Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile di randomizzazione mendeliana a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra ictus ischemico e demenza vascolare, utilizzando dati riassuntivi di studi di associazione sull'intero genoma disponibili pubblicamente.
Articolo metodologico
Relazione causale tra ictus ischemico e demenza vascolare: uno studio di randomizzazione mendeliana
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11 settembre 2026
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ictus ischemico (IS) è una delle principali cause di disabilità e mortalità a livello mondiale, e la demenza vascolare (VaD) è un sottotipo comune di demenza associato a lesioni cerebrovascolari. Studi osservazionali hanno suggerito un rapporto tra IS e VaD, ma tali studi sono suscettibili di confondimento e causalità inversa. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile di randomizzazione mendeliana (MR) a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD, utilizzando dati riassuntivi pubblicamente disponibili di studi d'associazione su tutto il genoma (GWAS). Gli strumenti genetici associati all'IS sono stati estratti da un dataset GWAS pubblico, mentre le associazioni con l'esito per VaD sono state ottenute da un dataset GWAS pubblico su VaD. Gli ID dei dataset corrispondenti sono indicati nella sezione Protocollo. Dopo l'abbinamento degli esiti e l'armonizzazione degli alleli, sono stati mantenuti 51 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) per l'analisi MR finale. Il flusso di lavoro comprende la selezione delle variabili strumentali, il raggruppamento per disequilibrio di associazione (linkage disequilibrium clumping), l'armonizzazione degli alleli, la valutazione della forza degli strumenti, l'analisi pesata per la varianza inversa (IVW), l'analisi della mediana pesata, l'analisi MR-Egger, il test di eterogeneità, la valutazione della pleiotropia orizzontale e l'analisi di sensibilità leave-one-out. Nell'analisi rappresentativa, il metodo IVW ha mostrato un'associazione positiva tra IS predetto geneticamente e rischio di VaD, e il metodo della mediana pesata ha prodotto un risultato concorde nella direzione. La stima MR-Egger era coerente nella direzione, ma non ha raggiunto la significatività statistica. Pertanto, questi risultati dovrebbero essere interpretati come evidenza indicativa di un possibile effetto causale, piuttosto che come prova definitiva di causalità. Questo protocollo potrebbe aiutare i ricercatori ad applicare un flusso di lavoro MR trasparente e riproducibile per indagare esiti legati alle malattie cerebrovascolari utilizzando dati GWAS pubblici.
Introduzione
L'ictus ischemico (IS) è una delle principali cause di disabilità grave e morte in tutto il mondo1. Secondo gli ultimi dati dello studio Global Burden of Disease, l'incidenza globale dell'IS è diminuita, ma rimane un peso significativo, in particolare nell'Europa orientale, nell'Asia orientale, nell'Asia centrale e nell'Africa subsahariana2,3. Inoltre, l'incidenza dell'IS è in aumento nei paesi con un basso indice socio-demografico (SDI) e si prevede che continuerà ad aumentare dal 2020 al 2030.
Numerosi studi epidemiologici hanno suggerito un possibile legame tra malattie cerebrovascolari e demenza vascolare (VaD)4,5. In particolare in Cina, la VaD è uno dei tipi più comuni di demenza negli anziani, e l'elevata prevalenza di ictus ischemico (IS) è strettamente associata all'insorgenza della VaD. Tuttavia, la maggior parte degli studi esistenti è di tipo osservazionale, e possibili fattori di confondimento residui, causalità inversa e differenze nella definizione delle malattie possono limitare l'interpretazione causale. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci analitici per valutare se l'IS possa essere coinvolto nello sviluppo della VaD.
L'IS può influenzare l'insorgenza della VaD attraverso diversi meccanismi. Il danno cerebrovascolare causato dall'IS può portare a una perfusione cerebrale insufficiente e a successivi cambiamenti neurodegenerativi6. Inoltre, la VaD può essere associata a lesioni cerebrovascolari croniche, danni microvascolari e risposte infiammatorie successive all'IS7,8. Pertanto, studiare la relazione tra IS e VaD è importante per comprendere potenziali collegamenti tra le malattie e per orientare future strategie di prevenzione.
La randomizzazione mendeliana (MR) è un metodo analitico che utilizza varianti genetiche come variabili strumentali per valutare possibili associazioni causali tra un'esposizione e un esito9. Rispetto agli studi osservazionali convenzionali, la MR può ridurre i fattori di confondimento e il bias da causalità inversa, a condizione che siano valide le assunzioni relative alle variabili strumentali. Rispetto agli studi controllati randomizzati o ai modelli sperimentali, la MR può utilizzare statistiche riassuntive esistenti di studi di associazione su tutto il genoma (GWAS) per valutare associazioni clinicamente rilevanti quando studi d'intervento diretti sono impraticabili, non etici o difficili da condurre. Studi genetici recenti basati su approcci di randomizzazione mendeliana hanno indagato l'associazione tra IS e VaD10. Tuttavia, descrizioni dettagliate a livello di protocollo relative alla selezione degli strumenti per l'esposizione, all'estrazione dei dati dell'esito, all'armonizzazione degli alleli, alla valutazione della forza dello strumento, ai test di eterogeneità, alla valutazione della pleiotropia e alle analisi di sensibilità rimangono fondamentali per un'implementazione riproducibile.
Questo protocollo è appropriato quando sono disponibili pubblicamente statistiche riassuntive di GWAS sia per l'esposizione che per l'esito di interesse, è possibile selezionare strumenti genetici validi per l'esposizione e la domanda di ricerca mira a valutare un'eventuale associazione causale piuttosto che stabilire direttamente meccanismi biologici. Questo studio presenta quindi un protocollo di MR a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD utilizzando statistiche riassuntive di GWAS pubblicamente disponibili. L'obiettivo è fornire un flusso di lavoro analitico riproducibile piuttosto che stabilire meccanismi biologici definitivi. Questo protocollo descrive la selezione degli strumenti genetici, l'abbinamento dell'esito, l'armonizzazione degli alleli, la stima dell'MR e le analisi di sensibilità, utilizzando l'associazione tra IS e VaD come esempio rappresentativo.
