Articolo di ricerca
È stato sviluppato un approccio robusto e riproducibile per stabilire colture primarie 2D di cellule arricchite di zona glomerulosa e zona fascicolata, per la corteccia surrenale del muro. Questo sistema preserva le caratteristiche molecolari e funzionali chiave di ciascuna zona, consentendo un'indagine mirata delle vie di segnalazione, della produzione ormonale e del comportamento delle cellule corticali surrenali ex vivo.
La ghiandola surrenale del topo è incapsulata da uno strato cellulare mesenchimale (capsula) e contiene una corteccia sottostante organizzata in zone concentriche distinte con funzioni endocrine specializzate: la zona glomerulosa (zG), che produce aldosterone, e la zona fascicolata (zF), che produce corticosterone. La midolla surrenale, situata al centro della ghiandola, produce catecolamine. Gli studi meccanicistici sulle cellule di ciascuna zona adrenocorticale sono stati limitati dall'assenza di modelli in vitro che preservino le loro caratteristiche molecolari, cellulari e funzionali specifiche per zona. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato un approccio di frazionamento utilizzando la microdissezione delle ghiandole surrenali adulte del topo. Questo metodo separa le cellule surrenali dai topi maschi in una frazione esterna arricchita di zG (OF), contenente cellule capsula e zG, e una frazione interna arricchita di zF (IF), che contiene zF e cellule midollari. Queste frazioni sono state utilizzate per generare colture primarie bidimensionali (2D) arricchite per cellule zG o zF. L'analisi dell'espressione genica ha confermato che le colture arricchite con zG esprimono alti livelli di marcatori zG (Cyp11b2, Dab2 e Shh), insieme a un aumento dei marcatori delle vie Wnt/β-catenina (Wnt4, Lef1). Al contrario, le colture arricchite con zF hanno mostrato un'espressione più elevata dei marcatori zF (Cyp11b1 e Akr1b7) e livelli più bassi di marcatori della via Wnt/β-catenina, coerenti con una firma trascrizionale zF. L'espressione di marcatori steroidogeni (Nr5a1, Star) ha convalidato l'origine adrenocorticale di entrambe le frazioni cellulari. La tirosina idrossilasi indica la presenza di cellule medullari surrenali in colture arricchite da zF. Dal punto di vista funzionale, le colture arricchite con zG hanno prodotto aldosterone in condizioni basale e hanno mostrato una produzione aumentata in risposta all'angiotensina II, al potassio e all'ormone adrenocorticotropico (ACTH). Al contrario, le colture arricchite con zF hanno prodotto corticosterone al punto di partenza e hanno mostrato un aumento della produzione in risposta alla stimolazione ACTH. Nel complesso, questo protocollo rappresenta un modello in vitro robusto, riproducibile e biologicamente rilevante per lo studio della biologia della corteccia surrenale. Questo sistema consente l'indagine specifica per zona dei percorsi di segnalazione, dei meccanismi molecolari e delle risposte fisiologiche.
Una sottile capsula mesenchimale racchiude la ghiandola surrenale del topo, che è composta da due compartimenti principali: la corteccia esterna e il midollo interno. La corteccia surrenale del maschio adulto è ulteriormente suddivisa in zone distinte, la zona glomerulosa (zG) e la zona fascicolata (zF), ciascuna con caratteristiche morfologiche e funzionaliuniche 1,2,3,4. La funzione principale della corteccia surrenale è la produzione di ormoni steroidei, inclusi mineralocorticoidi (aldosterone) e glucocorticoidi (corticosterone nei topi)5. Lo zG è la regione più esterna e compatta ed è costituito da cellule ovoidali organizzate in strutture a rosetta che esprimono aldosterone sintasi (CYP11B2), permettendo la produzione di aldosterone 2,3,5,6,7. La secrezione di aldosterone è regolata principalmente dal sistema renina-angiotensina-aldosterone (RAAS), dal potassio e, in misura minore, da ACTH 5,8. La zF è composta da cellule più grandi disposte in cordoni radiali/fascicoli, costituisce la maggioranza (~85%) della corteccia ed è regolata principalmente da ACTH 2,3,5,9. Molteplici vie di segnalazione orchestrano lo sviluppo, il mantenimento e la funzione delle ghiandole surrenali regolando la dinamica delle cellule progenitrici, la zonazione e l'attività steroidogenica. Tra questi, SF-1 (Fattore Steroidogenico-1, Nr5a1) è un regolatore principale essenziale per la specificazione adrenocorticale, la proliferazione e la produzioneormonale 10. La segnalazione sonica di riccio (Shh), attiva nello zG, favorisce l'espansione delle cellule progenitrici e supporta il rinnovo corticale nellozG 11,12,13.
