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Articolo metodologico

Un nuovo sistema di coltura 2D e 3D senza siero che comprende due piccole molecole per la coltivazione delle cellule epiteliali delle ghiandole lacrimali del topo

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DOI:

10.3791/70438

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10 febbraio 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

In questo articolo

Sommario

Viene introdotto un nuovo sistema di coltura senza siero che utilizza la combinazione di piccole molecole 2C (Y27632 e SB431542) per espandere efficacemente le cellule epiteliali delle ghiandole lacrimali (LGEC) sia in colture 2D che 3D, consentendo un controllo preciso della loro proliferazione e differenziazione.

Abstract

La disfunzione delle ghiandole lacrimali (LG) è una delle principali cause della malattia oculare secca carente di acqua, e le terapie cellulari e di ingegneria tissutale mostrano un potenziale significativo per questa condizione. Tuttavia, la limitata disponibilità di cellule semi sufficienti coltivate in condizioni prive di siero ha ostacolato la loro ampia applicazione. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di coltura senza siero utilizzando due piccole molecole, Y27632 e SB431542 (2C), per espandere efficacemente le cellule epiteliali LG (LGEC). Per la coltura primaria 2D delle LGEC, le LG sono state isolate da topi di 6-8 settimane e digerite enzimaticamente utilizzando Dispase II e Collagenasi A. La sospensione cellulare risultante è stata seminata in vasche di coltura a una densità di 7.500 cellule/cm2 e coltivata con 2C per 12-14 giorni. Quando la confluenza cellulare ha raggiunto l'80-90%, la sottocoltura è stata avviata con un rapporto 1:2. Per la coltura 3D, 10.000 LGEC P1 sono stati risospesi in 10 μL di 2C e 10 μL di gel a matrice, quindi seminati al centro di una piastra a 24 pozzi. Dopo un periodo di solidificazione di 30 minuti a 37 °C, sono stati aggiunti 600 μL di 2C per la coltivazione continua. Per differenziazione, gli sferoidi 3D sono stati coltivati con 2C per 7 giorni, seguiti dalla rimozione di 2C e dalla coltura continua per altri 7 giorni. I LGEC coltivati con 2C hanno mostrato un'elevata proliferazione, con un'elevata espressione di stelo e marcatori di proliferazione (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014, rispettivamente]), e hanno mantenuto morfologia e capacità proliferativa anche dopo dieci passaggi. Inoltre, in condizioni 3D, le LGEC formavano sferoidi con caratteristiche stelo/progenitore, che si differenziavano ulteriormente in strutture microghiandolari contenenti molteplici tipi cellulari LG (AQP5, K19, α-SMA-positive) e funzioni secretorie mature dopo la rimozione del 2C. Questo approccio dovrebbe fornire una fonte stabile di cellule seme per l'ingegneria tissutale e offre un nuovo modello in vitro per studiare la fisiologia LG.

Introduzione

La ghiandola lacrimale (LG) è essenziale per produrre lo strato acquoso della pellicola lacrimale, fondamentale per mantenere l'omeostasi della superficieoculare 1. La disfunzione della LG, causata da lesioni o infiammazione, porta alla malattia dell'occhio secco carente di acqua (ADDE). Questa condizione può portare a una grave infiammazione della superficie oculare, malattie croniche della cornea e, nei casi gravi, perdita permanente della vista2. I trattamenti attuali per l'ADDE gestiscono principalmente i sintomi, senza affrontare la disfunzione ghiandolare sottostante, che ne limita l'efficaciaa lungo termine 1. Lo sviluppo di terapie mirate per la disfunzione LG presenta diverse sfide, tra cui la mancanza di modelli in vitro semplici e a lungo termine, che limitano la comprensione della fisiopatologia LG e ostacolano lo sviluppo di terapie efficaci. Sebbene il trapianto cellulare abbia dimostrato potenziale nel promuovere la rigenerazione LG, la limitata capacità di espansione delle cellule in vitro e la complessità dei sistemi di coltura esistenti rappresentano ostacoli significativi all'applicazioneclinica 1,3. Pertanto, stabilire un sistema di coltura semplice e a lungo termine per LG adulti di topo è essenziale per far avanzare la comprensione della fisiologia e patologia LG, oltre a fornire una fonte affidabile di cellule stemminali/progenitrici LG per la riparazione e la rigenerazione delle lesioni LG.