Protocollo
Questo studio ha utilizzato statistiche riassuntive di GWAS disponibili pubblicamente. Gli studi originali avevano ottenuto l'approvazione del comitato etico e il consenso informato dai partecipanti. Per questa analisi secondaria non è stata richiesta ulteriore approvazione etica.
1. Progettazione dello studio e dichiarazione etica
- Utilizzare un disegno di MR a due campioni per valutare l'associazione causale potenziale tra IS e VaD.
- Utilizzare esclusivamente statistiche riassuntive GWAS disponibili pubblicamente. Poiché tutti gli studi originali inclusi nei set di dati GWAS avevano ottenuto l'approvazione del comitato etico e il consenso informato dai partecipanti, non è richiesta alcuna ulteriore approvazione etica per questa analisi secondaria.
- Definire IS come esposizione e VaD come outcome prima dell'estrazione dei dati.
2. Preparazione del software
- Eseguire tutte le analisi utilizzando il software statistico R.
- Caricare il pacchetto TwoSampleMR per l'estrazione degli strumenti, l'estrazione dei dati dell'esito, l'armonizzazione degli alleli, la stima MR, i test di eterogeneità e le analisi di sensibilità. Caricare il pacchetto MRPRESSO per valutare la pleiotropia orizzontale globale e le possibili varianti outlier.
- Utilizzare le seguenti funzioni principali nel flusso di lavoro: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot e mr_leaveoneout_plot. Utilizzare MRPRESSO::mr_presso per eseguire il test globale MR-PRESSO e, quando applicabile, i test per individuare outlier e distorsioni.
3. Selezione del set di dati di esposizione e screening della variabile strumentale
- Estrarre i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) associati all'IS dal dataset IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Questo dataset comprende 11.929 casi di IS e 472.192 controlli, per un numero totale di partecipanti pari a 484.121.
- Selezionare gli SNP candidati associati all'IS utilizzando una soglia di significatività di p < 5 × 10-6.
- La soglia p < 5 × 10-6 viene utilizzata in questo protocollo rappresentativo per mantenere un numero adeguato di strumenti indipendenti per le analisi di sensibilità. Poiché questa soglia è meno rigorosa rispetto alla soglia convenzionale di significatività a livello genoma, i risultati ottenuti con questi strumenti devono essere interpretati come esplorativi e indicativi, piuttosto che definitivi.
- Eseguire il clumping per il disequilibrio di associazione (linkage disequilibrium) per mantenere SNP indipendenti. Utilizzare una soglia di r2 pari a 0,001 e una finestra di clumping di 10.000 kb.
- Utilizzare il seguente comando R per estrarre gli strumenti candidati:
extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE) - Calcolare la statistica F per ciascun SNP mantenuto utilizzando la formula F = (β/SE)2, dove β e SE rappresentano rispettivamente la stima dell'effetto SNP-esposizione e l'errore standard.
- Escludere gli SNP con una statistica F < 10 per ridurre il rischio di bias dovuto a strumenti deboli. Riassumere la distribuzione delle statistiche F utilizzando il valore minimo, massimo, mediano e l'intervallo interquartile (IQR).
4. Estrazione del set di dati degli esiti
- Estrai le associazioni con l'esito di demenza vascolare (VaD) dal dataset FinnGen GWAS finn-b-F5_VASCDEM. Questo dataset comprende 881 casi di VaD e 211.508 controlli.
- Estrai le associazioni con l'esito per tutti i SNP associati all'IS selezionati utilizzando la funzione extract_outcome_data.
- Cerca SNP proxy quando i SNP bersaglio non sono direttamente disponibili nel dataset dell'esito. Mantieni le varianti corrispondenti a proxy quando sono disponibili informazioni valide sui proxy e la corrispondenza degli alleli.
- Utilizza il seguente comando R per estrarre il dataset dell'esito:
extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)
5. Armonizzazione degli alleli e conservazione dei SNP
- Armonizzare i dataset relativi all'esposizione e all'esito prima dell'analisi MR.
- Allineare l'allele d'effetto e l'altro allele in modo che le stime dell'effetto SNP–esposizione e SNP–esito corrispondano allo stesso allele d'effetto.
- Esaminare gli SNP durante l'armonizzazione per identificare discrepanze negli alleli, associazioni con l'esito non disponibili e allineamenti allelici ambigui. Mantenere gli SNP con stime d'effetto disponibili sia per l'esposizione che per l'esito dopo l'armonizzazione.
- Utilizzare il seguente comando R per l'armonizzazione degli alleli: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
- Registrare il numero di SNP inizialmente estratti dal dataset dell'esposizione, il numero di SNP con associazioni all'esito disponibili, il numero di varianti sostitutive abbinate (proxy-matched) e il numero di SNP mantenuti per l'analisi MR finale.
6. Analisi MR primaria e analisi di sensibilità
- Eseguire l'analisi MR primaria utilizzando il metodo weighted inverse variance (IVW).
- Eseguire analisi MR complementari utilizzando i metodi weighted median e MR-Egger per valutare la coerenza della stima causale sotto diverse assunzioni.
- Generare odds ratio (OR) e intervalli di confidenza al 95% (IC) a partire dalle stime MR.
- Utilizzare i seguenti comandi R per eseguire l'analisi MR e calcolare gli odds ratio:
res <- mr(dat)
res <- generate_odds_ratios(res) - Poiché viene valutata una singola associazione esposizione–esito prespecificata, definire la soglia corretta con il metodo di Bonferroni per l'inferenza MR primaria come 0,05/1 = 0,05. Utilizzare un valore p bilaterale < 0,05 come soglia di significatività statistica per l'analisi IVW primaria.
- Per contestualizzare la precisione statistica dell'analisi primaria data la limitata numerosità dei casi di demenza vascolare (VaD), effettuare un calcolo post hoc della potenza del test di Wald bilaterale basato sulla stima IVW osservata e sul suo errore standard. Calcolare la potenza utilizzando il parametro di non centralità βIVW/SEIVW a un livello α bilaterale di 0,05. Calcolare l'effetto minimo rilevabile corrispondente a una potenza dell'80% come exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Poiché l'IS è un'esposizione dicotomica e le associazioni SNP–esposizione sono espresse in scala logaritmica degli odds, riportare questa analisi come una valutazione descrittiva condizionata all'effetto della precisione piuttosto che come un calcolo prespecificato della dimensione campionaria11.