La segnalazione Wnt, in particolare attraverso la via canonica β-catenina, è cruciale per la zonazione surrenale e l'integrità corticale. Nel topo, la dimensione e la zonazione normali del sistema adrenocorticale sono regolate da un gradiente di attività di segnalazione WNT che si estende dalla capsula allo zF. Questo gradiente è supportato dall'espressione localizzata di liganti e potentiatori WNT, principalmente WNT4 nello zG, e WNT2B e R-spondine (RSPO1 e/o RSPO3) nella capsula 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . La corteccia surrenale è mantenuta dal flusso centripetale delle cellule progenitrici proliferative situate nella regione subcapsulare/esterna zG, che danno origine a cellule zG differenziate che migrano verso l'interno verso lo zF. Man mano che le cellule passano dallo zG allo zF, subiscono cambiamenti nell'espressione e nella funzione genica chiamati trans-differenziazione. Questo modello è stato fortemente supportato da studi di tracciamento della linea di lineamento utilizzando la linea di topi transgenicaAS Cre/+, che mira specificamente alle cellule produttrici di aldosterone negli zG 23,24,25.
Sono stati utilizzati diversi approcci in vitro per studiare la biologia surrenale basati sulla dissociazione dell'intera ghiandolasurrenale 26,27,28. Ad esempio, uno studio ha descritto la dissociazione della corteccia surrenale per analisi elettrofisiologiche epatch-clamp 27, e un altro studio ha utilizzato cellule corticali surrenali dissociate per indagare i meccanismi di segnalazione legati alla fisiologia surrenale e alla regolazione della pressionesanguigna 26. Sebbene queste metodologie abbiano fornito importanti intuizioni funzionali, si basano su cellule provenienti da preparazioni surrenali intere piuttosto che sulla separazione delle zone corticali prima della coltura cellulare.
Data la complessità e la diversità istologica della ghiandola surrenale, comprendere i ruoli distinti dei suoi compartimenti cellulari è essenziale per chiarire i meccanismi alla base della funzione surrenale. In questo studio sono state stabilite colture cellulari adrenocorticali primarie di topo arricchite per cellule zG o zF. Un grande vantaggio di questo metodo è la generazione di colture cellulari arricchite di zG, che consente la modulazione sperimentale delle vie di segnalazione e dei fattori ambientali per approfondire meglio il suo ruolo specifico nella biologia della corteccia surrenale. Ciò include lo studio della manutenzione delle cellule progenitrici, i meccanismi alla base della plasticità zonale e della trans-differenziazione verso lo zF, e la modellazione della composizione della matrice extracellulare. Parallelamente, questo metodo genera colture di cellule zF altamente arricchite, fornendo una piattaforma complementare per studi funzionali e di segnalazione specifici per zona. Insieme, queste caratteristiche forniscono un sistema robusto e sperimentalmente controllato per far avanzare la comprensione della biologia surrenale.
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Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo i protocolli approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali del Boston Children's Hospital (IACUC) con il numero di approvazione 00002611. Un elenco completo di tutti i materiali utilizzati in questo protocollo, inclusi reagenti, consumabili e attrezzature, è fornito nella Tabella dei Materiali, insieme ai corrispondenti produttori e numeri di catalogo per garantirne la riproducibilità.
