × g per 20 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
   7. Trasferire il soprantantante in un nuovo tubo e centrifugare a 18.000 × g per 1 ora a 4 °C per pelletare la frazione di membrana.
   8. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet a membrana risultante nel PBS. Questa sospensione rappresenta la frazione di membrana grezza MSC e sarà utilizzata per l'incapsulamento AAV.
   9. Omogeneizzare la sospensione a membrana passandola sequenzialmente attraverso siringhe dotate di aghi da 20 G a 27 G.
   10. Determinare la concentrazione proteica della sospensione omogenea a membrana utilizzando un saggio BCA. Aliquota e conserva la sospensione a −80 °C, oppure procedi direttamente ai passaggi seguenti. Riomogeneizzare la sospensione a membrana usando una siringa da 27 G dopo ogni ciclo di scongelamento.
3. Formazione della CME-AAV tramite estrusione
   1. Mescolare la sospensione di membrana preparata con gli AAV a un rapporto definito di 150 μg di proteina di membrana per 1 × 10^{copie genomiche} (g.c.) di AAV. Incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti con una lieve agitazione.
   2. Carica la miscela membrana-AAV su un mini-estrusore dotato di una membrana in policarbonato (PC) da 400 nm. Fai passare il campione attraverso l'estrusore 20 volte per favorire l'incapsulamento membrana-AAV.
   3. Sostituire la membrana PC da 400 nm con una da 200 nm e ripetere il processo di estrusione 20 volte per ridurre ulteriormente l'eterogeneità della dimensione della vescicola.
   4. Raccogli la miscela lavorata. Se è richiesta una quantità maggiore, accumula più lotti di estrusione. La sospensione risultante contiene CME-AAV, insieme a AAV non incapsulati e vescicole a membrana vuote. Procedere immediatamente alla purificazione CME-AAV.

2. Purificazione del CME-AAV tramite centrifugazione a gradiente di densità

NOTA: Questo passaggio descrive la separazione del CME-AAV puro da AAV non incapsulati, aggregati proteici e acidi nucleici residui tramite ultracentrifugazione a gradiente di densità basata sullo iodixanolo. Il CME-AAV purificato ottenuto da questa fase è adatto sia per studi in vitro che in vivo . Tutte le procedure sono raccomandate di essere eseguite sotto un cappuccio sterile in coltura tessutale.

1. Preparazione del gradiente di iodixanolo
   1. Preparare soluzioni al 40% e al 25% di iodixanolo diluendo la soluzione di base con 10× PBS e acqua deionizzata sterile per ottenere una concentrazione finale in 1× PBS.
   2. In un tubo ultra-trasparente sottile a parete sottile aperto da 13,2 mL, stabilire con attenzione un gradiente di densità discontinua sottoponendo 1 mL di iodixanolo al 40% e 3 mL di iodixanolo al 25% dal fondo.
   3. Sovrapporre delicatamente 7 mL della sospensione contenente CME-AAV ottenuta dallo step 1.14 sulla sommità della pendenza. Bilancia i tubi e caricali in un rotore oscillante di un'ultracentrifuga a secchio.
2. Ultracentrifugazione e raccolta delle frazioni CME-AAV
   1. Centrifugare la pendenza a 150.000 × g per 3 ore a 4 °C usando accelerazione rapida e decelerazione lenta (livello 9 e livello 1, rispettivamente).
   2. Rimuovi con attenzione i tubi dal rotore senza disturbare la pendenza. Raccogli frazioni di 1 mL dalla parte superiore a quella inferiore del tubo in tubi microcentrifuga etichettati da 1,5 mL (F1-F11). Tieni tutte le frazioni sul ghiaccio.
   3. Identificare e concentrare le frazioni F7 e F8, che contengono i CME-AAV purificati, in un nuovo tubo ultracentrifuga aperto. Aggiungi PBS a un volume totale di 11 mL e mescola delicatamente con una pipetta da 1 mL.
3. Lavaggio e recupero della CME-AAV
   1. Centrifuga nuovamente le frazioni accumulate a 150.000 × g per 3 ore a 4 °C usando accelerazione e decelerazione rapide (livello 9 per entrambe le impostazioni).
   2. Scartare con cura il sovrantantante e risospendere il pellet CME-AAV in 50-200 μL di PBS sterile, a seconda della concentrazione desiderata.
   3. Uso aliquota quando necessario e conserva a −80 °C fino a un ulteriore utilizzo.

