Articolo metodologico

Un metodo chirurgico per stabilire un modello murino di osteoartrite al ginocchio utilizzando una procedura Hulth modificata

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 maggio 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo delinea i passaggi chirurgici raffinati del modello Hulth modificato, fornendo un metodo standardizzato e riproducibile per indurre l'osteoartrite sperimentale.

Abstract

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L'osteoartrite del ginocchio (KOA) è una malattia degenerativa cronica dell'articolazione caratterizzata da degenerazione della cartilagine articolare, rimodellamento dell'osso sottocondrale, formazione di osteofite e sinovite, che è il tipo più comune di artrosi.

Questo protocollo presenta un metodo chirurgico per stabilire un modello murino di osteoartrite al ginocchio utilizzando una procedura Hulth modificata. Rispetto ai modelli chirurgici indotti da iniezione o convenzionali, come la destabilizzazione del menisco mediale (DMM) e la transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), il modello Hulth modificato induce un'esordio precoce della malattia e un'infiammazione articolare più grave. Attraverso la taglienza del legamento collaterale mediale, del menisco mediale e del legamento crociato anteriore, questo metodo interrompe l'allineamento meccanico dell'articolazione del ginocchio, favorendo così la progressione dell'OA. Questo modello è particolarmente adatto per studiare la patologia acuta dell'artrosi e valutare potenziali interventi terapeutici. Per valutare la gravità dell'artrite, abbiamo utilizzato l'ecografia su piccoli animali combinata con la ricostruzione tridimensionale (3D) della cavità articolare per quantificarne il volume e valutare l'accumulo di liquido sinoviale. Inoltre, è stata eseguita una colorazione safranina-O/verde veloce delle sezioni istologiche per la valutazione dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) per valutare la distruzione della cartilagine.

Introduzione

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L'osteoartrite del ginocchio (OA) è una comune malattia articolare cronica, degenerativa e caratterizzata clinicamente da dolore, rigidità, limitata mobilità e debolezza muscolare intorno al ginocchio. La sua prevalenza è più alta nelle donne che negli uomini. Se non controllata adeguatamente, l'OA può portare a una perdita progressiva della capacità fisica, disturbi del sonno, affaticamento cronico e eventuale disabilità. Con l'invecchiamento delle popolazioni globali, l'incidenza dell'OA al ginocchio continua a crescere, rappresentando una sfida significativa per i sistemi sanitari e le economie a livellomondiale 1,2.

Fisiopatologicamente, la perdita di cartilagine rappresenta la caratteristica centrale dell'OA, accompagnata da un compromisso strutturale e funzionale dell'intera articolazione e dei tessuti periarticolari. Per chiarire i meccanismi della malattia e valutare interventi terapeutici, sono stati sviluppati diversi modelli animali che riproducono aspetti chiave dell'OA umana. Tra questi, i modelli indotti chirurgicamente sono i più frequentemente impiegati. Ad esempio, la destabilizzazione del menisco mediale (DMM)3 e della transezione del legamento crociato anteriore (ACLT)4, disturbano la struttura articolare normale, causando degenerazione della cartilagine e cambiamenti simili all'OA. In alternativa, i modelli chimici si basano sull'iniezione intraarticolare di agenti che degradano la matrice extracellulare (ad esempio, collagenasi o iodoacetato monosodico), portando a una rapida morte dei condrociti ed erosionecartilaginea 5,6. Mentre i modelli di iniezione solitamente raggiungono la patologia finale in poche settimane, i modelli chirurgici richiedono generalmente un percorso di tempo più lungo.

Tra le tecniche chirurgiche disponibili, abbiamo selezionato e perfezionato ulteriormente il modello Hulth grazie al suo accelerato insorgenzadell'OA 7. Combinando la transezione dei legamenti crociato anteriore e posteriore con la resezione del legamento collaterale mediale e la meniscectomia totale mediale, questo modello induce in modo affidabile danni gravi e rapidamente progressivi alla cartilagine e alterazioni ossee sottocondrali. Il breve intervallo temporale fino al cedimento delle articolazioni strutturali rende il modello Hulth modificato particolarmente adatto per studi di OA acuta o subacuta, e proponiamo che il nostro protocollo ottimizzato offra una piattaforma pratica e riproducibile per future indagini precliniche.

