Relazione causale tra ictus ischemico e demenza vascolare: uno studio di randomizzazione mendeliana

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile di randomizzazione mendeliana a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra ictus ischemico e demenza vascolare, utilizzando dati riassuntivi di studi di associazione sull'intero genoma disponibili pubblicamente.

Abstract

L'ictus ischemico (IS) è una delle principali cause di disabilità e mortalità a livello mondiale, e la demenza vascolare (VaD) è un sottotipo comune di demenza associato a lesioni cerebrovascolari. Studi osservazionali hanno suggerito un rapporto tra IS e VaD, ma tali studi sono suscettibili di confondimento e causalità inversa. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile di randomizzazione mendeliana (MR) a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD, utilizzando dati riassuntivi pubblicamente disponibili di studi d'associazione su tutto il genoma (GWAS). Gli strumenti genetici associati all'IS sono stati estratti da un dataset GWAS pubblico, mentre le associazioni con l'esito per VaD sono state ottenute da un dataset GWAS pubblico su VaD. Gli ID dei dataset corrispondenti sono indicati nella sezione Protocollo. Dopo l'abbinamento degli esiti e l'armonizzazione degli alleli, sono stati mantenuti 51 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) per l'analisi MR finale. Il flusso di lavoro comprende la selezione delle variabili strumentali, il raggruppamento per disequilibrio di associazione (linkage disequilibrium clumping), l'armonizzazione degli alleli, la valutazione della forza degli strumenti, l'analisi pesata per la varianza inversa (IVW), l'analisi della mediana pesata, l'analisi MR-Egger, il test di eterogeneità, la valutazione della pleiotropia orizzontale e l'analisi di sensibilità leave-one-out. Nell'analisi rappresentativa, il metodo IVW ha mostrato un'associazione positiva tra IS predetto geneticamente e rischio di VaD, e il metodo della mediana pesata ha prodotto un risultato concorde nella direzione. La stima MR-Egger era coerente nella direzione, ma non ha raggiunto la significatività statistica. Pertanto, questi risultati dovrebbero essere interpretati come evidenza indicativa di un possibile effetto causale, piuttosto che come prova definitiva di causalità. Questo protocollo potrebbe aiutare i ricercatori ad applicare un flusso di lavoro MR trasparente e riproducibile per indagare esiti legati alle malattie cerebrovascolari utilizzando dati GWAS pubblici.

Introduzione

L'ictus ischemico (IS) è una delle principali cause di disabilità grave e morte in tutto il mondo¹. Secondo gli ultimi dati dello studio Global Burden of Disease, l'incidenza globale dell'IS è diminuita, ma rimane un peso significativo, in particolare nell'Europa orientale, nell'Asia orientale, nell'Asia centrale e nell'Africa subsahariana^2,3. Inoltre, l'incidenza dell'IS è in aumento nei paesi con un basso indice socio-demografico (SDI) e si prevede che continuerà ad aumentare dal 2020 al 2030.

Numerosi studi epidemiologici hanno suggerito un possibile legame tra malattie cerebrovascolari e demenza vascolare (VaD)^4,5. In particolare in Cina, la VaD è uno dei tipi più comuni di demenza negli anziani, e l'elevata prevalenza di ictus ischemico (IS) è strettamente associata all'insorgenza della VaD. Tuttavia, la maggior parte degli studi esistenti è di tipo osservazionale, e possibili fattori di confondimento residui, causalità inversa e differenze nella definizione delle malattie possono limitare l'interpretazione causale. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci analitici per valutare se l'IS possa essere coinvolto nello sviluppo della VaD.

L'IS può influenzare l'insorgenza della VaD attraverso diversi meccanismi. Il danno cerebrovascolare causato dall'IS può portare a una perfusione cerebrale insufficiente e a successivi cambiamenti neurodegenerativi⁶. Inoltre, la VaD può essere associata a lesioni cerebrovascolari croniche, danni microvascolari e risposte infiammatorie successive all'IS^7,8. Pertanto, studiare la relazione tra IS e VaD è importante per comprendere potenziali collegamenti tra le malattie e per orientare future strategie di prevenzione.