3. Caratterizzazione della CME-AAV tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) viene utilizzata per visualizzare la morfologia, la dimensione e la struttura della membrana delle particelle CME-AAV. La procedura segue un protocollo standard di colorazione negativa simile a quello utilizzato per le vescicole extracellulari. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.

1. Preparazione e fissazione del campione
   1. Diluire la sospensione purificata di CME-AAV ottenuta dalla fase 2 a una concentrazione di circa 1 × 10^9-1 × 10 particelle^{da 10} mL/mL in PBS.
   2. Fissare il campione aggiungendo un volume uguale di paraformaldeide appena preparato al 4% (concentrazione finale 2%) e incubando per 30 minuti a temperatura ambiente.
   3. Posizionare una griglia di rame rivestita di Formvar/carbonio (200-mesh) su un foglio di film di paraffina, lato carbonio rivolto.
   4. Pipetta 10 μL della sospensione CME-AAV fissa sulla griglia e lascia adsorbirsi per 30 minuti a temperatura ambiente. Evita di asciugare durante l'adsorbito.
   5. Rimuovi delicatamente il liquido in eccesso dal bordo della griglia usando carta filtro senza toccare il centro.
2. Lavaggio e post-fissazione
   1. Fai galleggiare la griglia, lato campione verso il basso, su una goccia di 50 μL di PBS per 2 minuti per lavarla. Ripeti due volte.
   2. Trasferire la griglia su una goccia di 50 μL di glutaraldeide all'1% per 5 minuti per stabilizzare la struttura della membrana.
   3. Lavare la griglia in sequenza 5 volte con gocce di acqua deionizzata (30 secondi ciascuna) per rimuovere i sali tamponi. Tampona delicatamente dopo l'ultimo lavaggio.
3. Colorazione negativa
   1. Posizionare la griglia su una goccia di 50 μL di acetato di uranile acquoso al 2% per 1 minuto per ottenere una colorazione negativa.
   2. Rimuovere la macchia in eccesso toccando delicatamente il bordo della griglia con carta da filtro e lascia asciugare completamente all'aria a temperatura ambiente.
4. Imaging
   1. Esaminare le griglie colorate utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione azionato a 200 kV.
   2. Cattura immagini rappresentative con ingrandimenti tra 30.000× e 120.000× per valutare la morfologia CME-AAV e l'integrità della membrana.
   3. Opzionalmente, misurare i diametri delle particelle utilizzando software di analisi delle immagini TEM per confermare la coerenza della dimensione della vescicola con i risultati NTA.
      NOTA: Concentrazione del campione - Regolare la concentrazione di CME-AAV per ottenere una densità di particelle moderata; Campioni troppo concentrati portano a sovrapposizioni di particelle, mentre campioni troppo diluiti producono poche vescicole rilevabili. Evitare artefatti - Un lavaggio incompleto può lasciare cristalli di sale che oscurano la visualizzazione delle particelle. Assicurati che le griglie rimangano idratate durante la macchia per evitare il collasso della membrana. Coloranti alternative - L'acido fosfotongstico (PTA, 1%-2%, pH 7,0) può essere utilizzato come alternativa all'acetato di uranile se si applicano restrizioni sulla manipolazione radioattiva. Conservazione - Le griglie preparate possono essere conservate in un contenitore senza polvere a temperatura ambiente per diversi giorni prima dell'immagini, anche se si raccomanda un'osservazione immediata per il miglior contrasto.

4. Quantificazione della CME-AAV tramite qPCR

NOTA: Questo passaggio descrive un metodo basato su qPCR per quantificare le copie genomiche CME-AAV (g.c./μL). Il protocollo pone l'accento sulla preparazione dei campioni specifici per CME-AAV e la segnalazione dei dati. Tutti gli altri aspetti della configurazione e del ciclo della qPCR devono seguire la pratica standard di laboratorio e le istruzioni del produttore per il kit qPCR selezionato.