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Protocollo

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Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato di Etica Animale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Shanghai. I maschi C57BL/6 topi di età compresa tra 6 e 8 settimane e con un peso di circa 20 g sono stati acquistati da fornitori commerciali (vedi Tabella dei materiali) (numero di approvazione etica: PZSHUTCM2312210005).

1. Cura preoperatoria

  1. Permette ai topi di acclimatarsi per almeno una settimana prima dell'intervento.
  2. Sterilizza tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento e disinfetta lo spazio di lavoro chirurgico.
  3. Accendi la macchina per l'anestesia a gas e metti il topo in una camera di induzione per 5 minuti usando isoflurano al 2-3% per iniziare l'anestesia generale.
    NOTA: Assicurarsi che la portata di ossigeno sia mantenuta tra 0,5 NL/min e 1 NL/min.
  4. Una volta anestetizzato, trasferire il topo sulla piattaforma chirurgica e mantenere l'anestesia utilizzando isoflurano 1-1,5% tramite maschera anestesica fino al completamento dell'intervento (isoflurano 1-1,5%).
  5. Posiziona il topo in posizione supina con le articolazioni del ginocchio rivolte verso l'alto, garantendo stabilità e un corretto accesso al sito chirurgico.
  6. Conferma la profondità dell'anestesia controllando l'assenza di riflessi, poi applica una crema depilatoria per rimuovere completamente i peli intorno all'articolazione del ginocchio.
  7. Rimuovere con cura la crema residua usando garze o cotton fioc, poi disinfettare prima la pelle esposta con etanolo al 75%, seguita dalla tintura di iodio per garantire condizioni asettiche.

2. Procedura chirurgica (Figura 1)

  1. Allunga il ramo posteriore del topo e applica trazione per tendere la pelle. Esegui un'incisione longitudinale da 0,5-1 cm lungo il lato mediale dell'articolazione del ginocchio destro utilizzando una lama chirurgica sterile.
    NOTA: Tutte le procedure chirurgiche descritte di seguito sono state eseguite al microscopio chirurgico.
  2. Ritrai la pelle ed esegui una dissezione smussata della fascia sottostante per esporre completamente la capsula articolare e visualizzare il legamento rotuliano.
  3. Esaminare e incidere la fascia sopra il legamento collaterale mediale (LCM), utilizzando un ago di iniezione fine.
  4. Tranzettare il MCL usando microforbici in ingrandimento.
  5. Spostare il legamento rotulaio usando un ago per esporre lo spazio intra-articolare e identificare il menisco mediale.
  6. Trancetta il legamento meniscotibiale mediale (MMTL) con microforbici dopo il taglio e sonda delicatamente il tessuto con un ago per confermare il completo distacco e la mobilità del menisco.
  7. Identificare e trasettare il legamento crociato crociato anteriore (LCA), facendo attenzione a evitare danni al legamento crociato posteriore (LCP) o al menisco laterale. Questo di solito porta a un segno positivo del cassetto anteriore dopo l'intervento, confermando l'instabilità articolare.
    NOTA: Test del cassetto: Prima della chiusura della ferita, il femore veniva stabilizzato con una mano mentre la caviglia veniva afferrata con l'altra, mantenendo tibia e femore in orientamento perpendicolare. Lo spostamento relativo anteroposteriore tra tibia e femore è stato applicato manualmente; Il movimento traslazionale osservabile ha indicato un segno di drawer positivo, confermando la rottura del legamento crociato.
  8. Per indurre artrosi più gravi, si può eseguire la transezione simultanea sia del legamento crociato anteriore (LCA) che del legamento crociato posteriore (PCL) combinata con la meniscectomia mediale (MMT) (come nel modello classico di Hulth).
    NOTA: Questo passaggio è opzionale e può essere eseguito secondo necessità; se selezionato, questo costituisce l'approccio di modellazione del classico modello Hulth.

