Questo studio valuta l'utilità diagnostica e prognostica della rilevazione combinata di IFN-γ sierologico e neutrofilo CD64 per la tubercolosi polmonare attiva in pazienti anziani immunocompromissi.
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Articolo di ricerca
Questo studio valuta l'utilità diagnostica e prognostica della rilevazione combinata di IFN-γ sierologico e neutrofilo CD64 per la tubercolosi polmonare attiva in pazienti anziani immunocompromissi.
Questo studio ha valutato il rischio di tubercolosi polmonare attiva (ATB) in pazienti anziani con immunità indebolita rilevando congiuntamente interferone-γ sierico (IFN-γ) e neutrofilo CD64, analizzando l'impatto di questo protocollo diagnostico sull'evoluzione dell'ATB. Sono stati reclutati in totale 50 pazienti con ATB e 50 controlli sani abbinati per età e sesso. Successivamente, il neutrofilo CD64 del paziente (quantificato come percentuale di neutrofili CD64-positivi [CD64%]), IFN-γ (tramite saggio immunoenzimatico legato [ELISA]), la proteina C-reattiva (CRP; tramite immunoturbidimetria) e il tasso di sedimentazione degli eritrociti (ESR; con metodo Westergren). I campioni di espettorato provenienti dai pazienti sono stati colti su un mezzo Löwenstein-Jensen (L-J) e nel sistema automatizzato MGIT 960. L'efficacia diagnostica dei biomarcatori individuali e combinati è stata valutata con l'analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC), e è stato sviluppato un modello di regressione logistica per la rilevazione combinata. Sono stati osservati livelli significativamente elevati sia di IFN-γ che di CD64 nei pazienti ATB rispetto ai controlli sani (P<0,05). Un modello diagnostico che incorpora entrambi i biomarcatori aveva un'area sotto la curva (AUC) di 0,838, con una sensibilità dell'84,00% e una specificità del 76,00%. Entrambi i marcatori sono diminuiti dopo l'intervento terapeutico (P<0,05), mostrando i valori più bassi nei pazienti negativi alla cultura (P<0,05). Inoltre, il modello combinato ha mostrato utilità predittiva per la conversione della cultura, raggiungendo un AUC di 0,756 (65,71% di sensibilità, 80,00% di specificità; P<0.001). La diagnosi combinata di IFN-γ e CD64 può diagnosticare efficacemente l'insorgenza di ATB negli anziani immunodepressi, fornendo un riferimento per la pratica clinica.
La tubercolosi polmonare (TB), una malattia infettiva cronica causata da Mycobacterium tuberculosis (MTB), causa più di 10 milioni di nuovi casi a livello globale ogni anno ed è la principale causa di morte per un singolo patogenoinfettivo 1. Clinicamente, le popolazioni ad alto rischio di ATB includono individui immunocompromessi, pazienti con diabete, fumatori di lunga data, contatti stretti di casi di tubercolosi e anziani2. Tra questi gruppi, gli anziani con immunità compromessa presentano un rischio marcatamente elevato di ATB3. La diagnosi accurata e precoce della TB attiva (ATB) è cruciale per la prognosi, data la sua trasmissibilità e il rischio di progressionegrave 4. Eppure le strategie attuali, basate su sintomatologia, imaging e test dell'esputorato, mancano di biomarcatori specifici, creando un divario diagnosticocritico 5. Questa incertezza diagnostica è aggravata dalla mancanza di indicatori dinamici di valutazione della gravità, spesso portando a trattamenti empirici che non soddisfano le esigenze individualidei pazienti 6. Di conseguenza, l'identificazione di biomarcatori altamente sensibili e specifici è fondamentale per migliorare la differenziazione e la stratificazione precoce dell'ATB.