7. Analisi dell'eterogeneità, pleiotropia orizzontale ed esclusione di un singolo elemento alla volta
- Valutare l'eterogeneità tra SNP utilizzando la statistica Q di Cochran.
- Utilizzare il seguente comando R per calcolare le statistiche di eterogeneità:
mr_heterogeneity(dat) - Valutare la pleiotropia orizzontale direzionale mediante il test dell'intercetta MR-Egger.
- Utilizzare il seguente comando R per calcolare l'intercetta MR-Egger:
mr_pleiotropy_test(dat) - Valutare la pleiotropia orizzontale globale e le varianti outlier potenziali utilizzando MR-PRESSO con 10.000 simulazioni, una soglia di significatività di 0,05 e con i test per outlier e distorsione entrambi abilitati12.
- Utilizzare il seguente comando R per l'analisi MR-PRESSO:
set.seed(20260729)
mr_presso(
BetaOutcome = "beta.outcome",
BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome",
SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = TRUE,
DISTORTIONtest = TRUE,
data = dat,
NbDistribution = 10000,
SignifThreshold = 0,05
) - Eseguire un'analisi single-SNP per stimare l'effetto di ciascun SNP separatamente.
- Utilizzare il seguente comando R per l'analisi single-SNP:
res_single <- mr_singlesnp(dat) - Eseguire un'analisi leave-one-out rimuovendo sequenzialmente un SNP alla volta e ripetendo l'analisi IVW.
- Utilizzare il seguente comando R per l'analisi leave-one-out:
res_loo <- mr_leaveoneout(dat)
8. Visualizzazione e risultati
- Generare un grafico a dispersione per mostrare le stime MR ottenute con diversi metodi.
- Generare un grafico a foreste per mostrare le stime relative ai singoli SNP e la stima MR complessiva.
- Generare un grafico a imbuto per valutare visivamente la simmetria delle stime specifiche per SNP.
- Generare un grafico di tipo leave-one-out per verificare se la stima complessiva è influenzata da un singolo SNP.
- Utilizzare i seguenti comandi R per generare i grafici:
mr_scatter_plot(res, dat)
mr_forest_plot(res_single)
mr_funnel_plot(res_single)
mr_leaveoneout_plot(res_loo) - Esportare i risultati dell'analisi MR, la tabella delle variabili strumentali, la tabella delle associazioni con l'esito e gli output dell'analisi di sensibilità per la rendicontazione e la riproducibilità.
Risultati
Figura 1 riassume il flusso di lavoro complessivo del protocollo di randomizzazione mendeliana a due campioni, dalla selezione dei dataset e dallo screening degli strumenti fino alle analisi di sensibilità e alla visualizzazione dei risultati. Di seguito sono presentati gli output rappresentativi di ciascuna fase.
Variabili strumentali genetiche e controllo di qualità dell'armonizzazione
Un totale di 52 SNP associati all'IS sono stati inizialmente estratti dal dataset GWAS dell'esposizione utilizzando una soglia di significatività di p < 5 × 10-6. Le associazioni con l'outcome sono state quindi estratte dal dataset GWAS della demenza vascolare (VaD). Dopo l'abbinamento dell'outcome, la ricerca di SNP proxy e l'armonizzazione degli alleli, sono stati mantenuti 51 SNP per l'analisi finale di MR. Due varianti sono state abbinate utilizzando SNP proxy. Gli strumenti genetici mantenuti sono elencati nella Tabella 1. I valori di F-statistica dei 51 strumenti mantenuti variavano da 20,91 a 46,06, con una mediana di 25,08 e un IQR di 22,95–30,71. Nessuno dei SNP mantenuti presentava un valore di F-statistica inferiore a 10, indicando una bassa probabilità di bias dovuto a strumenti deboli.
Stime MR per IS e VaD
Il diagramma di dispersione ha mostrato la direzione e l'entità delle stime specifiche per SNP ottenute con diversi metodi di MR (Figura 2). I metodi IVW e della mediana pesata hanno evidenziato associazioni positive, mentre la stima ottenuta con MR-Egger era coerente nella direzione ma non ha raggiunto la significatività statistica.
Il grafico a foreste delle stime individuali dei SNP ha mostrato le associazioni specifiche per SNP con il rischio di demenza vascolare (VaD) (Figura 3). Le stime complessive di MR sono riassunte nella Figura 4. Il metodo IVW ha evidenziato un'associazione positiva statisticamente significativa tra ictus ischemico (IS) predetto geneticamente e rischio di VaD (OR = 1.63, 95% CI: 1.21–2.21, p = 0.0013). Il metodo della mediana pesata ha prodotto una stima significativa concorde (OR = 1.60, 95% CI: 1.06–2.42, p = 0.0240). La stima MR-Egger era direzionalmente coerente ma non ha raggiunto la significatività statistica (OR = 2.21, 95% CI: 0.97–5.01, p = 0.0645).
Lo studio GWAS sull'esito di VaD di FinnGen includeva 881 casi e 211.508 controlli. In un calcolo post hoc del test di Wald bilaterale condizionato alla stima osservata IVW, la potenza stimata per l'analisi primaria IVW era dell'89,5% con α = 0,05. L'effetto minimo rilevabile corrispondente per una potenza dell'80% era un OR di 1,54. Al contrario, l'effetto minimo rilevabile per l'analisi MR-Egger era un OR di 3,23, valore superiore alla stima MR-Egger osservata con direzione concorde (OR = 2,21). Pertanto, il risultato non significativo dell'analisi MR-Egger deve essere interpretato come riflesso della limitata precisione di questo estimatore di sensibilità meno efficiente, piuttosto che, di per sé, come evidenza contraria alla direzione della stima primaria IVW.