1. Preparazione campione e standard
   1. Scongelare aliquote di CME-AAV purificato su ghiaccio e mescolare delicatamente tramite pipetta. Evita il vortice.
   2. Preparare le diluizioni standard AAV da 1 × 10⁶ a 1 × 10³ g.c./μL tramite diluizioni sequenziali di 10 volte utilizzando acqua deionizzata priva di nucleasi o tampone TE. Preparare standard fresco o aliquota e conservare a −20 °C per un uso a breve termine.
   3. Preparare i seguenti controlli: un controllo senza modello (NTC; acqua), un controllo negativo (PBS o matrice blank) e un controllo positivo (campione AAV con concentrazione nota), se disponibili.
   4. Prepara il master mix qPCR su ghiaccio secondo le istruzioni del produttore per la chimica scelta (a base di colorante o sonda).
2. Cicli qPCR e analisi dei dati
   1. Esegui la qPCR utilizzando i parametri di ciclo raccomandati dal produttore del master mix qPCR.
   2. Genera una curva standard tracciando C_t (asse y) contro_{log 10} (concentrazione standard in g.c./μL) (asse x). Adattare una regressione lineare per ottenere la pendenza (m) e l'intercetta y (b).
   3. Calcola la concentrazione genomica CME-AAV per ogni replicazione campionaria usando l'equazione di regressione:
      oppure
      
      dove C sono copie genomiche per μL.
   4. La media delle repliche tecniche riportano la concentrazione finale di CME-AAV come g.c./μL.
      NOTA: Poiché la denaturazione termica durante la preparazione della qPCR disturba sia la membrana avvolgente che i capsidi AAV, non è necessaria un'estrazione separata del DNA. Non eseguire il trattamento con DNasi su campioni prima della lisi termica; La DNasi può accedere e degradare i genomi AAV una volta che le capsidi/membrane sono interrotte, ma prima che il campione raggiunga temperature che inattivano la DNasi. Gli standard devono essere abbinati dove possibile: preparare una curva standard a partire da uno standard AAV ben caratterizzato. Se i tuoi campioni o standard differiscono nella configurazione del genoma (AAV monofilante vs AAV auto-complementare/doppio filamento), aggiusta di conseguenza i valori riportati. Progettazione innesco/sonda: gli innesco possono colpire qualsiasi sequenza AAV conservata; ad esempio, sono comunemente utilizzati primer che mirano al promotore CMV (a monte del transgene).

5. Quantificazione dei profili di particelle CME-AAV

1. Utilizzare l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), il rilevamento resistivo a impulsi sintonizzabili (TRPS) o tecniche comparabili di analisi delle particelle per determinare la distribuzione delle dimensioni e la concentrazione delle particelle delle preparazioni CME-AAV.
2. Lo scongelamento purifica i campioni di CME-AAV su ghiaccio e lo omogeneizza delicatamente tramite pipettura prima dell'analisi. Eseguire misurazioni seguendo la prassi standard di laboratorio e le istruzioni del produttore per lo strumento selezionato, come descritto nei protocolli^{precedentemente pubblicati 12, 27, 28 e 29}.

6. Analisi in vitro del trasferimento genico mediato da CME-AAV

NOTA: Questo passaggio descrive la procedura per valutare la somministrazione genica mediata da CME-AAV e l'espressione dei transgeni nelle cellule coltivate. Il test viene dimostrato utilizzando cellule HEK293T e CME-AAV9. EGFP, ma può essere adattato ad altri tipi cellulari o costrutti reporter. AAV9 convenzionale (non avvolto da membrana). L'EGFP funge da controllo positivo, mentre i PBS o particelle AAV vuote sono usati come controlli negativi.