I sistemi di coltura in vitro esistenti per LG hanno fatto progressi significativi, ma affrontano ancora limitazioni notevoli. Molti di questi metodi si basano su mezzi integrati con siero, che introducono diversi problemi come la variabilità da batch a lotto, componenti indefiniti e il rischio di contaminazione da fibroblasti o cellulemesenchimali 4,5,6,7,8. Inoltre, i sistemi a base di siero non sono adatti allo studio dei meccanismi patogeni delle malattie LG e rappresentano sfide per le terapie di trapianto cellulare a causa dei potenziali rischi di rigettoimmunitario 9. In risposta a queste limitazioni, sono stati sviluppati diversi metodi senza siero per la coltivazione di cellule epiteliali LG (LGEC) sia da topi che da uomini. Ad esempio, Ueda et al. hanno adottato con successo un metodo senza siero per coltivare LGEC da topineonati 10. Tuttavia, questo metodo era limitato dall'impossibilità di far passare le cellule attraverso le sottocolture e dalla necessità di un gran numero di ghiandole neonatali per ottenere sufficienti LGEC. Analogamente, Kobayashi et al. svilupparono un sistema di coltura senza siero con la tossina del colera, ma incontrarono difficoltà nel mantenere la morfologia cellulare durante il passaggio11. Tra i progressi recenti figurano lo sviluppo da parte di Zhang et al. di un sistema di coltura 3D per cellule staminali LG topi e il sistema di coltura organoide LG di Bannier-Hélaouët et al. sia per topi che per esseriumani 12,13,14,15. Tuttavia, questi sistemi si basano su formulazioni di mezzi complessi con molteplici piccole molecole, fattori di crescita e additivi, complicando il processo di coltura e limitando la scalabilità. Queste sfide evidenziano la necessità di un sistema di coltura semplificato ed efficace senza siero che possa facilitare l'espansione efficiente delle LGEC, mantenendo al contempo le loro caratteristiche proliferative e di stelo/progenitore per ulteriori applicazioni terapeutiche e ricerca.

Negli ultimi anni, lo sviluppo rapido della riprogrammazione chimica mediata da piccole molecole ha introdotto nuove strategie per mantenere ed espandere le cellule adulte primarie invitro 16. Regolando le vie di segnalazione intracellulari, le interazioni cellulare-matrice e l'adesione cellulare, le piccole molecole aumentano significativamente la proliferazione e la plasticità cellulare, migliorando l'efficienza dell'espansione cellulare e il controllo del destino17. Grazie alla loro produzione controllabile, alla bassa immunogenicità e all'integrazione non genomica, le piccole molecole sono ideali per costruire sistemi in vitro per cellule epiteliali adulte inespansione. È stata dimostrata che combinazioni di diverse piccole molecole mantengono efficacemente l'espansione in vitro di vari tipi cellulari primari, inclusi cellule staminali epiteliali della pelle, corneali econgiuntivali 18,19,20. Pertanto, sviluppare una strategia basata su piccole molecole per espandere le LGEC mostra potenziale per applicazioni future sia in ambito di ricerca che terapeutico.

Un sistema semplice ed efficiente di coltura senza siero è stato sviluppato in questo protocollo utilizzando due piccole molecole, Y27632 e SB431542 (2C), per supportare l'espansione delle LGEC. Combinando i vantaggi di queste due molecole, è stato stabilito un sistema senza siero sia per colture 2D che 3D. I LGEC coltivati con 2C hanno mostrato alta capacità proliferativa e caratteristiche cellulari stemmi/progenitrici, mantenendo la morfologia tipica delle cellule epiteliali dopo almeno 10 passaggi in vitro. Nella coltura 3D, le LGEC non solo hanno mantenuto caratteristiche delle cellule stemmi/progenitrici, ma hanno anche mostrato la capacità di differenziarsi ulteriormente in strutture secretorie dopo la rimozione del 2C, formando strutture microghiandolari con funzione secretoria. Questo sistema privo di siero è adatto per modelli in vitro di fisiologia e patologia LG, fornendo anche una fonte sostanziale di cellule per l'ingegneria tissutale LG e applicazioni rigenerative. Tuttavia, il protocollo attuale offre solo un'esplorazione preliminare della cultura 3D. La cultura 3D a lungo termine è al di fuori dell'ambito di questa ricerca in questa fase. È importante notare che questo metodo è progettato specificamente per LGEC di topo adulto e potrebbe non essere applicabile ad altre specie senza ulteriori ottimizzazioni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con i regolamenti dell'Associazione per la Ricerca in Vista e Oftalmologia (ARVO) e del Comitato Etico Sperimentale degli Animali dell'Università di Jilin e dell'Università di Xiamen.

NOTA: Tutte le procedure di coltura cellulare sono state eseguite in un armadietto di biosicurezza sterilizzato ai raggi UV nella sala operatoria cellulare.