Poiché è stata valutata una sola associazione prespecificata tra esposizione e outcome, la soglia corretta con il metodo di Bonferroni per l'inferenza primaria di MR era pari a 0,05/1 = 0,05. Pertanto, il risultato IVW ha soddisfatto la soglia di significatività corretta. Nel complesso, questi risultati forniscono evidenze suggestive di un possibile effetto positivo dell'IS predetta geneticamente sul rischio di demenza vascolare (VaD), principalmente basate sulla stima IVW e sostenute dall'analisi di sensibilità per la mediana pesata. Tuttavia, la stima MR-Egger era coerente nella direzione, ma non ha raggiunto la significatività statistica; pertanto, i risultati non devono essere interpretati come evidenza definitiva di causalità.
Analisi dell'eterogeneità e della pleiotropia orizzontale
L'eterogeneità tra SNP è stata valutata utilizzando la statistica Q di Cochran. Il test di eterogeneità IVW ha prodotto un valore Q = 57,46 con 50 gradi di libertà (p = 0,218), mentre il test di eterogeneità MR-Egger ha prodotto un valore Q = 56,77 con 49 gradi di libertà (p = 0,208). Questi risultati non hanno indicato un'eterogeneità sostanziale tra le stime specifiche per SNP. La pleiotropia orizzontale direzionale è stata valutata mediante il test dell'intercetta MR-Egger. L'intercetta MR-Egger è risultata pari a -0,0195 (SE = 0,0253, p = 0,444), indicando l'assenza di evidenza statistica di pleiotropia orizzontale direzionale. L'analisi MR-PRESSO è stata condotta utilizzando i 51 SNP armonizzati conservati, con 10.000 simulazioni. Il test globale MR-PRESSO non ha mostrato evidenza di pleiotropia orizzontale globale (RSSobs = 59,61; p empirico = 0,2388). Poiché il test globale non è risultato statisticamente significativo, i test individuali di outlier e di distorsione non erano applicabili e non è stata generata alcuna stima corretta per gli outlier. Il grafico a imbuto ha fornito una valutazione visiva della simmetria delle stime specifiche per SNP (Figura 5). Le impostazioni e i risultati dettagliati di MR-PRESSO sono riportati in Tabella Supplementare 1.
Analisi di sensibilità leave-one-out e convalida dell'output del protocollo
È stata eseguita un'analisi di tipo leave-one-out per valutare se la stima complessiva di MR fosse influenzata da un singolo SNP. Il grafico leave-one-out ha mostrato che la rimozione sequenziale di singoli SNP non modificava sostanzialmente la stima complessiva (Figura 6), suggerendo che nessuno strumento genetico singolo dominasse l'associazione. Nel complesso, questi risultati rappresentativi dimostrano l'output pratico del flusso di lavoro di MR a due campioni descritto in questo protocollo. Tabella 1 mostra gli strumenti genetici conservati dopo la selezione e l'armonizzazione degli SNP. Figura 2 illustra la direzione delle stime di MR attraverso i diversi metodi, Figura 3 presenta le stime specifiche per SNP, Figura 4 riassume le stime complessive di MR, Figura 5 supporta la valutazione visiva della pleiotropia o asimmetria, e Figura 6 valuta l'influenza dei singoli SNP. Tabella Supplementare 2 collega ogni passaggio principale del protocollo al relativo output di validazione.
Tutte le statistiche riassuntive grezze GWAS analizzate in questo studio sono disponibili pubblicamente. Il dataset relativo all'esposizione all'ictus ischemico è stato ottenuto dal database IEU OpenGWAS con l'ID del dataset ebi-a-GCST90018864. Il dataset relativo all'esito demenza vascolare è stato ottenuto dal dataset GWAS di FinnGen con l'ID del dataset finn-b-F5_VASCDEM. La tabella delle variabili strumentali estratte, il dataset dell'analisi armonizzata, le tabelle dei risultati MR e i file di output pertinenti sono forniti come file supplementari.
Figura 1. Flusso di lavoro del protocollo MR a due campioni. Questa figura riassume i passaggi principali del protocollo, inclusa la selezione del set di dati dell'esposizione, la selezione delle variabili strumentali, l'estrazione dei dati dell'esito, l'armonizzazione degli alleli, la stima MR, il test di eterogeneità, la valutazione della pleiotropia orizzontale, l'analisi leave-one-out e la visualizzazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Grafico a dispersione delle stime di MR per l'associazione tra IS e VaD. Ogni punto rappresenta una stima specifica per SNP. Le linee tracciate rappresentano l'associazione stimata ottenuta utilizzando diversi metodi di MR. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Grafico a foreste delle stime MR per singolo SNP. Questa figura mostra le stime specifiche per singolo SNP relative all'associazione tra varianti genetiche associate all'ictus e il rischio di demenza vascolare. Le linee orizzontali rappresentano intervalli di confidenza al 95%. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Forest plot delle stime complessive di MR ottenute con diversi metodi. Questa figura riassume le stime complessive di MR ottenute utilizzando i metodi IVW, mediana pesata e MR-Egger. Le linee orizzontali rappresentano intervalli di confidenza al 95%. MR, randomizzazione mendeliana; IVW, pesato per la varianza inversa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Grafico a imbuto delle stime di MR specifiche per SNP. Questa figura mostra la distribuzione delle stime di MR specifiche per SNP e consente una valutazione visiva della simmetria tra gli strumenti genetici. MR, randomizzazione mendeliana; IVW, ponderato per la varianza inversa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6. Analisi di sensibilità leave-one-out. Questa figura mostra la stima MR dopo la rimozione sequenziale di ciascun SNP. Il grafico è stato utilizzato per valutare se la stima complessiva fosse influenzata da un singolo strumento genetico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| N. | SNP | Gene | Chr. | EA | OA | EAF.IS | EAF.VD | IS β (SE) | VD β (EE) | statistica F | R² |
| 1 | rs10886430 | GRK5 | 10 | G | A | 0.118244 | 0.09536 | 0.1147 (0.0220) | -0.0172 (0.0852) | 27.18 | 5,61E-05 |
| 2 | rs10936572 | LOC107986051 | 3 | T | C | 0.179643 | 0.1235 | -0.0512 (0.0104) | 0.1444 (0.0743) | 24.24 | 5,01E-05 |
| 3 | rs11045239 | PDE3A | 12 | A | G | 0.492943 | 0.4629 | 0.0604 (0.0089) | 0.0303 (0.0494) | 46.06 | 9,51E-05 |
| 4 | rs11047532 | LOC105369698 | 12 | G | C | 0.305214 | 0.1513 | 0.0499 (0.0105) | 0.0159 (0.0689) | 22.59 | 4,66E-05 |
| 5 | rs11065836 | CUX2 | 12 | A | G | 0.159123 | 0.07442 | -0.0608 (0.0103) | 0.0245 (0.0929) | 34.84 | 7,20E-05 |
| 6 | rs11105378 | ATP2B1 | 12 | T | C | 0.203466 | 0.07522 | -0.0540 (0.0098) | -0.1174 (0.0916) | 30.36 | 6,27E-05 |
| 7 | rs117140252 | - | 14 | A | G | 0.041216 | 0.06988 | 0.1568 (0.0311) | 0.1498 (0.0967) | 25.42 | 5,25E-05 |
| 8 | rs117343276 | - | 10 | G | A | 0.030533 | 0.0431 | -0.0905 (0.0196) | -0.1449 (0.1233) | 21.32 | 4,40E-05 |
| 9 | rs11831940 | HDAC7 | 12 | A | G | 0.251914 | 0.3526 | 0.0631 (0.0130) | 0.1226 (0.0513) | 23.56 | 4,87E-05 |
| 10 | rs11880613 | DNM2 | 19 | A | G | 0.184857 | 0.1804 | -0.0613 (0.0110) | 0.1499 (0.0640) | 31.06 | 6,41E-05 |
| 11 | rs12445022 | LOC124903748 | 16 | A | G | 0.271667 | 0.3193 | 0.0605 (0.0112) | 0.0218 (0.0527) | 29.18 | 6,03E-05 |
| 12 | rs12509595 | - | 4 | C | T | 0.297929 | 0.3124 | 0.0577 (0.0091) | 0.1462 (0.0533) | 40.2 | 8,30E-05 |
| 13 | rs12633109 | - | 3 | T | G | 0.360897 | 0.3263 | 0.0436 (0.0089) | 0.0395 (0.0526) | 24 | 4,96E-05 |
| 14 | rs1275980 | KCNK3 | 2 | T | C | 0.498545 | 0.5481 | -0.0582 (0.0094) | -0.0128 (0.0495) | 38.33 | 7,92E-05 |
| 15 | rs13123551 | - | 4 | A | T | 0.616442 | 0.5065 | 0.0552 (0.0097) | 0.0818 (0.0493) | 32.38 | 6,69E-05 |
| 16 | rs147871383 | MIR99AHG | 21 | A | G | 0.02368 | 0.01925 | 0.2259 (0.0494) | 0.2534 (0.1903) | 20.91 | 4,32E-05 |
| 17 | rs16918175 | - | 10 | C | T | 0.104037 | 0.0811 | -0.0649 (0.0131) | 0.0332 (0.0895) | 24.54 | 5,07E-05 |
| 18 | rs17182166 | ACVR1 | 2 | T | G | 0.12494 | 0.137 | 0.0751 (0.0156) | -0.0046 (0.0703) | 23.18 | 4,79E-05 |
| 19 | rs1906779 | - | 15 | A | G | 0.211386 | 0.1239 | 0.0438 (0.0095) | -0.0342 (0.0758) | 21.26 | 4,39E-05 |
| 20 | rs1948696 | ITGB5 | 3 | C | T | 0.650138 | 0.6041 | -0.0459 (0.0091) | 0.0219 (0.0501) | 25.44 | 5,25E-05 |
| 21 | rs1973765 | LSP1 | 11 | C | T | 0.486717 | 0.4124 | 0.0441 (0.0092) | -0.0229 (0.0505) | 22.98 | 4,75E-05 |
| 22 | rs2429123 | CACNA1C, DCP1B | 12 | C | T | 0.729926 | 0.725 | 0.0473 (0.0098) | 0.0190 (0.0549) | 23.3 | 4,81E-05 |
| 23 | rs2447561 | - | 8 | T | A | 0.873442 | 0.8382 | -0.0589 (0.0116) | -0.0570 (0.0674) | 25.78 | 5,33E-05 |
| 24 | rs245015 | MSH3 | 5 | A | G | 0.685061 | 0.6562 | -0.0456 (0.0089) | 0.0065 (0.0519) | 26.25 | 5,42E-05 |
| 25 | rs2501968 | CENPQ | 6 | G | A | 0.465302 | 0.4229 | -0.0490 (0.0086) | -0.0879 (0.0498) | 32.46 | 6,71E-05 |
| 26 | rs2526620 | - | 7 | G | A | 0.252144 | 0.2459 | 0.0500 (0.0092) | 0.0505 (0.0576) | 29.54 | 6,10E-05 |
| 27 | rs284160 | TGFBR3 | 1 | A | G | 0.192644 | 0.1186 | 0.0572 (0.0096) | 0.1573 (0.0768) | 35.5 | 7,33E-05 |
| 28 | rs2842870 | PMF1, PMF1-BGLAP | 1 | C | T | 0.360398 | 0.3434 | -0.0446 (0.0087) | -0.0727 (0.0518) | 26.28 | 5,43E-05 |
| 29 | rs2880492 | NCOR2 | 12 | C | T | 0.035841 | 0.01984 | -0.1293 (0.0266) | -0.1917 (0.1781) | 23.63 | 4,88E-05 |
| 30 | rs35790371 | RBFOX1 | 16 | A | G | 0.005125 | 0.001903 | 0.5587 (0.1176) | 0.1447 (0.5420) | 22.57 | 4,66E-05 |
| 31 | rs5752720 | TTC28 | 22 | T | C | 0.28441 | 0.1844 | 0.0422 (0.0091) | -0.0311 (0.0635) | 21.51 | 4,44E-05 |