Colture primarie di cellule della zona glomerulosa e della zona fascicolata del topo
I metodi utilizzati per stabilire colture primarie di maschi adulti di cellule adrenocorticali di tipo selvatico (Mus musculus, C57BL/6) in questo studio sono stati adattati da una procedura originariamente sviluppata per rattiSprague-Dawley 28. Per confermare la segregazione e l'identità delle popolazioni cellulari di zona glomerulosa e zona fascicolata, è stato utilizzato un modello di tracciamento della linea utilizzando topi Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (noti anche come Cre) 1,2,3,4 e topi Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (noti anche come ROSAmT/mG)29.
Preparazione prima della procedura
Materiali
Due set di pinze e forbici per incisioni superficiali e un altro set per l'incisione della cavità addominale (Figura supplementare 1A). Riscaldato il mezzo di coltura e il PBS (37 °C). Ho preparato 2 piatti (P60) con DMEM/F-12. Preparato 3 piatti (P60) con PBS riscaldato per lavare le ghiandole in sequenza (bagno 1, 2 e 3) (Figure supplementari 1B, 1–3), e 1 piatto per mantenere l'surrenale in soluzione (Figure supplementari 1B, 4). Preparato 2 piatti (P60) con carta filtrante sterile sulla superficie (Figure supplementari 1C, 1–2). Preparato 2 piatti P60 con 500 μL di soluzione digertiva e etichettati per la glomerulosa (zG) o la fascicola (zF) (Figure supplementari 1D, zG, zF). Ho preparato 2 tube, etichettato zG e zF, e aggiunto 4,5 mL di soluzione digertiva.
Soluzioni
Per preparare la soluzione digertiva, la collagenasi di tipo I (concentrazione finale 4 mg/mL) e la DNasi I (concentrazione finale 0,04 mg/mL) sono state sciolte in 5 mL di mezzo puro DMEM/F-12. Ho filtrato la soluzione in un tubo da 50 mL usando una siringa e un filtro da 0,22 μM. La soluzione digerente dovrebbe essere preparata fresca ogni volta.
Animali
Per ottenere colture primarie arricchite per cellule surrenali zonae glomerulosa e zona fascicolata, si utilizzano 10–15 maschi giovani adulti, di circa 6–7 settimane di età. Le femmine hanno ghiandole surrenali leggermente più grandi rispetto ai maschi, e con questo protocollo può essere utilizzato entrambi i sessi. Tuttavia, in questo studio, sono stati utilizzati solo maschi per evitare potenziali interferenze dalla zona X presente nelle giovani femmine, garantendo una precisa separazione zonale. I topi sono stati eutanasiati per inalazione di CO₂ in conformità con le linee guida istituzionali per la cura degli animali. La morte è stata confermata dall'assenza di respirazione e dalla mancanza di risposta riflessa. Le ghiandole surrenali sono state sezionate immediatamente, entro 3–5 minuti dalla conferma della morte, per preservare la vitalità del tessuto.
Posizione ed esposizione dell'addome
Il topo è stato posizionato in una posizione decubito dorsale su una superficie sterile e piatta (Figura 1A). Il pelo dell'animale è stato disinfettato con alcol al 70%. Forces e forbici sono state utilizzate per le incisioni cutanee, e il secondo set per l'incisione della cavità addominale. Fu effettuata una prima incisione nella regione inguinale dell'addome, che si estendeva lateralmente verso il torace su entrambi i lati per esporre il peritoneo (Figura 1B). La pelle è stata accuratamente retrata, seguita dalla muscolatura addominale, per esporre la cavità addominale (Figura 1C). L'incisione iniziale dovrebbe essere superficiale per evitare danni agli organi interni. Avanza verso lo strato muscolare con un'incisione prudente, poi esponi la cavità addominale. Evita la rottura dei vasi sanguigni, poiché il sanguinamento può rendere difficile localizzare le ghiandole surrenali e ritardare la raccolta. Cambia gli strumenti chirurgici per minimizzare la contaminazione microbica.