1. Preparazione cellulare
   1. Coltivare HEK293T cellule in condizioni standard (DMEM con FBS al 10%, 1% di penicillina-streptomicina) a 37 °C con CO₂ al 5%.
   2. Sposta le cellule di seme in piastre a 48 o 96 pozzi per raggiungere circa il 70% di confluenza al momento della trasduzione (tipicamente 24 ore dopo la semina). Regolare la densità di semina in base alla dimensione del pozzo (ad esempio, ~5 × celle 10⁴/pozzo per una piastra da 48 pozzi o ~1 × celle da 10⁴ per una piastra da 96 pozzi).
   3. Permettere alle cellule di attaccarsi ed equilibrarsi per 24 ore prima di aggiungere vettori.
2. Applicazione vettoriale
   1. Prepara il CME-AAV9. EGFP e AAV9. Soluzioni funzionanti EGFP in PBS sterile. Dose virale tipica: 5 × 10⁸ g.c. per 48 pozzi (adeguare in base alla forza del promotore, al gene bersaglio e agli obiettivi sperimentali).
   2. Per ogni pozzo, si aggiungono copie genomiche uguali (g.c.) di CME-AAV9. EGFP o AAV9. EGFP direttamente al mezzo di coltura.
   3. Includere pozzi di controllo negativi con un volume equivalente di PBS o particelle AAV vuote.
   4. Fai ruotare delicatamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme e riportarla nell'incubatrice.
   5. Continuare l'incubazione per 24-72 ore, a seconda dell'attività del promotore e della cinetica dell'espressione del transgene. Per l'EGFP guidato dal CMV nelle cellule HEK293T, si osserva tipicamente una forte fluorescenza entro 48 ore.
3. Imaging e analisi di cellule vive
   1. Quando sei pronto per l'immagini, aspira delicatamente il mezzo di coltura e lava le cellule due volte con PBS per rimuovere le particelle non legate. Evita di spostare le cellule.
   2. Colora i nuclei delle cellule con Hoechst 33342 (compatibili con celle vive) seguendo le istruzioni del produttore. Non usare DAPI per le cellule vive.
   3. Eseguire immagini di fluorescenza a cellule vive utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di filtri appropriati (ad esempio, eccitazione 488 nm/emissione 513 nm per EGFP; eccitazione 350 nm/emissione 460 nm per Hoechst).
   4. Utilizzare obiettivi del 10× o 20× per la quantificazione dell'efficienza della trasduzione e il 63× per la localizzazione subcellulare ad alta risoluzione se necessario.
   5. Acquisire almeno cinque campi visivi per pozzo (ad esempio, quattro angoli e un centro) utilizzando parametri di imaging identici (tempo di esposizione, guadagno, diaframma, ecc.).
   6. Salva tutte le immagini in formato raw e in scala di grigi per l'analisi quantitativa.
4. Analisi quantitativa delle immagini
   1. Immagini aperte in ImageJ (FIJI) o software equivalente.
   2. Misurare l'intensità media di fluorescenza sia per i canali EGFP che per quelli di Hoechst per ciascun campo.
   3. Determina l'intensità di fondo selezionando una regione senza segnale fluorescente e facendo la media dei valori dei pixel.
   4. Calcola l'intensità corretta per ogni canale:
      _{Ho corretto} =_cioè -_{I contesto}
   5. Calcolare l'intensità normalizzata per ciascun campo come:
      
   6. Intensità normalizzate medie da almeno cinque campi per pozzo e riportano la media ± SD in tre repliche biologiche indipendenti.
      NOTA: CME-AAV tipicamente mostra un'intensità di fluorescenza aumentata rispetto all'AAV convenzionale quando vengono applicate copie genomiche uguali, riflettendo una migliore assorbimento cellulare e/o protezione dagli anticorpi neutralizzanti. L'efficienza ottimale della trasduzione dipende dalla qualità della preparazione CME-AAV, dal tipo cellulare, dalla forza del promotore e dal titolo virale. Se vengono osservati segnali deboli, aumentare l'input delle copie genomiche, confermare l'integrità del vettore tramite qPCR e verificare la calibrazione al microscopio. Altri reporter fluorescenti (ad esempio, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) o costrutti luciferasi possono essere utilizzati a seconda delle esigenze sperimentali. Quando si lavora con cellule primarie o non aderenti, si aggiusta di conseguenza le condizioni di semina e imaging (ad esempio, rivestire le lastre con poli-L-lisina o utilizzare vetrine a camera).

7. Valutazione della CME-AAV - emissione genetica mediata in un modello murino

NOTA: Questo passaggio descrive la valutazione della consegna genica in vivo mediata da CME-AAV utilizzando un modello murino.