L'interferone-γ (IFN-γ), una citochina centrale nella risposta delle cellule T agli antigeni specifici per MTB, riflette lo stato di attivazione immunitaria nell'ATB, con livelli sierici elevati che ne facilitano la diagnosi; inoltre, ha valore nel distinguere tra infezione TB latente (LTBI) eATB 7,8. Pur essendo preziosa, la sua utilità è compromessa dalla specificità limitata dovuta all'interferenza della vaccinazione contro il Bacillo Calmette-Guerin e di altre infezioni9. Al contrario, i neutrofili sono la prima popolazione di cellule immunitarie reclutate nei polmoni e infiltrano lesioni ATB, dove il loro coinvolgimento nell'amplificazione infiammatoria è collegato alla sovraespressione di CD64, il recettore Fc-gamma I10 ad alta affinità. Tuttavia, nessuno studio precedente ha combinato IFN-γ e neutrofilo CD64 per valutarne l'utilità diagnostica e prognostica sinergica per l'ATB, in particolare negli anziani immunocompromessi, una coorte con sfide diagnostiche uniche dovute a risposte immunitarie attenuate e presentazioni cliniche atipiche.
Questo studio ha selezionato IFN-γ e CD64 per i loro ruoli complementari nell'immunità anti-MTB adattiva e innata, nell'accessibilità ai test clinici e nel valore diagnostico indipendente riportato in studi precedenti, senza alcuna valutazione combinata su pazienti anziani immunocompromissi fino ad oggi. Lo studio combina IFN-γ sirico (misurato tramite saggio immunosorbente legato a enzimi [ELISA], che riflette l'immunità adattiva delle cellule T) e neutrofilo CD64 (misurato tramite citometria a flusso, riflettendo l'attivazione immunitaria innata e il carico infiammatorio), con la performance diagnostica valutata tramite analisi della curva delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e modellazione di regressione logistica. L'utilità di questo saggio combinato per la diagnosi e il monitoraggio della progressione della malattia da ATB negli anziani immunocompromissi è stata valutata sistematicamente.
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Il protocollo dello studio ha ricevuto l'approvazione del Consiglio di Revisione Istituzionale del Quinto Ospedale Popolare di Ganzhou, Ganzhou, Jiangxi, Cina. È stato ottenuto un consenso informato scritto da tutte le persone che hanno partecipato allo studio. Tutte le procedure che coinvolgono Mycobacterium tuberculosis (MTB) vitale sono state eseguite in una struttura di contenimento di livello di biosicurezza 3 (BSL-3), in piena conformità con le linee guida nazionali di biosicurezza per la gestione di patogeni infettivi. Per la liquefazione dell'espettorato mediata da NaOH, gli operatori indossavano dispositivi di protezione individuale completi (respiratori N95, guanti in nitrilo, camici resistenti ai liquidi e visiere) per prevenire l'esposizione a sostanze chimiche e aerosol. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Partecipanti alla ricerca
Il protocollo dello studio inizia con l'iscrizione e il consenso informato dei partecipanti idonei e termina con il completamento dell'analisi statistica di tutti gli endpoint primari e secondari. Questo studio retrospettivo monocentrico ha arruolato pazienti ATB (gruppo ATB) e controlli sani (gruppo di controllo) dal nostro ospedale tra maggio 2023 e maggio 2025, con tutte le procedure dello studio completate prima dell'analisi dei dati. Il diagramma di flusso dello studio è mostrato nella Figura 1. I gruppi ATB e di controllo erano comparabili al punto di partenza, senza differenze significative nelle caratteristiche demografiche e nelle comorbidità croniche comuni (P>0,05, Tabella 1), confermando l'omogeneità dei due gruppi.
2. Stima della dimensione del campione
La dimensione del campione è stata stimata utilizzando dati preliminari di 10 soggetti, che hanno mostrato livelli mediani di IFN-γ di 20 pg/mL nei pazienti ATB contro 10 pg/mL nei controlli sani. Per rilevare una differenza significativa (assumendo un livello di significatività [α]=0,05, a due code; potenza di test [1-β]=80%; dimensione d'effetto media [Cohen's d≈1,2]), un'analisi con il software PASS 15.0 ha prodotto un requisito minimo di 42 partecipanti per gruppo (potenza reale=81,2%, α=0,05, a due code). Considerando un tasso di abbandono scolastico del 10%–15%, abbiamo infine reclutato un totale di 100 soggetti (50 per gruppo) dopo aver effettuato uno screening secondo i criteri dello studio.