Identificazione e raccolta della ghiandola surrenale sinistra
La ghiandola surrenale sinistra si trova medialmente e superiore al rene sinistro nel retroperitoneo, con forma ovale e colorazione rosa, circondata da tessuto adiposo bianco (Figure 1D–G). Mentre si spostano con attenzione gli organi adiacenti con forze smussate per migliorare la visualizzazione, si utilizzano forbici per rimuovere la maggior parte del tessuto adiposo tramite tagli brevi e controllati, isolando la ghiandola surrenale. Evita di afferrare direttamente la ghiandola surrenale per evitare danni alla sua capsula. La ghiandola è stata posta immediatamente dopo l'isolamento in un piatto di coltura P60 con 10 mL di DMEM/F-12 preriscaldato a 37 °C (Figura 1F).
Identificazione e raccolta della ghiandola surrenale destra
La ghiandola surrenale destra si trova lateralmente e superiore al rene destro nel retroperitoneo, con forma ovale e colorazione rosa (Figure 1E–H). Identificare questa ghiandola surrenale può essere più difficile a causa della sua vicinanza ad altri organi, come il fegato e il colon ascendente, oltre che ai vasi sanguigni vicini. Mentre si spostano con attenzione gli organi adiacenti con pinze smussate per migliorare la visualizzazione, si usano forbici per rimuovere la maggior parte del tessuto adiposo tramite tagli brevi e controllati, isolando la ghiandola surrenale e facendo attenzione a non danneggiare la capsula. La ghiandola è stata posta immediatamente dopo l'isolamento in una piastra di coltura P60 con 10 mL di DMEM/F-12 preriscaldato a 37 °C. Le surrenali sono combinate nello stesso piatto (Figura 1F). Durante la procedura, è fondamentale maneggiare con attenzione i principali vasi sanguigni dell'area per evitare tagli accidentali, che possono causare sanguinamento e complicare il processo di prelievo. I principali vasi di cui prestare attenzione includono le vene renali e le arterie renali. Ho raccolto la ghiandola surrenale con un po' di tessuto adiposo aderente. Questo facilita la gestione della ghiandola e protegge da danni e contaminazioni della capsula (Figura 1I).
Lavoro in una cappa a flusso laminare sterile
Prima di trasferire le ghiandole nella cappa a flusso laminare, il piatto veniva pulito con alcol al 70%. Le surrenali sono state lavate tre volte con PBS a temperatura ambiente (25 °C) (nelle piastre 1, 2 e 3 e raccolte nella tavola 4) (Figura supplementare 1B). La carta filtro aiuta con l'adesione del grasso e garantisce risultati migliori. Durante la preparazione di più ghiandole, i tessuti separati devono essere mantenuti in DMEM preriscaldato per preservare la vitalità. La ghiandola surrenale veniva afferrata dal tessuto adiposo aderente (Figure 1I–J) e il grasso veniva accuratamente dissezionato sulla carta filtrante (Figura supplementare 1C, piatto 1), utilizzando pinze fini e movimenti controllati per evitare di danneggiare la capsula. Il risultato atteso è una ghiandola liscia, intatta, priva di eccesso di tessuto adiposo e connettivo, come mostrato nella Figura 1K. Le ghiandole surrenali sono state trasferite con cura su carta filtro nuova (Figura supplementare 1C, piatto 2) per facilitare una microdissezione precisa. La capsula è stata delicatamente pizzicata con pinze sottili e, utilizzando la lama del bisturi, è stata praticata un'incisione radiale nella ghiandola senza aver completamente interrotto il tessuto.
Il contenuto interno della corteccia veniva delicatamente esposto espellendolo verso l'esterno attraverso l'incisione, applicando una leggera pressione meccanica con la pinza. La capsula e lo zG rimasero collegati alla punta della pinza, mentre il materiale ghiandolare espulso interno corrispondeva allo zF e al midollo. La digestione enzimatica dovrebbe essere avviata solo dopo che tutte le ghiandole sono state processate (Figura 1L), a causa della separazione meccanica delle zone esterna e interna.