3. Cure post-operatorie

  1. Chiudi l'incisione con suture in nylon 4-0 e disinfetta il sito chirurgico con tintura di iodio.
  2. Posiziona il topo su una base termica a temperatura controllata finché non riprende conoscenza e mostra normali attività respiratorie e motorie. Una volta completamente guarito e senza segni di disagio, riportalo nella gabbia di casa.
  3. Monitorare l'integrità dei punti di sutura in modo continuo per 3-5 giorni dopo l'intervento. Se si osserva una rottura della sutura, si rianestesia il topo e si effettua una nuova sutura
  4. Somministrare antibiotici intramuscolari fino a 3 giorni dopo l'intervento per prevenire infezioni post-operatorie.
    NOTA: La somministrazione di antibiotici viene impiegata per la profilassi contro infezioni post-operatorie. L'analgesia postoperatoria è determinata da obiettivi sperimentali; Nella ricerca sull'osteoartrite, gli analgesici vengono solitamente trattenuti durante la fase acuta per evitare valutazioni di efficacia terapeutica confuse.
  5. Monitorare quotidianamente il sito chirurgico per segni di gonfiore, secrezione o infiammazione locale.
  6. Eutanasia il topo al punto finale dello studio, seguendo i protocolli approvati, e seziona l'articolazione del ginocchio per analisi istologiche o di imaging.
    NOTA: In questo momento abbiamo adottato il protocollo di eutanasia degli animali da sperimentazione tramite anestesia per overdosaggio. Questo è stato ottenuto tramite iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodio a un dosaggio di >100 mg/kg nei topi.

4. Valutazione dello sviluppo dell'OA

  1. Prima dell'eutanasia, si valuta il gonfiore articolare ed eseguire un'ecografia per valutare i cambiamenti strutturali nell'articolazione del ginocchio. Valuta le prestazioni motorie del topo eseguendo il test rotatorio.
    NOTA: L'anestesia isoflurana è necessaria per l'esame ecografia nei topi.
  2. Dopo l'eutanasia, sezionare l'articolazione del ginocchio e rimuovere con cura il muscolo e la fascia circostanti, preservando tibia, perone e femore.
    Fissare le articolazioni e decalcificale in una soluzione al 10% di acido etilendediaminetetraacetico (EDTA) per almeno 30 giorni, sostituendo la soluzione due volte a settimana per garantire una completa decalcificazione.
  3. Immergere le articolazioni decalcificate del ginocchio in paraffina e preparare sezioni sagittali a uno spessore di 4μm 8.
  4. Inizia a raccogliere le sezioni una volta che il menisco è chiaramente visibile. Tingi le sezioni con safranina O e verde veloce per visualizzare la morfologia della cartilagine e dell'osso sottocondrale. Valutare la degradazione della cartilagine utilizzando il sistema di punteggioOARSI 9 .
  5. Procedura di colorazione Safranin O-Fast Green (Kit commerciale utilizzato, vedi Tabella dei materiali)
    1. Deparaffinizzazione e reidratazione
      1. Deparafinizza le sezioni nello xilene per 3 minuti, ripeti 3 volte.
      2. Reidratare attraverso una serie di etanolo gradato (100%, 90%, 80%) per rimuovere il residuo di xilene, 2 min ciascuno.
        NOTA: Le serie di etanolo devono essere utilizzate in ordine decrescente di concentrazione.
      3. Risciacquare in acqua distillata per 1 minuto e scolare brevemente.
    2. Colorazione dell'Ematossilina di Ferro di Weigert
      1. Applica la soluzione di lavoro di Weigert alle sezioni, tingi per 5 minuti.
      2. Risciacquare in acqua distillata per 1 minuto e scolare brevemente.
    3. Differenziazione acida
      1. Applica la soluzione differenziante acida sulle sezioni per 15 secondi.
      2. Lava in acqua per 10 minuti e svuota l'acqua in eccesso.
        NOTA: Il tempo di differenziazione è fondamentale — una differenziazione prolungata impedisce una colorazione verde rapida, mentre una differenziazione insufficiente provoca una colorazione verde profonda e rapida con scarsa assorbimento della safranina
    4. Colorazione verde veloce
      1. Applica una soluzione verde veloce alle sezioni per 5 minuti, poi svuota brevemente.
      2. Applica una soluzione acida debole per rimuovere la macchia verde veloce residua per 15 secondi, e scolla brevemente.
    5. Colorazione Safranin O
      1. Applica la soluzione di Safraninin O alle sezioni per 4,5 minuti.
      2. Trasferire rapidamente sezioni al 90% di etanolo per rimuovere l'eccesso di safranina O, per 2-3 secondi.
        NOTA: Questo passaggio può essere esteso in modo appropriato a seconda dell'intensità della colorazione con la safranina.
    6. Disidratazione e pulizia
      1. Disidrata le sezioni con etanolo al 100% per 1 minuto.
      2. Liberare le sezioni con xilene per la completa disidratazione, 2 minuti, ripetere 3 volte.
        NOTA: Lo xilene utilizzato in questo passaggio non deve essere miscelato con quello usato nella Sezione 4.5.1; La contaminazione incrociata può compromettere la qualità della sezione.
    7. Montaggio con balsamo neutro
      1. Posiziona le sezioni in una cappa per permettere all'eccesso di xilene di evaporare.
      2. Rimuovere le sezioni, applicare una quantità adeguata di balsamo neutro sull'esemplare e coprire con cura con una copertura.
      3. Esamina le sezioni al microscopio per trovare bolle d'aria ed elimina con attenzione quelle presenti.
      4. Conserva le sezioni in una scatola per slide e mettila in forno a 60 °C per 24 ore per garantire la completa stagione del balsamo neutro.