La randomizzazione mendeliana (MR) è un metodo analitico che utilizza varianti genetiche come variabili strumentali per valutare possibili associazioni causali tra un'esposizione e un esito⁹. Rispetto agli studi osservazionali convenzionali, la MR può ridurre i fattori di confondimento e il bias da causalità inversa, a condizione che siano valide le assunzioni relative alle variabili strumentali. Rispetto agli studi controllati randomizzati o ai modelli sperimentali, la MR può utilizzare statistiche riassuntive esistenti di studi di associazione su tutto il genoma (GWAS) per valutare associazioni clinicamente rilevanti quando studi d'intervento diretti sono impraticabili, non etici o difficili da condurre. Studi genetici recenti basati su approcci di randomizzazione mendeliana hanno indagato l'associazione tra IS e VaD¹⁰. Tuttavia, descrizioni dettagliate a livello di protocollo relative alla selezione degli strumenti per l'esposizione, all'estrazione dei dati dell'esito, all'armonizzazione degli alleli, alla valutazione della forza dello strumento, ai test di eterogeneità, alla valutazione della pleiotropia e alle analisi di sensibilità rimangono fondamentali per un'implementazione riproducibile.

Questo protocollo è appropriato quando sono disponibili pubblicamente statistiche riassuntive di GWAS sia per l'esposizione che per l'esito di interesse, è possibile selezionare strumenti genetici validi per l'esposizione e la domanda di ricerca mira a valutare un'eventuale associazione causale piuttosto che stabilire direttamente meccanismi biologici. Questo studio presenta quindi un protocollo di MR a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD utilizzando statistiche riassuntive di GWAS pubblicamente disponibili. L'obiettivo è fornire un flusso di lavoro analitico riproducibile piuttosto che stabilire meccanismi biologici definitivi. Questo protocollo descrive la selezione degli strumenti genetici, l'abbinamento dell'esito, l'armonizzazione degli alleli, la stima dell'MR e le analisi di sensibilità, utilizzando l'associazione tra IS e VaD come esempio rappresentativo.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato statistiche riassuntive di GWAS disponibili pubblicamente. Gli studi originali avevano ottenuto l'approvazione del comitato etico e il consenso informato dai partecipanti. Per questa analisi secondaria non è stata richiesta ulteriore approvazione etica.

1. Progettazione dello studio e dichiarazione etica

1. Utilizzare un disegno di MR a due campioni per valutare l'associazione causale potenziale tra IS e VaD.
2. Utilizzare esclusivamente statistiche riassuntive GWAS disponibili pubblicamente. Poiché tutti gli studi originali inclusi nei set di dati GWAS avevano ottenuto l'approvazione del comitato etico e il consenso informato dai partecipanti, non è richiesta alcuna ulteriore approvazione etica per questa analisi secondaria.
3. Definire IS come esposizione e VaD come outcome prima dell'estrazione dei dati.

2. Preparazione del software

1. Eseguire tutte le analisi utilizzando il software statistico R.
2. Caricare il pacchetto TwoSampleMR per l'estrazione degli strumenti, l'estrazione dei dati dell'esito, l'armonizzazione degli alleli, la stima MR, i test di eterogeneità e le analisi di sensibilità. Caricare il pacchetto MRPRESSO per valutare la pleiotropia orizzontale globale e le possibili varianti outlier.
3. Utilizzare le seguenti funzioni principali nel flusso di lavoro: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot e mr_leaveoneout_plot. Utilizzare MRPRESSO::mr_presso per eseguire il test globale MR-PRESSO e, quando applicabile, i test per individuare outlier e distorsioni.