Digestione
Due tubi erano etichettati come OF (Frazione Esterna: capsula e zG) o IF (Frazione Interna: zF e midolla) (Figura 1M). Sono stati aggiunti in totale 4,5 mL di soluzione digertiva preriscaldata (37 °C), e OF e IF sono stati trasferiti ai tubi appropriati. I campioni sono stati incubati a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂ per 30 minuti, e i tubi sono stati lentamente roteati ogni 10 minuti, invertendoli manualmente 2–3 volte per garantire un'esposizione uniforme alla soluzione enzimatica. Il tempo necessario per la digestione può variare a seconda della qualità, dell'attività e delle condizioni di conservazione della collagenase. Dopo 30 minuti, il tessuto veniva dissociato pipettando su e giù 40 volte con movimenti lenti e controllati, utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL per generare una singola suspense cellulare. Dopo la dissociazione del tessuto, idealmente non dovrebbero rimanere frammenti visibili e il mezzo dovrebbe apparire torbido. Se i frammenti sono ancora presenti, si può considerare una digestione aggiuntiva di 15 minuti.
Lavaggio e placcatura
Dopo la digestione, le cellule sono state lavate aggiungendo 45 mL di DMEM/F-12 per rimuovere l'enzima residuo (Figura 1 M). I campioni sono stati centrifugati a 150 × g per 12 minuti a temperatura ambiente (25 °C). Dopo la centrifugazione, si prevede un pellet piccolo e compatto con un aspetto leggermente rosato o giallo pallido, mentre il surnatante dovrebbe rimanere trasparente e privo di particelle visibili. Il soprantantante fu rimosso con cura e scartato, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Il pellet è stato risospeso in un mezzo di coltura preriscaldato (37 °C) secondo il volume finale richiesto per la placcatura (vedi sotto). È stata mantenuta una densità ottimale di corazzatura di circa il 70% per garantire la vitalità e la vitalità della coltura. Il numero di cellule è stato stimato utilizzando una camera di conteggio di Neubauer prima della placcatura, e il numero di cellule seminate è stato regolato in base all'area della ciotola di coltura per ottenere la confluenza desiderata. Placca le cellule della frazione esterna arricchite con zG (OF) a una densità di circa un animale per pozzo (tipicamente producendo ~1,5–2,5 × 104 cellule) e le cellule della frazione interna arricchite con zF a ~0,63 animali per pozzo (tipicamente producendo ~2,5–4,0 × 104 celle) in una piastra a 48 pozzi.
Manutenzione della coltura cellulare
Le cellule sono state coltivate nel Mezzo di Coltura descritto sopra e mantenute in condizioni standard in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂. Dopo 24 ore di coltura, il substrato è stato sostituito per rimuovere detriti e eventuali cellule sanguigne residue. Questo passaggio favorisce una crescita ottimale. La piastra veniva aspirata con cura e veniva aggiunto un mezzo fresco preriscaldato (37 °C). Attendi almeno 48 ore prima di valutare le cellule negli esperimenti funzionali. Si consiglia di attendere tre giorni prima di eseguire esperimenti funzionali per assicurarsi che le colture siano ben consolidate. Una coltura prolungata oltre questo periodo può richiedere tripsinizzazione e passaggio, il che può portare alla selezione cellulare e alla perdita delle caratteristiche primarie della coltura.
Analisi dei dati e procedure di supporto
Preparazione delle colture primarie di cellule surrenali
Colture primarie di ghiandole surrenali intere sono state stabilite seguendo le stesse procedure per la raccolta dei tessuti, la digestione, il lavaggio e la placcatura dei tessuti, e sono state utilizzate come controlli standard per saghi molecolari e funzionali.