| 32 | rs57694670 | SH3PXD2A | 10 | G | A | 0.433638 | 0.3834 | -0.0507 (0.0086) | 0.0080 (0.0507) | 34.76 | 7,18E-05 |
| 33 | rs6462001 | - | 7 | T | G | 0.881494 | 0.8329 | -0.0765 (0.0151) | -0.0567 (0.0662) | 25.67 | 5,30E-05 |
| 34 | rs6843082 | - | 4 | A | G | 0.65294 | 0.6907 | -0.0438 (0.0092) | -0.0568 (0.0534) | 22.67 | 4,68E-05 |
| 35 | rs7091346 | SH3PXD2A | 10 | T | C | 0.45273 | 0.2664 | -0.0582 (0.0098) | -0.0143 (0.0552) | 35.27 | 7,28E-05 |
| 36 | rs7194129 | CFDP1 | 16 | T | C | 0.573691 | 0.5538 | 0.0399 (0.0084) | 0.0293 (0.0495) | 22.56 | 4,66E-05 |
| 37 | rs7341574 | ZFPM2 | 8 | T | C | 0.313243 | 0.3895 | 0.0463 (0.0094) | -0.0774 (0.0505) | 24.26 | 5,01E-05 |
| 38 | rs7451833 | - | 6 | G | A | 0.103042 | 0.1166 | 0.1280 (0.0220) | 0.1253 (0.0777) | 33.85 | 6,99E-05 |
| 39 | rs74617384 | LPA | 6 | T | A | 0.070999 | 0.04573 | 0.1415 (0.0281) | -0.0532 (0.1162) | 25.36 | 5,24E-05 |
| 40 | rs74849463 | PIK3C2B | 1 | T | C | 0.240949 | 0.2043 | 0.0445 (0.0092) | -0.0319 (0.0616) | 23.4 | 4,83E-05 |
| 41 | rs757241 | AFAP1-AS1 | 4 | C | G | 0.673377 | 0.6704 | -0.0681 (0.0145) | -0.0274 (0.0523) | 22.06 | 4,56E-05 |
| 42 | rs76099321 | CNNM2 | 10 | A | G | 0.052085 | 0.02979 | -0.0691 (0.0150) | -0.2215 (0.1464) | 21.22 | 4,38E-05 |
| 43 | rs7670136 | - | 4 | C | T | 0.571088 | 0.6269 | -0.0473 (0.0101) | 0.0391 (0.0509) | 21.93 | 4,53E-05 |
| 44 | rs77455924 | NTM | 11 | T | C | 0.056457 | 0.02996 | 0.1632 (0.0331) | 0.0444 (0.1477) | 24.31 | 5,02E-05 |
| 45 | rs7820334 | - | 8 | T | C | 0.246549 | 0.2949 | -0.0643 (0.0127) | -0.1327 (0.0648) | 25.63 | 5,29E-05 |
| 46 | rs7859727 | CDKN2B-AS1 | 9 | T | C | 0.518845 | 0.4151 | 0.0569 (0.0087) | 0.0281 (0.0498) | 42.77 | 8,83E-05 |
| 47 | rs7989823 | COL4A1, COL4A2 | 13 | C | A | 0.591615 | 0.6188 | 0.0527 (0.0089) | 0.0693 (0.0518) | 35.06 | 7,24E-05 |
| 48 | rs79960344 | - | 17 | G | T | 0.102808 | 0.1031 | 0.0651 (0.0130) | -0.1596 (0.0805) | 25.08 | 5,18E-05 |
| 49 | rs880315 | CASZ1 | 1 | C | T | 0.445525 | 0.4139 | 0.0416 (0.0089) | 0.0444 (0.0501) | 21.85 | 4,51E-05 |
| 50 | rs9112 | LOC100505841 | 5 | A | G | 0.436595 | 0.3573 | 0.0407 (0.0085) | -0.0274 (0.0523) | 22.93 | 4,74E-05 |
| 51 | rs979380 | - | 17 | A | G | 0.531844 | 0.6197 | -0.0417 (0.0084) | -0.0196 (0.0506) | 24.64 | 5,09E-05 |
| EAF.IS e EAF.VD indicano le frequenze degli alleli d'effetto rispettivamente nei dati relativi all'esposizione all'ictus ischemico e all'esito relativo alla demenza vascolare. Statistica F = (β/SE)². R² per SNP = F/(F + N − 2), dove N = 484.121. Gli SNP sono stati selezionati utilizzando p < 5 × 10-6 e raggruppamento per disequilibrio di associazione con r² < 0,001 all'interno di una finestra di 10.000 kb. | |||||||||||
Tabella 1: Strumenti genetici per l'ictus ischemico e associazioni corrispondenti SNP–esito per la demenza vascolare (VaD). La tabella elenca i 51 SNP finali, inclusi l'ID del SNP, il gene mappato, il cromosoma, gli alleli, la FAE, le stime SNP–carattere, le statistiche F e l'R2 per ogni SNP. I SNP sono stati selezionati con p < 5 × 10-6 e raggruppati con r2 < 0,001 entro 10.000 kb. EAF.IS ed EAF.VD indicano le frequenze dell'allele effetto nei dataset IS e VD, rispettivamente. Chr., cromosoma; EA, allele effetto; OA, altro allele; EAF, frequenza dell'allele effetto; IS, ictus ischemico; VD, demenza vascolare. Cliccare qui per scaricare questa tabella.
Tabella supplementare 1. Valutazione della pleiotropia orizzontale mediante MR-PRESSO per l'analisi ictus ischemico–demenza vascolare. Questa tabella riassume l'analisi MR-PRESSO eseguita per valutare la pleiotropia orizzontale globale e le possibili varianti outlier utilizzando il set di dati finale armonizzato composto da 51 SNP.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 2. Passaggi del protocollo e risultati corrispondenti di convalida. Questa tabella collega ogni passaggio principale del protocollo al relativo risultato rappresentativo e alla posizione riportata nel manoscritto, dimostrando l'implementazione e la convalida del flusso di lavoro analitico.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Questo studio presenta un protocollo MR a due campioni per valutare l'eventuale associazione causale tra IS e VaD, utilizzando dati riassuntivi GWAS disponibili pubblicamente. Nell'analisi rappresentativa, i metodi IVW e della mediana pesata hanno indicato un'associazione positiva tra IS predetta geneticamente e rischio di VaD, mentre la stima MR-Egger era coerente nella direzione ma non ha raggiunto la significatività statistica. Pertanto, questi risultati forniscono evidenze indicative di un possibile effetto causale, piuttosto che una prova definitiva di causalità.