1. Preparazione degli animali
   1. Usa topi di tipo selvatico come il C57BL/6. Assicurarsi che tutte le procedure animali siano approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e svolte in conformità con le normative pertinenti.
   2. Seleziona topi di età 4-6 settimane per una coerenza ottimale tra gli esperimenti.
   3. Mantenere gli animali in condizioni abitative standard con accesso ad libitum a cibo e acqua prima dell'iniezione.
2. Preparazione e amministrazione dei vettori
   1. Selezionare un sierotipo AAV in base allo scopo dello studio e al tessuto bersaglio. In questo studio vengono utilizzati AAV9 e CME-AAV9.
   2. Preparare vettori virali che codificano un gene segnalatore luciferasi (ad esempio, CME-AAV9.luciferasi) per immagini non invasive.
   3. Diluire i vettori virali in soluzione salina sterile a una concentrazione finale di 1 × 10¹° copie genomiche (g.c.) per 50 μL per ciascun topo.
   4. Riscalda delicatamente la coda usando una borsa riscaldante o acqua tiepida per dilatare la vena prima dell'iniezione.
   5. Carica 50 μL di sospensione virale in una siringa di insulina da 31 g e inietta lentamente nella vena laterale per minimizzare perdite e rotture della vena.
   6. Dopo l'iniezione, riporta i topi nelle gabbie e monitorali finché non si sono completamente ripresi.
3. Imaging bioluminescenza in vivo
   1. Due settimane dopo l'somministrazione, anestetizzare i topi con isoflurano (secondo i protocolli istituzionalmente approvati) e iniettare D-luciferina (150 μg/g di peso corporeo; Sigma) intraperitonealmente in PBS.
   2. Inserire i topi anestetizzati in un sistema di imaging a bioluminescenza.
   3. Acquisire immagini di luminescenza ogni 2 minuti dopo l'iniezione finché il segnale non raggiunge un plateau.
   4. Quantificare la bioluminescenza usando un software adeguato. Definisci le regioni di interesse (ROI) attorno alle aree luminescenti e calcola il flusso totale di fotoni (fotoni/s) per ogni animale.
   5. Includere i gruppi trattati con AAV9.luc e quelli iniettati con PBS come controlli positivi e negativi, rispettivamente, per il confronto.
4. Imaging ex vivo
   NOTA: Questo passaggio è opzionale.
   1. Immediatamente dopo l'imaging in vivo , sopportare i topi e raccogliere gli organi principali (fegato, cuore, milza, rene e cervello).
   2. Immagini degli organi isolati sotto parametri di imaging identici utilizzando lo stesso sistema IVIS per determinare l'espressione della luciferasi specifica per tessuto.
      NOTA: Possono essere adottate vie di somministrazione alternative (ad esempio, iniezione intramuscolare, intracerebrale o intraperitoneale) a seconda degli obiettivi sperimentali. L'intensità della bioluminescenza riflette sia l'efficienza della trasmissione genica sia la biodistribuzione tissutale. L'espressione della luciferasi mediata da CME-AAV presenta tipicamente un esordio precoce e un picco aumentato rispetto all'AAV libero a causa dell'endocitosi mediata dalla membrana da parte delle cellule che assorbono verso l'alto. Assicurati di mantenere una dose, un tempismo e impostazioni di imaging costanti tra i campioni per un confronto accurato. La dose virale descritta (1 × 10¹° g.c. per topo) fornisce tipicamente un segnale rilevabile 2-4 settimane dopo l'iniezione, ma può essere necessaria un'ottimizzazione per vettori o modelli animali diversi.

Results

Le MSC utilizzate in questo studio sono state isolate dal tessuto del cordone ombelicale umano secondo protocolli in conformità con le linee guida etiche pertinenti. Le frazioni di membrana MSC sono state preparate secondo il protocollo descritto. AAV9. L'EGFP è stato prodotto internamente utilizzando un sistema di trasfezione transitoria a doppio plasmide in HEK293T celle, come precedentemente^{riportato 12,26}. Per la fabbricazion...

Discussion

Fasi critiche del protocollo CME-AAV

Questo protocollo descrive un metodo per generare gli AAVs avvolti nella membrana MSC, e diversi passaggi sono fondamentali per la formazione efficace di CME-AAV. Innanzitutto, è essenziale un attento pre-processamento della membrana cellulare. L'obiettivo di questo passaggio è ottenere frammenti di membrana adatti all'estrusione minimizzando la contaminazione da DNA nucleare, proteine citosoliche e organel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di imaging bioluminescenza	PerkinElmer	IVIS Spectrum optical imaging system (Lumina III)
Sale di potassio di D-Luciferina	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Siero fetale bovino	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	Axio Observer 7
Griglia di rame rivestita di Formvar/carbonio 200 mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldeide	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
Medium di Eagle modificato di Dulbecco ad alta concentrazione di glucosio	Hyclone	SH30243
Centrifugatrice ad alta velocità	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
Strumento NTA	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Tubo ultrachiaro a parete sottile con apertura superiore per ultracentrifuga	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldeide 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicillina-streptomicina	Millipore-Sigma	V900929
Strumento qPCR	Applied Biosystems	QS6 real-time PCR system
Rotore per centrifuga ad alta velocità	Beckman Coulter	JA-25.50
Rotore SW 41 Ti Swing-bucket per ultracentrifuga	Beckman Coulter	331362
Microscopio elettronico a trasmissione	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XE-100
Acetato uranile	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Filtri di membrane in policarbonato Whatman Nuclepore (200 nm)	Cytiva	10417004
Filtri di membrane in policarbonato Whatman Nuclepore (400 nm)	Cytiva	10417104