Analisi dell'espressione genica
Per purificare l'RNA totale delle cellule OF e IF, le cellule coltivate sono state omogeneizzate in TRIReagent utilizzando il kit RNA, secondo il protocollo del produttore. L'integrità e la concentrazione dell'RNA sono state valutate tramite spettrometria. L'ulteriore elaborazione dell'RNA totale comportava la trascrizione inversa in cDNA utilizzando il kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità. L'analisi dell'espressione genica è stata effettuata tramite PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) utilizzando il termociclatore. Sono stati utilizzati duplicati tecnici per controllare la variabilità. Furono utilizzati il TaqMan Universal PCR Master Mix e i primer TaqMan per mouse (Tabella 1). Un valore di soglia di ciclo (CT) è stato selezionato all'interno dell'intervallo di amplificazione lineare per ogni campione eseguito in duplicato. È stato normalizzato dai geni di controllo endogeni β-actin e dalla proteina ribosomica 18S (Rps18). I livelli di espressione relativa sono stati calcolati utilizzando il metodo 2–ΔΔCt 30. I dati di tre diversi esperimenti sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Abbiamo condotto tre esperimenti indipendenti.
Stimolazione della secrezione di aldosterone e corticosterone nelle colture primarie ZG e ZF
Colture primarie di cellule della zona glomerulosa (ZG) e della zona fascicolata (ZF) sono state stabilite e mantenute a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Circa 5 × 104 cellule sono state placcate per pozzo in una piastra da 48 pozzi utilizzando un mezzo di crescita completo. Dopo quattro giorni di coltura continua, le misurazioni della secrezione basale hanno riflettuto la produzione cumulativa di ormoni in questo periodo. Per i saggi di stimolazione, il mezzo veniva aspirato e le cellule venivano lavate una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere i fattori residui. Successivamente, sono stati aggiunti 200 μL di mezzo fresco a ciascun pozzo, e i seguenti saghi rappresentano secrezioni stimolate acute entro una finestra temporale definita. Per i saggi di stimolazione con aldosterone, il mezzo di coltura è stato integrato con angiotensina II (Ang II, 10 nM), potassio (K+), cloruro di potassio (KCl, 10 mM) e ACTH (10 nM). Il cloruro di sodio (NaCl, 10 mM) veniva utilizzato come controllo del veicolo. Per i saggi di stimolazione con corticosterone, sono state seguite le stesse procedure, ma il mezzo è stato integrato con ACTH (10 nM), forskolina (10 μM) o NaCl (10 mM) come controllo del veicolo. Dopo 6 ore di incubazione a 37 °C e 5% di CO₂, i soprannatanti della coltura sono stati raccolti e conservati a −80 °C per la successiva quantificazione ormonale, come descritto inprecedenza 31. Le cellule aderenti rimanenti sono state lisate per l'estrazione proteica e i livelli ormonali sono stati normalizzati al contenuto proteico totale del corrispondente lisseto.
Estrazione proteica e normalizzazione delle misurazioni di aldosterone e corticosterone
L'estrazione proteica è stata effettuata utilizzando la lisi e il buffer di estrazione RIPA, integrati con un cocktail inibitore della proteasi 1x stop. Le celle venivano risospese pipettando su e giù 15 volte con una punta di pipetta P200 e successivamente sonicate con un sondatore a sonda. La concentrazione proteica è stata determinata con il kit di analisi proteica BCA secondo le istruzioni del produttore.
Misurazione dell'aldosterone tramite radioimmunosaggio (RIA)
La concentrazione di aldosterone nei supernattivi delle colture cellulari è stata determinata seguendo il protocollo del produttore. In breve, sono stati aggiunti 50 μL di soprantantante e 150 μL di BSA all'1% nel PBS, insieme a 500 μL del tracciatore radioattivo aldosterone, ai tubi rivestiti di anticorpi aldosterone. Dopo la miscelazione, i tubi venivano incubati a temperatura ambiente (25 °C) per 18 ore. Successivamente, la miscela di incubazione veniva decantata e la radioattività nei tubi veniva conteggiata utilizzando un contatore auto-gamma CobraII 31. I livelli di aldosterone sono stati normalizzati a proteine totali, come descritto in precedenza.
Misurazione del corticosterone
Le concentrazioni di corticosterone nei supernatanti di colture cellulari sono state misurate utilizzando un kit ELISA (immunosorbente legato a enzimi competitivi) specifico per corticosterone su topi e ratti, seguendo il protocollo del produttore. I livelli di corticosterone sono stati normalizzati a proteine totali, come descritto inprecedenza 32.