3. Selezione del set di dati di esposizione e screening della variabile strumentale

1. Estrarre i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) associati all'IS dal dataset IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Questo dataset comprende 11.929 casi di IS e 472.192 controlli, per un numero totale di partecipanti pari a 484.121.
2. Selezionare gli SNP candidati associati all'IS utilizzando una soglia di significatività di p < 5 × 10^-6.
   1. La soglia p < 5 × 10^-6 viene utilizzata in questo protocollo rappresentativo per mantenere un numero adeguato di strumenti indipendenti per le analisi di sensibilità. Poiché questa soglia è meno rigorosa rispetto alla soglia convenzionale di significatività a livello genoma, i risultati ottenuti con questi strumenti devono essere interpretati come esplorativi e indicativi, piuttosto che definitivi.
3. Eseguire il clumping per il disequilibrio di associazione (linkage disequilibrium) per mantenere SNP indipendenti. Utilizzare una soglia di r² pari a 0,001 e una finestra di clumping di 10.000 kb.
4. Utilizzare il seguente comando R per estrarre gli strumenti candidati:
   extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Calcolare la statistica F per ciascun SNP mantenuto utilizzando la formula F = (β/SE)², dove β e SE rappresentano rispettivamente la stima dell'effetto SNP-esposizione e l'errore standard.
6. Escludere gli SNP con una statistica F < 10 per ridurre il rischio di bias dovuto a strumenti deboli. Riassumere la distribuzione delle statistiche F utilizzando il valore minimo, massimo, mediano e l'intervallo interquartile (IQR).

4. Estrazione del set di dati degli esiti

1. Estrai le associazioni con l'esito di demenza vascolare (VaD) dal dataset FinnGen GWAS finn-b-F5_VASCDEM. Questo dataset comprende 881 casi di VaD e 211.508 controlli.
2. Estrai le associazioni con l'esito per tutti i SNP associati all'IS selezionati utilizzando la funzione extract_outcome_data.
3. Cerca SNP proxy quando i SNP bersaglio non sono direttamente disponibili nel dataset dell'esito. Mantieni le varianti corrispondenti a proxy quando sono disponibili informazioni valide sui proxy e la corrispondenza degli alleli.
4. Utilizza il seguente comando R per estrarre il dataset dell'esito:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Armonizzazione degli alleli e conservazione dei SNP

1. Armonizzare i dataset relativi all'esposizione e all'esito prima dell'analisi MR.
2. Allineare l'allele d'effetto e l'altro allele in modo che le stime dell'effetto SNP–esposizione e SNP–esito corrispondano allo stesso allele d'effetto.
3. Esaminare gli SNP durante l'armonizzazione per identificare discrepanze negli alleli, associazioni con l'esito non disponibili e allineamenti allelici ambigui. Mantenere gli SNP con stime d'effetto disponibili sia per l'esposizione che per l'esito dopo l'armonizzazione.
4. Utilizzare il seguente comando R per l'armonizzazione degli alleli: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Registrare il numero di SNP inizialmente estratti dal dataset dell'esposizione, il numero di SNP con associazioni all'esito disponibili, il numero di varianti sostitutive abbinate (proxy-matched) e il numero di SNP mantenuti per l'analisi MR finale.

6. Analisi MR primaria e analisi di sensibilità

1. Eseguire l'analisi MR primaria utilizzando il metodo weighted inverse variance (IVW).
2. Eseguire analisi MR complementari utilizzando i metodi weighted median e MR-Egger per valutare la coerenza della stima causale sotto diverse assunzioni.
3. Generare odds ratio (OR) e intervalli di confidenza al 95% (IC) a partire dalle stime MR.
4. Utilizzare i seguenti comandi R per eseguire l'analisi MR e calcolare gli odds ratio:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Poiché viene valutata una singola associazione esposizione–esito prespecificata, definire la soglia corretta con il metodo di Bonferroni per l'inferenza MR primaria come 0,05/1 = 0,05. Utilizzare un valore p bilaterale < 0,05 come soglia di significatività statistica per l'analisi IVW primaria.
6. Per contestualizzare la precisione statistica dell'analisi primaria data la limitata numerosità dei casi di demenza vascolare (VaD), effettuare un calcolo post hoc della potenza del test di Wald bilaterale basato sulla stima IVW osservata e sul suo errore standard. Calcolare la potenza utilizzando il parametro di non centralità βIVW/SEIVW a un livello α bilaterale di 0,05. Calcolare l'effetto minimo rilevabile corrispondente a una potenza dell'80% come exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Poiché l'IS è un'esposizione dicotomica e le associazioni SNP–esposizione sono espresse in scala logaritmica degli odds, riportare questa analisi come una valutazione descrittiva condizionata all'effetto della precisione piuttosto che come un calcolo prespecificato della dimensione campionaria¹¹.