L'associazione osservata è biologicamente plausibile nel contesto del danno cerebrovascolare. L'IS può provocare danno neuronale regionale, alterazione della perfusione cerebrale e successivi cambiamenti neurodegenerativi. Studi precedenti hanno dimostrato che spesso il VaD si verifica in condizioni di riduzione del flusso ematico cerebrale o di danno cerebrovascolare13,14. Le alterazioni cerebrovascolari croniche successive all'IS potrebbero ulteriormente contribuire al declino cognitivo e al rischio di VaD15. Inoltre, il danno microvascolare post-ictus, le risposte infiammatorie e la disfunzione neurovascolare cronica potrebbero rappresentare possibili collegamenti biologici tra IS e VaD. Tuttavia, l'attuale protocollo di RM non può stabilire direttamente questi meccanismi, e i risultati dovrebbero essere interpretati insieme a futuri studi di validazione meccanicistica e clinica.
La stima ottenuta con MR-Egger non ha raggiunto la significatività statistica. Questo risultato dovrebbe essere interpretato con cautela, piuttosto che come una contraddizione diretta dei risultati ottenuti con IVW e con la mediana pesata. MR-Egger può fornire stime più robuste rispetto a certe forme di pleiotropia direzionale, ma di solito ha una potenza statistica inferiore, specialmente quando gli effetti degli strumenti sono modesti. In questa analisi, l'intercetta di MR-Egger non ha indicato una pleiotropia orizzontale direzionale statisticamente significativa, e i test di eterogeneità non hanno mostrato un'eterogeneità sostanziale tra SNP. Inoltre, il test globale MR-PRESSO non ha evidenziato alcuna prova di pleiotropia orizzontale globale. Queste analisi di sensibilità riducono la preoccupazione riguardo a pleiotropie direzionali o globali misurabili, ma non escludono tutte le possibili fonti di bias né stabiliscono una relazione causale.
Il numero modesto di casi di demenza vascolare dovrebbe comunque essere preso in considerazione nell'interpretazione di questi risultati. Sebbene l'analisi primaria IVW avesse una potenza post hoc stimata del 89,5% condizionata all'effetto osservato, questo risultato è descrittivo e non deve essere interpretato come una giustificazione predeterminata della dimensione del campione. Il numero limitato di casi ha ridotto in particolare la precisione degli stimatori di sensibilità meno efficienti; l'effetto minimo rilevabile all'80% per MR-Egger era un OR di 3,23, superiore alla stima osservata. Di conseguenza, il risultato non significativo di MR-Egger non elimina l'incertezza riguardo all'entità dell'associazione. Questi calcoli di potenza inoltre non considerano potenziali bias legati alla validità dello strumento, alla sovrapposizione dei campioni, all'eterogeneità del fenotipo o alla pleiotropia orizzontale residua.
Diversi passaggi analitici sono fondamentali per l'affidabilità di questo flusso di lavoro di MR. In primo luogo, i set di dati GWAS relativi all'esposizione e all'esito devono essere chiaramente identificati utilizzando ID del set di dati o informazioni di accesso. In secondo luogo, la selezione dei SNP e il raggruppamento per disequilibrio di associazione devono essere eseguiti utilizzando soglie predeterminate per ottenere strumenti genetici indipendenti. In terzo luogo, la potenza dello strumento deve essere valutata mediante statistiche F per ridurre il rischio di bias dovuto a strumenti deboli. In quarto luogo, l'armonizzazione degli alleli è essenziale per garantire che le stime SNP–esposizione e SNP–esito corrispondano allo stesso allelo d'effetto. Infine, analisi di eterogeneità, pleiotropia orizzontale e analisi leave-one-out devono essere utilizzate per valutare se la stima principale è influenzata da effetti dei SNP non coerenti, da pleiotropia direzionale o da un singolo strumento genetico dominante.
Fonti comuni di errore o bias in questo flusso di lavoro includono SNP associati all'esposizione insufficienti, strumenti deboli, SNP per l'esito non disponibili, allineamento ambiguo degli alleli, varianti palindromiche, discrepanza nei SNP proxy, eterogeneità tra le stime specifiche per SNP, pleiotropia orizzontale, disallineamento tra popolazioni, eterogeneità del fenotipo e possibile sovrapposizione dei campioni. Questi problemi possono essere affrontati verificando gli identificatori dei set di dati GWAS, applicando soglie coerenti per la selezione e il raggruppamento dei SNP, documentando l'uso di SNP proxy, esaminando gli output dell'armonizzazione, riassumendo le statistiche F e interpretando le stime MR insieme ai risultati relativi a eterogeneità, pleiotropia e analisi leave-one-out. Se viene rilevata un'ampia eterogeneità o pleiotropia, la stima primaria IVW deve essere interpretata con cautela e si dovrebbero considerare ulteriori analisi di sensibilità o set di dati alternativi.
Va inoltre considerato il potenziale sovrapporsi dei campioni. Gli studi GWAS sull'esposizione e gli studi GWAS sugli esiti di FinnGen sono entrambi derivati da risorse con ascendenza europea, e l'entità di un eventuale sovrapposizione tra partecipanti non poteva essere quantificata a partire dalle statistiche riassuntive disponibili. Tale sovrapposizione potrebbe distorcere le stime di MR a due campioni verso associazioni osservative, in particolare quando gli strumenti non sono fortemente associati all'esposizione. Questa limitazione va tenuta in considerazione nell'interpretare il risultato rappresentativo.