Immunocolorazione
L'immunofluorescenza è stata eseguita sia su sezioni surrenali immerse in paraffina sia su cellule coltivate su vetri pretrattati rivestiti con poli-L-lisina. Per tutti i campioni, è stata effettuata una bloccatura con siero di capra normale (NGS) al 5% in PBS, e i nuclei sono stati controcolorati con DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindolo, 1:1000). Vetri e copertine sono stati lavati tre volte per 5 minuti ciascuno con lo 0,1% Tween-20 in PBS tra una fase di incubazione e l'altra. Dopo la colorazione, i campioni venivano montati con Antifade Mountant e conservati al buio fino all'acquisizione di imagin. Sezioni tissutali: Sezioni di paraffina surrenale sono state deparafinizzate nello xilene, poi risciacquate attraverso una serie di etanolo gradato (100%, 95%, 70%) e infine risciacquate in PBS. Il prelievo dell'antigene è stato effettuato nel tampone Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9,0) riscaldando a 95 °C per 20 minuti. Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, le sezioni sono state lavate in PBS e bloccate con il 5% di NGS in PBS per 1 ora. I sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con i seguenti anticorpi primari diluiti 1:100 in 5% NGS in PBS: anti-Dab2 del topo, anti-GFP del pollo e anti-RFP per conigli. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi secondari (1:300): Alexa Fluor 594 anti-topo IgG, Alexa Fluor 594 anti-chicken IgY e Alexa Fluor 647 anti-coniglio per capra.
Cellule coltivate: l'immunofluorescenza sui coverslip è stata eseguita quattro giorni dopo la placcatura. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide (PFA) al 4% preriscaldato a 37 °C per 15 minuti e lavate tre volte in PBS. La bloccatura è stata eseguita utilizzando il 5% di NGS in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. I coverslip sono stati incubati durante la notte a 4 °C con anti-Dab2 per topi (1:100 in 5% NGS/PBS), seguiti da Alexa Fluor 488 anti-topo (1:500).
Acquisizione dell'immagine: Immagini in campo chiaro e fluorescenza (mGFP e mTomato) di cellule colte sono state acquisite utilizzando un sistema microscopico. La fluorescenza mGFP è stata catturata utilizzando un set di filtri per fluorescenza verde (eccitazione: 470 nM, emissione: 525 nM), e la fluorescenza mTomato è stata catturata utilizzando un set di filtri per fluorescenza rossa (eccitazione: 585 nM, emissione: 624 nM).
Software e analisi statistica
Riassunti visivi, diagrammi schematici e figure sono stati creati utilizzando Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) e BioRender (https://www.biorender.com), consultati a maggio 2025. I dati sono stati analizzati utilizzando GraphPad Prism versione 10.0. Disponibile a: https://www.graphpad.com. Tutti gli esperimenti sono stati condotti almeno in triplicata e ripetuti indipendentemente per garantire la riproducibilità dei risultati. Per i confronti tra due gruppi, è stato utilizzato il test t di Student (accoppiato o non accoppiato, a seconda dei criteri). Per i confronti che coinvolgono tre o più gruppi, è stata eseguita l'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc appropriato per identificare differenze significative tra i gruppi. I risultati sono presentati come media ± SD. Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Stabilimento e caratterizzazione di colture cellulari surrenali primarie arricchite in zone
Colture primarie di cellule surrenali sono state stabilite con successo dall'OF, arricchite per le cellule zG, e dall'IF, arricchite per le cellule zF. Immagini rappresentative delle cellule coltivate sono mostrate nella Figura 2A (OF–zG) e nella Figura 2B (IF–zF). Per valutare l'arricchimento delle cellule zG e non zG...
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In questo studio è stato presentato un protocollo raffinato che genera colture primarie di cellule surrenali di muro arricchite per cellule zG (OF) e zF (IF), che riproducono fedelmente l'identità zonale e la funzione steroidogenica di ciascuna zona. Questo protocollo dovrebbe consentire un'indagine dettagliata della biologia cellulare e molecolare della corteccia surrenale in un contesto specifico per zona, supportando lo studio di proteine, vie di segnalazione e meccanismi coinvolti ne...