1. Cultura primaria delle LGEC

  1. Isolamento del tessuto LG
    1. Eutanasiate i topi anestetizzati C57BL/6J (6-8 settimane) tramite lussazione cervicale e disinfettate la zona dell'orecchio (intorno al LG) con etanolo al 75% per evitare contaminazioni.
    2. Effettuare un'incisione dal canto esterno alla pelle sotto l'orecchio per esporre la LG. Utilizzando pinze e forbici sterili e lisce, separare con cura la LG dal tessuto circostante (ghiandole parotidi e tessuto connettivo) al microscopio di dissezione per ottenere la LG.
    3. Inserire il LG in un mezzo di raccolta del tessuto pre-raffreddato (DMEM con 10% di Penicillina-Streptomicina-Anfotericina) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, mantenendo il tessuto sul ghiaccio per minimizzare la degradazione.
  2. Preparazione dei tessuti
    1. Trasferire i LG in un nuovo mezzo di raccolta di tessuto freddo in una piastra da 3,5 cm.
    2. Rimuovere eventuali residui di pelo di topo, poi rimuovere la capsula di tessuto conlettivo che circonda le LG. Isolare il tessuto ghiandolare usando una pinza liscia per rimuovere il tessuto connettivo tra i lobuli.
      NOTA: Assicurarsi che la capsula sulla superficie del LG e il tessuto connettivo tra i lobuli siano completamente rimossi per esporre i dotti tra i lobuli, facilitando così la penetrazione della soluzione digertiva durante il successivo processo digeritivo.
    3. Trasferisci il tessuto in un nuovo mezzo di raccolta e lava per 5-10 minuti per evitare contaminazioni.
  3. Digestione enzimatica
    1. Inserire i LG in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente soluzione digertiva (mezzo senza siero integrato con 2 mg/mL di Dispase II e 2 mg/mL di Collagenasi A). (Tabella supplementare 1).
      NOTA: 1 mL di soluzione digertiva è necessario per 4 LG.
    2. Disseziona finemente il tessuto LG usando microforbici in piccoli pezzi (circa 0,5-1 mm³) all'interno del tubo.
    3. Incubare il tubo della microcentrifuga a 37 °C con il 5% diCO2 per 2,5-3 ore. Ogni 30-60 minuti, mescola delicatamente il tessuto nella soluzione digertiva per garantire una digestione enzimatica completa.
  4. Isolamento e raccolta delle LGEC
    1. Scuotere il tubo della microcentrifuga più volte al termine del tempo di digestione. Pipetta la soluzione digertiva più volte per scomporre il tessuto in singole cellule o piccoli grumi cellulari. Osserva al microscopio per confermare il progresso della digestione.
      NOTA: Quando non rimangono particelle visibili nella soluzione digerente e vengono osservati al microscopio un gran numero di singole cellule, così come aggregati cellulari simili a condotti, il processo di digestione si interrompe.
    2. Centrifuga il tubo a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, poi elimina il mezzo di digestione.
    3. Risospendere la pellet cellulare in 1 mL di DPBS sterile e centrifugare nuovamente a 1000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per rimuovere eventuali enzimi digestivi residui.
    4. Ripeti il passo 1.4.3, rimuovere il surnatant e risospendere la pellet cellulare in 500 μL di mezzo senza siero.
  5. Semina e coltura primaria dei LGEC
    1. Preparare il mezzo di coltura LGECs integrando il mezzo senza siero con penicillina-streptomicina all'1% e 2C (10 μM Y27632 e 10 μM SB431542). (Tabella supplementare 1)
    2. Seminare le cellule in piastre di coltura standard non trattate a 24 pozzi a una densità di 7,5 x 10³ cellule/cm² utilizzando un mezzo 2C senza siero.
    3. Dopo la semina, batti delicatamente i bordi della piastra di coltura per garantire una distribuzione cellulare uniforme. Metti il piatto in un incubatore a 37 °C con il 5% diCO2.
    4. Cambia il substrato di coltura per la prima volta 72 ore dopo la semina. Successivamente, cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
      NOTA: Evitare di disturbare la cultura durante le prime 72 ore. Per il primo cambio di suolo, non lavare le celle con DPBS. Basta rimuovere il substrato vecchio e aggiungere il substrato fresco.

2. Sottocultura delle LGEC

NOTA: Subcultura quando la confluenza cellulare raggiunge l'80-90%, che di solito avviene circa 14 giorni dopo la coltura primaria.

  1. Rimuovi il mezzo di coltura e lava delicatamente le cellule due volte con DPBS sterile.
  2. Aggiungi 250 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incuba a 37 °C con il 5% di CO2 per 10-15 minuti. Una volta che le giunzioni strette si dissociano e le cellule si arrotondano, aggiungi un volume uguale di soluzione inibitrice della tripsina definita per interrompere la digestione.
    NOTA: Se durante la coltura primaria vengono osservate cellule aderenti piatte e grandi, trattare la coltura con 0,25% di tripsina-EDTA per 5 minuti per rimuovere queste cellule eterogenee. Poi, trattare nuovamente la coltura con 0,25% di Tripsina-EDTA per altri 5 minuti per digerirla ulteriormente e ottenere una popolazione più pura di LGEC per il passaggio successivo.
  3. Mescola la sospensione della cella pipettando con una pipetta da 1 mL, poi trasferisci in un tubo centrifuga da 1,5 mL e centrifuga a 1000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Scartate il soprannatante.
  4. Lavare le celle con DPBS sterile e centrifugare di nuovo per raccogliere i LGEC.
  5. Sospendere i LGEC in mezzo di coltura 2C e semi a un rapporto 1:2 per la sottocoltura. Mescola delicatamente le cellule scuotendo la piastra di coltura e incuba a 37 °C con il 5% diCO2.
    NOTA: Subculturare in un rapporto 1:2 significa che, una volta che la confluenza cellulare raggiunge l'80-90%, le LGEC vengono digerite da una piastra di pozzo e distribuite uniformemente in due nuove piastre di pozzo.
  6. Cambia il substrato al terzo giorno dopo la semina, poi cambia il substrato ogni 2-3 giorni, a seconda delle condizioni della cellula.
  7. Osserva quotidianamente la morfologia cellulare sotto un microscopio a contrasto di fase invertita e documenta con fotografie.

3. Cultura tridimensionale (3D) delle LGEC

NOTA: L'esperimento di coltura 3D utilizza LGEC P1. Quando i LGEC P1 raggiungono l'80-90% di confluenza dopo 7 giorni di coltura con 2C, vengono utilizzati per la coltura 3D.