3. Raccolta di campioni di prova
Sono stati prelevati 3–5 mL di sangue venoso a digiuno da ciascun paziente. Il sangue è stato prelevato direttamente in un tubo EDTA per l'analisi CD64 tramite citometria di flusso e in un tubo attivatore di coaguli per la separazione del siero. Il siero è stato poi analizzato per i livelli di IFN-γ, proteina C-reattiva (CRP) e tasso di sedimentazione degli eritrociti (ESR).
4. Citometria a flusso
Il sangue intero (100 μL) è stato incubato con un cocktail di anticorpi pre-miscelato (5 μL ciascuno di CD16-FITC, CD14-APC e CD64-PE) per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Gli eritrociti sono stati successivamente lisati con 1 mL di Soluzione Lisante BD FACS per 10 minuti, protetti dalla luce. Dopo la centrifugazione (centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente), il sovrantantante veniva scartato. Il pellet cellulare rimanente è stato lavato due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e infine risospeso in 500 μL di PBS per l'acquisizione immediata sul citometro di flusso. Per l'analisi, abbiamo innanzitutto determinato la popolazione di leucociti utilizzando parametri di scatter diretto (FSC) e side scatter (SSC). I neutrofili sono stati quindi identificati selettivamente all'interno di questa porta come eventi negativi per CD14-APC (escludendo monociti) e positivi per CD16-FITC. La popolazione positiva al CD64 è stata definita utilizzando un controllo con isotipo abbinato, con la porta impostata per includere il <1% degli eventi di controllo isotipo; la percentuale di neutrofili positivi a CD64 (CD64%) è stata calcolata come la proporzione di neutrofili a gate che si ritrovano all'interno di questa porta positiva. Per scopi di controllo qualità, lo studio ha incluso un campione sano di controllo in ogni esperimento per stabilire un intervallo di base di MFI (15–30). È stato annotato qualsiasi campione di MFI persistentemente superiore a 30. La calibrazione quotidiana degli strumenti veniva eseguita anche utilizzando perle BD CS&T per mantenere una compensazione costante della fluorescenza e impostazioni di tensione. Parametri di acquisizione dello strumento: L'acquisizione citometrica a flusso è stata effettuata su un citometro a flusso, con un minimo di 10.000 eventi neutrofili gated raccolti per campione. Le tensioni di scatter diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) erano impostate rispettivamente a 350 V e 280 V. Le tensioni dei canali di fluorescenza venivano ottimizzate quotidianamente utilizzando perle BD C&T per garantire una rilevazione e una compensazione costanti. Punti di controllo della qualità visiva: (1) La popolazione di leucociti è stata chiaramente risolta su grafici FSC/SSC senza contaminazioni significative da detriti; (2) La porta dei neutrofili è stata confermata come CD14-negativa e CD16-positiva, con una contaminazione da monociti del <5%; (3) L'istogramma di fluorescenza CD64 era unimodale senza colorazioni significative e non specifiche.
5. ELISA
Il siero veniva separato tramite centrifugazione e il test veniva eseguito secondo le istruzioni del produttore del kit ELISA. Per un breve periodo, 50 μL di campioni siero standard o di prova sono stati dispensati in pozzi rivestiti di anticorpi e incubati a 37 °C per 90 minuti. I passaggi successivi hanno coinvolto l'aggiunta sequenziale di anticorpi anti-umani biotinilati di IFN-γ (100 μL), complesso streptavidina-perossidasi di rafano (HRP) (100 μL), substrato cromogenico e soluzione di stop. Un algoritmo di adattamento a quattro parametri è stato applicato alla curva standard per calcolare le concentrazioni finali di IFN-γ in pg/mL. Controllo qualità: La validità del saggio richiedeva che i valori di QC bassi/medi/alti (15,6, 62,5, 250 pg/mL) rientrassero nell'intervallo specificato ± 2 DS, mantenendo i coefficienti di variazione (CV) intra- e inter-saggio, rispettivamente sotto l'8% e il 10%.