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti legati a questo studio.
Questo lavoro è stato supportato da FAPESP (Fondazione di Ricerca di San Paolo, Brasile), progetto numero 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), e dal supporto di 2R01DK123694 (a DTB) e fondi dalla Divisione di Endocrinologia del Boston Children's Hospital (DTB).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Conical Tube (50 mL ) | Corning (Corning, NY, USA) | 352070 | Sterile |
| 0.22 µm Syringe Filter | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | SLGV033RS | Filtrazione della soluzione di digestione |
| 10 mL Disposable Syringe | BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA) | 300912 | Sterile |
| 5 mL Serological Pipette | Corning (Corning, NY, USA) | 4487 | Sterile |
| 10 mL Serological Pipette | Corning (Corning, NY, USA) | 4488 | Sterile |
| Filtered Pipette Tips (P200) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-200-R-S | Sterile |
| Filtered Pipette Tips (P1000) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-1000-R-S | Sterile |
| P60 Culture Dish | Corning (Corning, NY, USA) | 430166 | Trattati per la cultura dei tessuti |
| 48-well Plate | Corning (Corning, NY, USA) | 3527 | Trattati per la cultura dei tessuti |
| Sterile Filter Paper | N/A | N/A | Rimozione del grasso e supporto per la dissezione |
| DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 11320033 | Formulazione 1:1 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10082147 | Heat-inactivated |
| ITS Supplement | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 41400045 | 100X |
| GlutaMAX Supplement | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 35050061 | 100X |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 15140122 | Antibiotico |
| PBS 1X | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10010023 | pH 7.4 |
| Collagenase Type I | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 17100-017 | Digestione dei tessuti |
| DNase I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | DN25-1 | Digestione dei tessuti |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A9525 | Stimolazione ormonale |
| Adrenocorticotropic Hormone (ACTH) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A0298 | Stimolazione ormonale |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | F6886 | Stimolazione cAMP |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P9541 | Stimolazione aldosterone |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S7653 | Controllo del veicolo |
| Small Surgical Scissors | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 14060-09 | Dissezione |
| Scalpel with Disposable Blade | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 10003-12 | Microdissezione |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11252-00 | Dissezione |
| Curved Forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11251-10 | Dissezione |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Elaborazione sterile del tessuto |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Coltura cellulare |
| Centrifuge | Eppendorf (Hamburg, Germany) | N/A | Pellettizzazione delle cellule |
| Neubauer Counting Chamber | Hausser Scientific (Horsham, PA, USA) | 1490 | Conteggio delle cellule |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 89901 | Estrazione delle proteine |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 87786 | Estrazione delle proteine |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | FB120 | Sonicazione |
| RIA System | Tecan (Männedorf, Switzerland) | MG13051 | Quantificazione degli ormoni |
| Cobra II Auto-Gamma Counter | Berthold Technologies (Bad Wildbad, Germany) | N/A | Misurazione della radioattività |
| Corticosterone ELISA Kit (96-well) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 55-CORMS-E01 | Misurazione degli ormoni |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | P36930 | Medium di montaggio |
| Mouse anti-Dab2 | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 610464 | Anticorpo primario |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs (Tigard, OR, USA) | GFP-1020 | Anticorpo primario |
| Rabbit anti-RFP | Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA) | 600-401-379 | Anticorpo primario |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Mouse | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11005 | Anticorpo secondario |
| Alexa Fluor 594 Goat anti-Chicken | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11042 | Anticorpo secondario |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-Rabbit | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-21244 | Anticorpo secondario |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | A-11001 | Anticorpo secondario |
| EVOS Microscope System | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Imaging |
| TRI Reagent | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T9424 | Estrazione dell'RNA |
| Direct-zol RNA Kit | Zymo Research (Irvine, CA, USA) | R2050 | Purificazione dell'RNA |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-1000 | Quantificazione dell'RNA |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4304437 | qPCR |
| QuantStudio 6 Flex Thermocycler | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | N/A | qPCR |
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