  1. Fasi di preparazione
    1. Trasferire il gel a matrice (Tabella supplementare 1) dal congelatore a -20 °C a un frigorifero da 4 °C per lo scongelamento durante la notte.
    2. Metti le punte necessarie nelle pipette nel congelatore a -20 °C per garantire un corretta pre-raffreddamento.
    3. Preriscalda la piastra di coltura a 24 pozzi posizionandola in un incubatore a 37 °C, 5%CO2 per 2 ore prima di iniziare la coltura 3D.
    4. Prepara una ghiacciaia e metti dentro diversi tubi microcentrifuga da 1,5 mL per il pre-raffreddamento. Sterilizza il frigorifero in un armadietto di biosicurezza prima dell'uso.
  2. Cultura 3D delle LGEC
    1. Ottenere LGEC P1, come descritto nei passaggi 2.1-2.4.
    2. Sospendere il pellet cellulare in un mezzo di coltura 2C e regolare la densità cellulare a 1 × 10⁴ cellule per 10 μL.
    3. Prendi il gel a matrice scongelato dal frigorifero a 4 °C e le punte delle pipette pre-raffreddate dal congelatore a -20 °C, e mettili nella ghiacciaia all'interno dell'armadietto di biosicurezza.
    4. Rimuovi la piastra di coltura preriscaldata a 24 pozzi dall'incubatrice e mettila nell'armadietto di biosicurezza.
    5. Aggiungi un volume appropriato della sospensione cellulare, miscelato con gel matriciale in rapporto 1:1, usando punte di pipetta pre-raffreddate. Mescola delicatamente per garantire una distribuzione uniforme.
    6. Pipettare 20 μL della miscela dal passaggio 3.2.5 con attenzione nel centro di ogni pozzetto della piastra preriscaldata a 24 pozzi.
    7. Inverti la piastra e incubala in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 per 30 minuti per permettere al gel della matrice di solidificarsi.
    8. Una volta che il gel matriciale si è solidificato, aggiungere 600 μL di mezzo colturale 2C in ciascun pozzo.
    9. Incubare la piastra di coltura in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 , per 14 giorni. Cambia il substrato al terzo giorno dopo la semina e ogni 2-3 giorni dopo, a seconda delle condizioni della cellula.
    10. Osservare quotidianamente la formazione delle sferoidi 3D sotto un microscopio a contrasto di fase invertita e catturare immagini per la documentazione.
  3. Differenziazione degli sferoidi LGEC 3D
    1. Coltiva gli sferoidi LGEC 3D come descritto nel passo 3.2.
    2. Dopo 7 giorni di coltura, rimuovere il mezzo di coltura a 2°C e lavare delicatamente le cellule due volte con DPBS per rimuovere i residui di 2°C. Fai attenzione a non disturbare il gel della matrice.
    3. Aggiungere un mezzo senza siero senza 2C (Null) e continuare la coltura per altri 7 giorni per indurre la differenziazione.
    4. Cambia il substrato ogni 2-3 giorni durante il periodo di coltura.
    5. Osservare quotidianamente i cambiamenti morfologici degli sferoidi 3D indotti sotto un microscopio a contrasto di fase invertito e catturare immagini per la documentazione.

4. Incorporamento e sezionamento congelato di sferoidi LGEC 3D differenziati

NOTA: La differenziazione degli sferoidi 3D è indotta come descritto nella sezione 3.3. Dopo 7 giorni di differenziazione, segui i passaggi seguenti per l'incorporamento ottimale della temperatura di taglio (OCT) e la sezionazione congelata degli sferoidi 3D differenziati.

  1. Aspira il mezzo di coltura lungo i bordi del pozzo. Lava delicatamente gli sferoidi differenziati tre volte con DPBS sterile.
  2. Aggiungi 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nel pozzo in un armadietto di biosicurezza o in una cappa e fissa gli sferoidi a temperatura ambiente per 10 minuti.
  3. Lava delicatamente gli sferoidi tre volte con DPBS sterile, ogni lavaggio dura 10 minuti per rimuovere il fissatore.
  4. Usa una spatola per raschiare con cura la struttura a cupola del gel a matrice sferoidea 3D e trasferirla in un tubo microcentrifuga da 5 mL contenente soluzione di saccarosio al 20%.
  5. Incubare il tubo durante la notte a 4 °C finché la struttura della cupola non si stabilizza sul fondo del tubo.
  6. Rimuovere la struttura a cupola dalla soluzione di saccarosio, rimuovere con cura qualsiasi residuo di saccarosio e incorporarla nel composto OCT. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
  7. Prima di tingere, preparare sezioni spesse 10 μm utilizzando un microtomo congelante.