Rispetto agli studi osservazionali di coorte o caso-controllo convenzionali, la MR può ridurre il confondimento e il bias da causalità inversa, a condizione che siano valide le assunzioni relative alla variabile strumentale. Tuttavia, gli studi osservazionali rimangono utili per stimare l'incidenza delle malattie, i modelli temporali e la prognosi clinica. Rispetto agli studi controllati randomizzati o ai modelli sperimentali, la MR può valutare possibili associazioni causali utilizzando dati genetici esistenti quando studi d'intervento diretti sono impraticabili o eticamente inaccettabili. Tuttavia, la MR non può rivelare direttamente i meccanismi cellulari né sostituire la validazione meccanicistica. Pertanto, questo protocollo dovrebbe essere considerato complementare agli studi di coorte, alle analisi trasversali, ai modelli animali e agli esperimenti cellulari, piuttosto che un sostituto di questi.
Studi precedenti hanno esplorato i fattori di rischio vascolari e gli esiti correlati alla demenza utilizzando approcci epidemiologici e genetici. Ad esempio, il diabete e l'ipertensione sono stati associati al rischio di demenza in precedenti ricerche cliniche e basate sulla popolazione16. Studi esistenti basati sulla MR hanno inoltre indagato l'IS, la VaD e i meccanismi correlati alla comorbilità. Il presente manoscritto si differenzia da questi studi per il suo obiettivo principale. Piuttosto che mirare all'identificazione di nuovi bersagli molecolari o alla validazione sperimentale dei meccanismi della malattia, questo articolo si concentra sulla presentazione di un protocollo riproducibile per condurre un'analisi MR a due campioni utilizzando statistiche riassuntive GWAS disponibili pubblicamente.
Questo protocollo presenta diversi limiti. In primo luogo, l'analisi si è basata su statistiche riassuntive di GWAS disponibili pubblicamente e i risultati potrebbero non essere completamente generalizzabili a popolazioni non europee o a dataset con definizioni di caso diverse. In secondo luogo, è stato utilizzato un criterio di selezione meno rigoroso per i SNP (p < 5 × 10-6) al fine di mantenere un numero adeguato di strumenti indipendenti per le analisi di sensibilità. Sebbene tutti gli strumenti mantenuti avessero valori di F-statistic >10, questa soglia è meno stringente rispetto alla soglia convenzionale di significatività a livello genoma e potrebbe includere varianti con associazioni all'esposizione più deboli o meno robuste. Pertanto, i risultati rappresentativi dovrebbero essere interpretati come esplorativi e indicativi, piuttosto che come prova definitiva di causalità. In terzo luogo, sebbene la regressione mendeliana (MR) possa ridurre i bias dovuti a confondimento e causalità inversa, non può escludere completamente la pleiotropia orizzontale, la classificazione errata del fenotipo, l'overlapping del campione o i bias introdotti da strumenti non validi. In quarto luogo, la stima non significativa di MR-Egger indica che l'interpretazione causale dovrebbe rimanere cauta. In quinto luogo, questo protocollo non include esperimenti su cellule, modelli animali o validazione in coorti indipendenti; tali approcci sarebbero utili per chiarire i meccanismi biologici e l'applicabilità clinica.
Inoltre, l'IS è stato modellato come un fenotipo complessivo. Questo protocollo rappresentativo non è stato progettato per determinare se un'associazione possa essere attribuita a ictus aterosclerotico dell'arteria di grosso calibro, occlusione dei vasi piccoli, ictus cardioembolico o a un altro sottotipo. Di conseguenza, il risultato non deve essere interpretato come evidenza di un effetto specifico per un sottotipo. Studi futuri dovrebbero applicare lo stesso flusso di lavoro a dataset GWAS ben potenziati e specifici per sottotipo, utilizzando un piano di analisi predeterminato e armonizzato.
Applicazioni future di questo protocollo potrebbero estendersi oltre l'IS e la VaD. Lo stesso flusso di lavoro può essere adattato per valutare altre relazioni tra esposizione e outcome di tipo cerebrovascolare, neurodegenerativo, metabolico, infiammatorio o cardiovascolare, quando sono disponibili statistiche riassuntive GWAS adeguate. Studi futuri potrebbero inoltre estendere questo flusso di lavoro incorporando una validazione GWAS indipendente, MR bidirezionale, MR multivariabile, MR di mediazione, oppure l'integrazione con evidenze basate su coorti ed evidenze sperimentali.
In sintesi, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per eseguire un'analisi MR a due campioni utilizzando statistiche riassuntive GWAS pubbliche. I risultati rappresentativi forniscono evidenze suggestive di una possibile associazione positiva tra IS predetto geneticamente e rischio di demenza vascolare (VaD), sostenuta principalmente dai metodi IVW e mediana pesata, mentre la stima MR-Egger non ha raggiunto la significatività statistica. Tuttavia, i risultati non devono essere interpretati come prova meccanicistica definitiva. Sono necessari ulteriori studi di validazione basati su popolazioni indipendenti e indagini sperimentali per chiarire i meccanismi biologici e la rilevanza clinica di questa associazione.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto. Nessuno strumento di intelligenza artificiale (AI) o modello linguistico di grandi dimensioni (LLM) è stato utilizzato nella stesura, revisione o preparazione di questo manoscritto.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno ricevuto finanziamenti specifici per questo studio.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Set di dati GWAS FinnGen | FinnGen | finn-b-F5_VASCDEM | Set di dati GWAS pubblico utilizzato come fonte dell'esito per la demenza vascolare |
| Database IEU OpenGWAS | MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol | ebi-a-GCST90018864 | Set di dati GWAS pubblico utilizzato come fonte dell'esposizione per l'ictus ischemico |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Non applicabile | Software statistico utilizzato per l'analisi MR |
| RStudio | Posit Software, PBC | Non applicabile | Ambiente di sviluppo integrato utilizzato per eseguire script R |
| Pacchetto TwoSampleMR | MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol | Non applicabile | Pacchetto R utilizzato per l'estrazione degli strumenti, l'armonizzazione, l'analisi MR e le analisi di sensibilità |
| Pacchetto MRPRESSO | CRAN | Versione 1.0 | Pacchetto R utilizzato per valutare la pleiotropia orizzontale globale e gli strumenti potenzialmente outlier |
| Pacchetto writexl | CRAN | Non applicabile | Pacchetto R utilizzato per esportare le tabelle dei risultati in file xlsx |
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