6. Saggio immunoturbidimetrico
Dopo la centrifugazione, i livelli di CRP sierici sono stati determinati utilizzando un analizzatore biochimico automatizzato con un kit immunoturbidimetrico potenziato con particelle di lattice abbinato, secondo il protocollo standardizzato del produttore. Il saggio si basava sull'agglutinazione della CRP con anticorpi specifici legati alle particelle di lattice, che aumentava la torbidità in proporzione diretta alla concentrazione di CRP ed era quantificata fotometricamente. Controllo qualità: Ogni lotto di saggio includeva siero di controllo qualità a bassa concentrazione (< 3 mg/L) e ad alta concentrazione (>100 mg/L) (Beckman). I valori ottenuti dovevano rientrare nell'intervallo accettabile specificato dal produttore (±3 SD). La CV intra-saggio è stata mantenuta al ≤5%, mentre quella inter-saggio al ≤8%.
7. Metodo Westergren
Il sangue venoso nel tubo attivatore del coagulo è stato lasciato in piedi per 1 ora. Il plasma veniva poi aspirato in un tubo Westergren da 1,6 mL e posizionato verticalmente in un analizzatore ESR a 37 °C per 1 ora. Il risultato veniva calcolato automaticamente e riportato come l'altezza di sedimentazione in mm/h. Controllo qualità: L'analizzatore veniva calibrato quotidianamente utilizzando un tubo di sedimentazione standard per la calibrazione a punto zero.
8. Cultura MTB
I campioni di espetto sono stati liquefatti con il 4% di NaOH, neutralizzati e centrifugati (centrifugazione a 1200 × g per 15 minuti a temperatura ambiente), seguita dalla rimozione del sovrantante. Il sedimento risultante è stato inoculato sul mezzo Löwenstein-Jensen (L-J) (2-3 gocce per tubo). Le colture sono state incubate a 37°C in un incubatore a temperatura costante e esaminate settimanalmente per la crescita della colonia. Un risultato positivo è stato definito dalla comparsa delle tipiche colonie simili al cavolfiore entro ≥2 settimane. Controllo qualità: Le misure di controllo della qualità comprendevano controlli negativi concomitanti (soluzione salina sterile) e positivi (H37Rv) in ogni lotto, insieme a test mensili di sterilità del mezzo di coltura.
9. Trattamento e follow-up
Tutti i pazienti ATB hanno ricevuto terapia antitubercolosica standardizzata di prima linea (regime 2HRZE/4HR: fase intensiva di 2 mesi con isoniazide, rifampicina, pirazimide, etambutolo; fase di continuazione di 4 mesi con isoniazide e rifampicina). La coltura micobatterica dell'espettoro è stata eseguita al punto di partenza e 2 mesi dopo l'inizio del trattamento per valutare la conversione della coltura.
10. Smaltimento dei rifiuti
I rifiuti biopericolosi (inclusi campioni residui di sangue, campioni di espetto e materiali per colture MTB) sono stati decontaminati tramite autoclaving a 121 °C per 30 minuti prima dello smaltimento finale. I rifiuti chimici (inclusi la soluzione di NaOH, il tampone di lisi e i reagenti fluorescenti per colorazione) venivano raccolti in contenitori sigillati e designati per rifiuti pericolosi e smaltiti secondo i protocolli istituzionali di gestione dei rifiuti chimici.