5. Rilevamento della funzione di secrezione di sferoidi LGEC 3D differenziati

  1. Raccolta di campioni
    1. Indurre la differenziazione degli sferoidi 3D come descritto nella sezione 3.3.
    2. Dopo 7 giorni di differenziazione, rimuovere il mezzo di coltura e lavare gli sferoidi 3D tre volte con DPBS.
    3. Aggiungi 500 μL di mezzo senza siero senza 2C e incuba a 37 °C con il 5% diCO2 per 2 ore.
    4. Raccogli il mezzo di coltura e trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL come campione di base per misurare la concentrazione di lattoferrina (LTF) prima della stimolazione della pilocarpina.
    5. Lava delicatamente gli sferoidi 3D tre volte con DPBS sterile.
    6. Aggiungi 500 μL di mezzo senza siero contenente 1 μg/mL di pilocarpino e incuba gli sferoidi 3D a 37 °C con il 5% diCO2 per 24 ore.
    7. Dopo l'incubazione, raccogliere il mezzo di coltura in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL (per misurare la concentrazione di LTF dopo la stimolazione con pilocarpina).
    8. Centrifugare i campioni del mezzo di coltura raccolti a 4 °C a 1000 × g per 20 minuti. Raccogli il soprantantante e conservalo a -80 °C per un uso successivo.
  2. Diluizione del campione
    1. Prendi i campioni dal congelatore a -80 °C e lasciali scongelare completamente a temperatura ambiente.
    2. Prelevare 5 μL del campione e diluirlo con 495 μL di tampone di diluizione del campione dal kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) per preparare una diluizione di 100 volte.
  3. Preparazione del reagente
    1. Porta tutti i reagenti del kit ELISA a temperatura ambiente 20 minuti prima dell'uso.
    2. Preparare il tampone di lavaggio: Calcola la quantità richiesta in base al numero di campioni e diluisce il tampone concentrato con acqua distillata (1:24).
    3. Prepara la soluzione standard di funzionamento:
      1. Centrifugare lo standard liofilizzato a 10.000 × g per 1 minuto. Aggiungi 1 mL di Reference Standard e Sample Diluent, lascia riposare per 10 minuti e inverti delicatamente più volte.
      2. Dopo che si è sciolto completamente, mescola bene con una pipetta. Questa ricostituzione produce una soluzione funzionante di 2000 pg/mL.
    4. Effettuare diluizioni seriali secondo le istruzioni del kit per preparare il seguente gradiente standard di concentrazione: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Prepara la soluzione attiva per anticorpi biotinilati di rilevamento:
      1. Calcola il volume richiesto per il test (50 μL/pozzo). Centrifugare l'anticorpo di rilevamento biotinilato concentrato a 800 × g per 1 minuto, poi diluire l'anticorpo di rilevamento biotinilato concentrato al 50× in una soluzione operativa 1× utilizzando un diluente anticorpale biotinilato.
      2. Prepara la soluzione poco prima dell'uso, ottenendo un po' più della quantità calcolata, aggiungendo tipicamente 100-200 μL in più del necessario.
    6. Prepara la soluzione di lavoro coniugata alla perossidasi di raibano (HRP):
      1. Calcola il volume richiesto per l'esperimento (50 μL/pozzo). Centrifuga il coniugato HRP concentrato a 800 × g per 1 minuto, poi diluisci fino a una concentrazione di lavoro 1x usando diluente coniugato HRP.
      2. Prepara la soluzione poco prima dell'uso, ottenendo un po' più della quantità calcolata, aggiungendo tipicamente 100-200 μL in più del necessario.
  4. Procedura del test ELISA
    1. Determina i pozzi per lo standard diluito, il bianco e i campioni, con 3 repliche per ciascuno. Aggiungere 25 μL della soluzione di lavoro standard, del bianco o della soluzione campione diluita nei pozzi corrispondenti. Copri la piastra con il sigillante fornito nel kit e incuba a 37 °C per 90 minuti.
      NOTA: Le soluzioni devono essere aggiunte sul fondo del pozzo micro ELISA. Evita di toccare la parete interna e causare schiuma il più possibile.
    2. Escanta il liquido dai pozzi senza lavarla. Aggiungere immediatamente 50 μL della soluzione attiva di anticorpi biotinilati in ciascun pozzo. Copri la piastra con un nuovo sigillante e incuba a 37 °C per 60 minuti.
    3. Escantare il liquido dai pozzi e aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio preparato in ciascun pozzo. Lascia ammollare per 1 minuto, poi aspira o decanta il liquido da ogni pozzo e asciugalo con carta assorbente pulita. Ripeti questo passaggio di lavaggio 3 volte.
      NOTA: Non lasciare che i pozzi si secchino durante il lavaggio.
    4. Aggiungere 50 μL della soluzione di lavoro coniugata HRP preparata a ciascun pozzo. Copri la piastra con un nuovo sigillante e incuba a 37 °C per 30 minuti.
    5. Escantare il liquido dai pozzi e ripetere il processo di lavaggio cinque volte con il tampone di lavaggio come descritto nel passo 5.4.3.
    6. Aggiungi 50 μL di reagente substrato in ogni pozzo. Copri il piatto con un nuovo sigillante e incuba a 37 °C al buio per 15 minuti.
    7. Aggiungere 25 μL di soluzione di stop a ciascun pozzo per terminare la reazione. Assicurati che la soluzione di stop venga aggiunta nello stesso ordine della soluzione substratale.
    8. Determinare la densità ottica (valore OD) di ogni pozzo immediatamente a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche.