7. Analisi dell'eterogeneità, pleiotropia orizzontale ed esclusione di un singolo elemento alla volta

1. Valutare l'eterogeneità tra SNP utilizzando la statistica Q di Cochran.
2. Utilizzare il seguente comando R per calcolare le statistiche di eterogeneità:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Valutare la pleiotropia orizzontale direzionale mediante il test dell'intercetta MR-Egger.
4. Utilizzare il seguente comando R per calcolare l'intercetta MR-Egger:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Valutare la pleiotropia orizzontale globale e le varianti outlier potenziali utilizzando MR-PRESSO con 10.000 simulazioni, una soglia di significatività di 0,05 e con i test per outlier e distorsione entrambi abilitati¹².
6. Utilizzare il seguente comando R per l'analisi MR-PRESSO:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0,05
   )
7. Eseguire un'analisi single-SNP per stimare l'effetto di ciascun SNP separatamente.
8. Utilizzare il seguente comando R per l'analisi single-SNP:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Eseguire un'analisi leave-one-out rimuovendo sequenzialmente un SNP alla volta e ripetendo l'analisi IVW.
10. Utilizzare il seguente comando R per l'analisi leave-one-out:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Visualizzazione e risultati

1. Generare un grafico a dispersione per mostrare le stime MR ottenute con diversi metodi.
2. Generare un grafico a foreste per mostrare le stime relative ai singoli SNP e la stima MR complessiva.
3. Generare un grafico a imbuto per valutare visivamente la simmetria delle stime specifiche per SNP.
4. Generare un grafico di tipo leave-one-out per verificare se la stima complessiva è influenzata da un singolo SNP.
5. Utilizzare i seguenti comandi R per generare i grafici:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Esportare i risultati dell'analisi MR, la tabella delle variabili strumentali, la tabella delle associazioni con l'esito e gli output dell'analisi di sensibilità per la rendicontazione e la riproducibilità.

Risultati

Figura 1 riassume il flusso di lavoro complessivo del protocollo di randomizzazione mendeliana a due campioni, dalla selezione dei dataset e dallo screening degli strumenti fino alle analisi di sensibilità e alla visualizzazione dei risultati. Di seguito sono presentati gli output rappresentativi di ciascuna fase.

Variabili strumentali genetiche e controllo di qualità dell'armonizzazione

Un totale di 52...

Discussione

Questo studio presenta un protocollo MR a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD, utilizzando dati riassuntivi GWAS disponibili pubblicamente. Nell'analisi rappresentativa, i metodi IVW e della mediana pesata hanno indicato un'associazione positiva tra IS predetta geneticamente e rischio di VaD, mentre la stima MR-Egger era coerente nella direzione ma non ha raggiunto la significatività statistica. Pertanto, questi risultati forniscono evidenze indicative di un possibile effetto causale, ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Set di dati GWAS FinnGen	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Set di dati GWAS pubblico utilizzato come fonte dell'esito per la demenza vascolare
Database IEU OpenGWAS	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	ebi-a-GCST90018864	Set di dati GWAS pubblico utilizzato come fonte dell'esposizione per l'ictus ischemico
Software R	R Foundation for Statistical Computing	Non applicabile	Software statistico utilizzato per l'analisi MR
RStudio	Posit Software, PBC	Non applicabile	Ambiente di sviluppo integrato utilizzato per eseguire script R
Pacchetto TwoSampleMR	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	Non applicabile	Pacchetto R utilizzato per l'estrazione degli strumenti, l'armonizzazione, l'analisi MR e le analisi di sensibilità
Pacchetto MRPRESSO	CRAN	Versione 1.0	Pacchetto R utilizzato per valutare la pleiotropia orizzontale globale e gli strumenti potenzialmente outlier
Pacchetto writexl	CRAN	Non applicabile	Pacchetto R utilizzato per esportare le tabelle dei risultati in file xlsx