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Risultati

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Le scansioni longitudinali dell'articolazione del ginocchio sono state eseguite utilizzando un sistemamicro-ultrasuoni 8 con un passo di scansione di 4 mm e una risoluzione assiale di 0,04 mm. Al giorno 7 postoperatorio, la ricostruzione 3D ha rivelato un marcato aumento del volume delle cavità articolari nel gruppo modello rispetto al gruppo fittizio (Figura 2A,B). I test di faticarotatoria

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Discussione

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Confrontando con altri metodi di modellazione chirurgica, come la destabilizzazione del menisco mediale (DMM) e la transezione del legamento crociato anteriore (ACLT), il modello Hulth modificato induce l'osteoartrite attraverso lesioni combinate ligamentose e meniscale. La specifica rottura strutturale determina le alterazioni nella biomeccanica articolare su diversi piani. L'ACLT4 compromette la stabilità rotazionale (rotazione interna ed esterna) e riduce la st...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato finanziato dal Science and Technology Innovation Action Plan a Shanghai (23YF1447900 a CJM), dal Programma Chenguang della Shanghai Education Development Foundation e dalla Shanghai Municipal Education Commission (23CGA53 a CJM), e dalla National Natural Science Foundation of China (da U24A6013 a XH).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa iniezione da 1 mL//Specifiche: 30 G e volte; 0,13 mm
Sistema di imaging a ultrasuoni 3D Vevo 3100OtticaVevo 2100Un sistema di imaging a ultrasuoni ad alta frequenza integrato con il software Vevo LAB per l'analisi dei dati.
Sutura in nylon 4-0//
etanolo al 75%Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
Maschi C57BL/6J (6-8 settimane)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
Crema depilatoriaVeetLot: C021123001
Tintura di iodio//
IsofluranoRWD R650-IE
Micro pinzeRWD F12013-10
Micro forbiciRWD S11035-08
Kit modificato Safranin O e Fast Green StainSolarbioG1371
PortaaghiRWD F21001-12
Lame chirurgiche (10#)RWD S31010-01
Microscopio chirurgicoOlympusSZ61

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

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