6. Isolamento dell'RNA

  1. Raccolta di campioni
    1. Per il tessuto LG
      1. Isolare il tessuto LG extraorbitale di topi adulti come descritto nelle sezioni 1.1.2-1.1.2.
      2. Immergi il tessuto LG appena isolato in PBS per lavare via il sangue.
      3. Asciuga l'umidità superficiale del LG con carta filtrante e inserisci il tessuto in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di reagente di estrazione RNA (Tabella Supplementare 1), mantenendo il tubo sul ghiaccio.
        NOTA: Eseguire passaggi di macinazione prima dell'estrazione dell'RNA per garantire la lisi completa del tessuto.
      4. Aggiungi due sfere di affilatura in acciaio pulito al tubo della microcentrifuga, poi metti il tubo in una macinacaffè ad alta velocità pre-raffreddata.
      5. Imposta i parametri del macinacaffè: frequenza 70 Hz, tempo di macinatura 45 s, tempo di pausa 15 secondi e ripeti per 10 cicli. Stringi il manico del tappo del macinacaffè e inizia a macinare.
      6. Posizionare il tubo sul ghiaccio o conservarlo a -80 °C per l'estrazione successiva dell'RNA una volta completato il processo di macinazione.
    2. Per le LGEC
      1. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule tre volte con DPBS sterile quando le LGEC raggiungono l'80-90% di confluenza.
      2. Aggiungi 600 μL di reagente di estrazione di RNA in ogni pozzo (per una piastra da 24 pozzi) e incuba a temperatura ambiente per 5-10 minuti.
      3. Utilizzare una pipetta da 1 mL per pipetare ripetutamente la soluzione del reagente di estrazione RNA in ogni pozzo per garantire una lisi cellulare completa.
      4. Trasferisci la soluzione in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      5. Posiziona il tubo sul ghiaccio o conservalo a -80 °C per l'estrazione successiva dell'RNA.
    3. Per sferoidi LGEC 3D
      1. Raccogliere sferoidi LGEC 3D non differenziati e differenziati coltivati per 14 giorni come descritto nei passaggi 3.2-3.3. Aggiungere 1 mL di soluzione digertiva (mezzo senza siero contenente 1 mg/mL Dispasi II) in ciascun pozzo, assicurando che la struttura a cupola del gel a matrice sferoidale sia completamente coperta. Incubare a 37 °C con 5% diCO2 per 30 minuti.
      2. Trasferire la soluzione digertiva contenente gli sferoidi 3D in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una pipetta da 1 mL. Centrifugare a 1000 × g per 3 minuti per raccogliere il pellet sferoide.
      3. Lavare il pellet con 1 mL di DPBS e centrifugare a 1000 × g per 3 minuti per raccogliere nuovamente il pellet.
      4. Aggiungi 600 μL di reagente di estrazione di RNA (per 20 μL di gel matrice) e incuba a temperatura ambiente per 5-10 minuti.
      5. Mescola accuratamente con una pipetta da 1 mL per garantire la completa lisi degli sferoidi 3D.
      6. Posiziona il tubo sul ghiaccio o conservalo a -80 °C per l'estrazione successiva dell'RNA.
  2. Estrazione di RNA
    NOTA: Indossare l'attrezzatura di protezione personale appropriata (camice da laboratorio, guanti, mascherina) e eseguire tutte le procedure che coinvolgono cloroformio e isopropanolo in una cappa a pompa. Smaltire i flussi di rifiuti chimici in contenitori designati per rifiuti pericolosi etichettati per la generazione di rifiuti pericolosi, seguendo i protocolli istituzionali di smaltimento dei rifiuti.
    1. Aggiungere cloroformio (volume 1/5 del reagente di estrazione RNA) al tubo centrifuga contenente il campione di RNA nel reagente di estrazione RNA (dal passaggio 6.1).
      NOTA: Esegui la procedura in una cappa a fumo.
    2. Mescola accuratamente usando un vortice e incuba a temperatura ambiente per 10 minuti fino alla separazione di fase.
    3. Centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, il liquido si separerà in tre strati, con l'RNA nella fase acquosa trasparente più alta.
    4. Preparare un nuovo tubo centrifugo privo di RNasi da 1,5 mL e aggiungere isopropanolo (metà del volume del reagente di estrazione RNA) in una cappa fumiera.
    5. Pipetta con attenzione la fase acquosa trasparente più alta (metà del volume del reagente di estrazione dell'RNA) nel nuovo tubo privo di RNasi.
      NOTA: Fai attenzione a evitare di contaminare lo strato centrale durante la pipetta.
    6. Inverti il tubo più volte per mescolarlo e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Poi centrifugare di nuovo a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
    7. Scartare il sovrantantante e aggiungere 500 μL di etanolo al 75% per lavare il pellet invertendo il tubo. Centrifuga di nuovo a 14.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
    8. Ripeti il passo 6.2.7. Scartare il surnante ed eseguire una rapida centrifugazione per rimuovere eventuali residui di liquido.
    9. Metti il tubo sul ghiaccio nella cappa fumi, apri il coperchio e lascialo asciugare all'aria per 10-20 minuti finché il pellet bianco non diventa semi-trasparente.
    10. Aggiungi 20 μL di acqua senza RNasi per sciogliere il pellet. Misura la concentrazione e la purezza dell'RNA usando uno spettrofotometro.
      NOTA: Se la concentrazione di RNA è troppo alta, diluire con una quantità appropriata di acqua priva di RNasi.
    11. Posizionare la soluzione di RNA sul ghiaccio o conservarla a -80 °C per il successivo processo di trascrizione inversa.

7. RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

  1. Trascrizione inversa
    1. Aggiungere i seguenti componenti in sequenza al tubo di reazione PCR secondo le istruzioni del produttore: 800 ng di RNA totale (calcolare il volume in base alla concentrazione), 4 μL di 5x All-in-One SuperMix per q-PCR, 1 μL di solvente gDNA e acqua senza RNasi per portare il volume totale a 20 μL.
    2. Mescola delicatamente i componenti. Imposta la macchina PCR alle seguenti condizioni: 55 °C per 6 minuti, 80 °C per 1 minuto e poi 12 °C indefinitamente.
    3. Conservare il cDNA a -20 °C o conservarlo in acciaio per il processo qRT-PCR dopo che la reazione di trascrizione inversa è completata.
  2. qRT-PCR
    1. Prepreparare la soluzione pre-mix qRT-PCR per mirare diversi geni come segue: 5 μL di 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL di Primer Diretto (10 μM), 0,2 μL di Primer Inverso (10 μM) e 3,6 μL di acqua priva di nucleasi. Mescola delicatamente e mettila sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 9 μL del pre-mix qRT-PCR (preparato nel passo 7.2.1) e 1 μL di cDNA (preparato nel passo 7.1) nei tubi qRT-PCR secondo il disegno sperimentale.
    3. Centrifuga i tubi a 1000 × g a temperatura ambiente per 2 minuti.
    4. Inserire i tubi nella macchina PCR quantitativa a fluorescenza per la rilevazione.
      NOTA: Utilizzare un metodo in tre fasi con il seguente programma secondo le istruzioni del produttore del reagente: 94 °C per 30 s, 94 °C per 5 s, 60 °C per 15 s e 72 °C per 10 s. Inizia a pedalare dal passo 2 per 40-45 cicli.
    5. Eseguire analisi quantitative utilizzando il metodo comparativo CT (2-ΔΔCt).
      NOTA: Ogni dataset dovrebbe essere ripetuto almeno tre volte indipendentemente per garantire l'affidabilità dei risultati.

8. Colorazione immunofluorescenza

NOTA: La colorazione immunofluorescenza viene eseguita su LGEC coltivati in piastre a 24 pozzi con tassi di confluenza del 70-80% o su sezioni congelate di strutture 3D differenziate di LGEC.

  1. Per le LGEC
    1. Rimuovi il mezzo di coltura dai pozzi e lava le cellule tre volte con PBS.
    2. Aggiungi 500 μL di PFA al 4% in ciascun pozzo in un armadietto di biosicurezza o in una cappa e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le celle.
    3. Lava le cellule tre volte con PBS, ogni lavaggio dura 5 minuti.
    4. Aggiungi 500 μL di 0,2% di Triton X-100 per coprire le cellule e incuba a temperatura ambiente per 20 minuti per permeabilizzare la membrana cellulare.
    5. Lava le cellule tre volte con PBS, ogni lavaggio dura 10 minuti.
    6. Rimuovere il PBS e utilizzare un marcatore immunoistochimico per tracciare un cerchio attorno a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzi. Aggiungere 50 μL di BSA al 2% in ogni pozzo per coprire le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora per bloccare.
    7. Rimuovere la BSA e aggiungere 50 μL dell'anticorpo primario diluito (Tabella Supplementare 1) per coprire le LGEC. Incubare a 4 °C per 16-18 ore.
    8. Rimuovere l'anticorpo primario e ripetere il passo 8.1.5.
    9. Aggiungere 50 μL di anticorpi secondari fluorescenti a ciascun pozzetto per coprire le LGEC. Incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora.
    10. Ripeti il passo 8.1.5, evitando l'esposizione alla luce.
    11. Aggiungere 50 μL di soluzione 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per coprire le LGEC e osservare la colorazione al microscopio a fluorescenza.
  2. Per sferoidi LGEC 3D
    1. Prepara le sezioni sferoidi 3D LGEC congelate come descritto nel passo 4. Esegui la colorazione per immunofluorescenza come descritto nei passaggi 8.1.2-8.1.11.

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Risultati

Stabilire un sistema di coltura LGECs senza siero utilizzando 2C
In questo protocollo, l'obiettivo era creare un sistema di coltura più semplice ed efficiente per espandere i LGEC primari del mouse. Dopo un ampio screening, è stata sviluppata con successo una combinazione 2C senza siero, composta esclusivamente da Y27632 e SB431542, che ha permesso un'espansione in vitro a lungo termine delle LGEC. Dopo una digestione enzimatica mista, le LGEC primarie hanno ...

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Discussione

Come descritto nell'Introduzione, negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi sistemi di coltura senza siero per celluleLG 10,11,12,13. Tuttavia, molti di questi metodi presentano limitazioni, tra cui una scarsa proliferazione cellulare e l'incapacità di ottenere un'espansione su larga scala in vitro10,11