11. Metodi statistici
L'analisi dello studio ha utilizzato SPSS 30.0. I dati categorici (ad esempio, genere) sono stati confrontati tramite test chi-quadrato. La normalità dei dati continui è stata verificata tramite il test di Shapiro-Wilk, e l'omogeneità della varianza tramite il test di Levene. I dati continui normalmente distribuiti con varianza omogenea sono stati confrontati utilizzando test t a campioni indipendenti; dati non distribuiti normalmente venivano confrontati utilizzando il test Mann-Whitney U. L'analisi della curva ROC è stata effettuata utilizzando il modulo "ROC Curve", con lo stato diagnostico binario (ATB vs. controllo) come variabile di stato e i livelli dei biomarcatori come variabile di test. Il modello diagnostico combinato è stato costruito tramite regressione logistica binaria, con IFN-γ e CD64 inseriti come variabili indipendenti continue e lo stato diagnostico (ATB=1, controllo=0) come variabile dipendente. La formula di regressione era: Logit(P) = -3,274 + 0,082×IFN-γ (pg/mL) + 0,115×CD64%. Il valore di soglia per la rilevazione combinata si basava sulla probabilità prevista dal modello, con la soglia ottimale determinata dall'indice di Youden. Sono state utilizzate probabilità previste dal modello per generare la curva ROC combinata. Le correlazioni venivano calcolate utilizzando il coefficiente di Pearson. Un P-valore<0,05 definisce la significanza statistica.
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L'efficacia diagnostica della rilevazione combinata di IFN-γ e CD64 nell'ATB
Rispetto al gruppo di controllo, il livello medio di IFN-γ nel gruppo ATB è aumentato del 22,57% (21,84 ± 4,23 contro 16,91 ± 4,41 pg/mL, P<0,05), e il CD64% medio è aumentato del 24,97% (14,90 ± 4,04 ± 11,18 3,56, P<0,05). L'analisi della curva ROC ha indicato che IFN-γ ha una sensibilità diagnostica del 64,00% e una specificità dell'86,00% per ATB (AUC=0,803, P<0,001), mentre CD64 ha mostr...
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Questo studio propone un quadro diagnostico e prognostico integrato a doppio biomarcatore che combina IFN-γ sirico (un marcatore dell'immunità adattiva delle cellule T) e il neutrofilo CD64 (un marcatore di attivazione immunitaria innata) per l'ATB in pazienti anziani immunocompromessi, una popolazione ad alto rischio con esigenze cliniche non soddisfatte per test accurati e non invasivi per la tubercolosi. La gestione dell'ATB è complicata dalla sua natura infettiva e dal potenziale di ...
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Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Analizzatore biochimico automatico AU5800 | Beckman Coulter | B04077 | Uno strumento usato per rilevare e analizzare le sostanze chimiche della vita. |
| CD14-APC | Agilent | 8730057 | Un anticorpo marcato fluorescentmente per la citometria di flusso che riconosce specificamente l'antigene CD14. |
| CD16-FITC | Agilent | 8920064 | Un anticorpo marcato fluorescente per la citometria di flusso che riconosce specificamente l'antigene CD16. |
| CD64-PE | Agilent | 8730119 | Un anticorpo marcato fluorescentmente per la citometria di flusso che riconosce specificamente l'antigene CD64. |
| Citometria di flusso CytoFLEX LX | Beckman Coulter | C00445 | Un analizzatore cellulare che misura l'intensità di fluorescenza dei marcatori cellulari colorati. |
| IFN-γ Kit ELISA | Wuhan Jilid Biotechnology Co., LTD | J20272 | Uno strumento basato sul saggio sandwich a doppio anticorpo per la rilevazione di IFN-& gamma; concentrazioni. |
| Mezzo L-J | Shandong Topu Biological Engineering Co., LTD | M1607 | Un mezzo utilizzato per l'isolamento e la coltura di micobatteri come Mycobacterium tuberculosis. |
| PASS | NCSS | v.15.0 | Un software per supportare analisi di potenza e calcoli delle dimensioni del campione. |
| SPSS | IBM | v.30.0 | Un software per l'elaborazione dati, l'analisi e la visualizzazione dei dati. |
| Analizzatore di sedimentazione degli eritrociti XS-1000i | Sysmex | V147451 | Un dispositivo medico utilizzato per esami clinici del sangue. |