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro fu sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82471048, 82271045); il Programma di Scienza e Tecnologia di Shenzhen (JCYJ20240813145510014); il Progetto Speciale dei Talenti nella Ricerca Sanitaria della Provincia di Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); e il Progetto di Sviluppo della Scienza e della Tecnologia della Provincia di Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
 -20° C Frigorifero a temperatura ultra-bassaHaier
 -80° C Frigorifero a temperatura ultra-bassaHaier
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200056
1,5 mL tubo microcentrifuga  KirgenKG2211Privo di Rnase
Antro di coltura cellulare da 35mmLABSELECT12111
4 & deg; C FrigoriferoHaier
4% paraformaldeide (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)Yeasen708939ES03Conserva a -20 ° C, scorta a 1 mg/mL, 500x, diluire a 1x con 1x PBS
Tubo centrifuga da 5 mL  ACMECAC17457
Tubo centrifuga da 50 mL  LABSELECTCT-002-50-SS
Anticorpo anti-alfa muscolo liscio actina del coniglioAbcamab5694Diluire con il buffer di diluizione degli anticorpi a 1:100 
Anticorpo anti-AQP5 del coniglio  ABclonaleA9927Diluire con il buffer di diluizione degli anticorpi a 1:100 
Anticorpo anti-citocheratina 14 del coniglioAbcamab181595Diluire con il tampone di diluizione degli anticorpi a 1:200 
Anti-Citocheratina 19  Anticorpo del coniglioAbcamab52625Diluire con il buffer di diluizione degli anticorpi a 1:400 
Anticorpo anti-Ki67 del coniglioAbcamab16667Diluire con il tampone di diluizione degli anticorpi a 1:200 
Cabina di biosicurezzaSterilGARD
Albumina sierica bovina (BSA) Yeasen36101ES60Negoziare a 4° C
Topi C57BL/6JCentro per gli Animali da Laboratorio dell'Università di Xiamen
Placca di coltura cellulareLABSELECT1131224-pozzo
Incubatore cellulareEppendorf
CentrifugaEppendorf
CloroformioHUSHI10006818ATTENZIONE, Esecuzione di operazioni in una cappa
CO2  Incubatore a temperatura costanteEppendorf
Collagenasi ARoche10103586001Conserva a -20 ° C, scorta a 200 mg/mL, 100x
Soluzione definita per inibitori della tripsina (DTI)GibcoR007100
Kit completo DermaLife K Keratinocyte Medium (medium senza siero) Linea della VitaLL-0007Negoziare alle 4 & deg; C
D-HanksBiosharpBL559A & nbsp;Utilizzato per diluire la Dispasi II
Dimetilsolfossido (DMSO)SigmaD4540Utilizzato per diluire Y27632 e SB431542
Dispase IISigmaD4693Conserva a -20 ° C, scorta a 200 mg/mL, 100x
DMEM base (1X)GibcoC11995500BT
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo Secondario Altamente Adsorbito Incrociatato, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Diluire con il tampone di diluizione degli anticorpi a 1:300
Soluzione salina fosfato-tamponata di Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Assoluto dell'etanoloHUSHI10009218ATTENZIONE, Utilizzare per preparare altre diluizioni di etanolo  
Microtomo congelanteLeica
Macinacaffè ad alta velocità a bassa temperaturaServicebio
Microscopio a fluorescenza invertitaLeica
Microscopio rovesciatoOlympus
Isopropanol HUSHI80109270
Microscopio confocale a scansione laser FV3000OLYMPUS
Centrifuga a bassa temperatura e alta velocitàEppendorf
Kit di immunosorbimento enzimatico LTF (ELISA) & nbsp;ElabscienceE-MSEL-M0047Conserva a -20 ° C
Gel matriciale (Matrigel)82703MogengelAliquota e conserva a -20 & deg; C
MicropipettorEppendorf
Lettore di microplaccheThermo Fisher Scientific
Acqua priva di nucleasiBiosharpBL510B
Composto OCTScigen4586
PBS,1 e volte; (pH7.4)ServicebioG4202
Amplificatore PCRBIO-RAD
Penicillina-StreptomicinaBiosharpBL505A
Penicillina-Streptomicina-AnfotericinaBiosharpBL142A
Kit PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Conserva a -20 ° C
PerfectStart Uni RT& Kit qPCRTransGen BiotechAUQ-01Conserva a -20 ° C
Pilocarpina AladdinP424663Conserva a -20 ° C, 2500x
Primer AQP5 & nbsp; sequenza:
Avanti:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Retro:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Primer K14  sequenza:
Avanti:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Retromarcia: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech
Primer K15  sequenza:
Avanti:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Retro:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biotech
Primer K19  sequenza:
Avanti:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Retro:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Primer K5  sequenza:
Avanti:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Retro:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  sequenza:
Avanti:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Retromarcia: TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  sequenza:
Avanti:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Retro:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Primer P63  sequenza:
Avanti:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Retro: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Primer SOX10  sequenza:
Avanti:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Retro:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer α-SMA  sequenza:
Avanti:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Retro:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Strumento PCR quantitativo a fluorescenza in tempo realeRoche
Reagente di estrazione totale di RNA per isolatore di RNAVazymeR401-01ATTENZIONE, Esecuzione di operazioni in una cappa
SB431542 ApexbioA8249Conserva a -20 ° C, stock a 20 mM, 2000x
Spettrofotometro NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificMisurare la concentrazione di RNA
SucrosioMacklinS818046Dissolversi con acqua distillata
Triton X-100SolarbioT8200
Sistema di purificazione dell'acqua ultra puraMillipore
Buffer universale di diluizione degli anticorpiEpizimaPS119Negoziare alle 4 & deg; C
Y27632 ApexbioB1293Conserva a -20 ° C, stock a 20 mM, 2000x

Riferimenti

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