Sviluppo e applicazione di modelli animali di diabete con ictus ischemico: collegare la ricerca di base alla traduzione clinica

Sommario

Questa revisione riassume i recenti progressi nello sviluppo e nell'applicazione di modelli animali di diabete mellito con infarto cerebrale acuto.

Abstract

Il diabete è un fattore di rischio indipendente importante per l'ictus ischemico, aggravando la gravità dell'ictus e peggiorando gli esiti per i pazienti. I modelli tradizionali di ictus, che utilizzano animali sani, non riescono a replicare la complessa fisiopatologia del diabete, contribuendo così al scarso successo traslazionale delle terapie neuroprotettive. Questa revisione riassume le metodologie per stabilire modelli animali di diabete con ictus ischemico, inclusi approcci per l'occlusione dell'arteria cerebrale media e tromboembolica, e le considerazioni chiave per la costruzione di modelli combinati. Questa revisione mette in evidenza valutazioni fenotipiche adattate alla comorbidità diabetica. Esamina inoltre come questi modelli promuovano la comprensione dei meccanismi patogeni e dell'efficacia farmacologica. Esaminiamo inoltre le attuali limitazioni metodologiche e suggeriamo future direzioni di ricerca. In generale, gli obiettivi erano fornire indicazioni teoriche e metodologiche per rafforzare la ricerca di base e traslazionale sull'ictus ischemico associato al diabete e supportare lo sviluppo di strategie di trattamento clinico più efficaci.

Introduzione

Il diabete mellito è un fattore di rischio indipendente ben consolidato per l'ictus ischemico, peggiorando notevolmente gli esiti clinici e i deficit neurologici nei pazienti con ictus. L'interazione tra diabete e ictus ischemico è guidata da complessi meccanismi fisiopatologici, tra cui la disregolazione metabolica, la disfunzione endoteliale vascolare e l'aumento dell'attività infiammatoria, che collettivamente aggravano la lesione ischemica cerebrale e compromettono il recupero (Figura 1). Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato costantemente che i pazienti con diabete hanno un'incidenza più elevata di ictus ischemico e presentano gravi deficit neurologici e risultati funzionali inferiori rispetto agli individui senza^{diabete 1,2}.

Per chiarezza, è importante definire la terminologia utilizzata in tutto questo manoscritto. L'ictus ischemico è la condizione clinica generale caratterizzata da una disfunzione neurologica acuta dovuta a ischemia cerebrale focale. Questa condizione comprende due principali sottotipi fisiopatologici: ictus trombotico, causato dalla formazione locale di trombo all'interno di un'arteria cerebrale (spesso nei siti della placca aterosclerotica), e ictus embolico, derivante da emboli provenienti da fonti lontane come il cuore o i vasi prossimali. L'infarto cerebrale acuto si riferisce specificamente all'area risultante di tessuto cerebrale necrotico confermata da patologie o immagini di immagini. Nel contesto di questa revisione, l'ictus associato al diabete è considerato ictus ischemico che si verifica nei pazienti con diabete preesistente, dove iperglicemia, disfunzione vascolare e infiammazione aggravano la lesione e compromettono il recupero.

La microalbuminuria, indicatore di disfunzione endoteliale sistemica, è stata identificata come un fattore di rischio indipendente per una significativa stenosi arteriosa intracranica ed extracranica nei pazienti con ictus ischemico. Evidenziano così le complicazioni vascolari insite nel diabete che amplificano il rischio ischemico^{cerebrale 3}. Inoltre, le comorbidità comuni, come ipertensione e iperlipidemia, aumentano ulteriormente il rischio e la gravità di ictus ischemico, e aumentano la probabilità di compromissione cognitiva^{post-ictus 4}. Queste osservazioni sottolineano la necessità di chiarire le caratteristiche fisiopatologiche distinte dell'ictus ischemico nei pazienti diabetici per facilitare lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci.

I modelli sperimentali tradizionali di ictus ischemico utilizzano prevalentemente animali sani, limitandone la rilevanza traslazionale per l'ictus ischemico nel diabete. Questi modelli non riproducono adeguatamente i disturbi metabolici, il rimodellamento vascolare e l'aumento del contesto neuroinfiammatorio caratteristico del diabete. L'arteriolosclerosi cerebrale, una malattia cerebrale di piccoli vasi, caratterizzata da un ispessimento della parete arteriolare e comunemente associata all'invecchiamento, all'ipertensione e al diabete, illustra la patologia vascolare che complica l'ictus ischemico nei pazienti con^{diabete 5}. L'arteriosclerosi cerebrale contribuisce a una perfusione cerebrale compromessa e a una maggiore suscettibilità a lesioni ischemiche; tuttavia, la patogenesi complessa e le interazioni con i componenti della sindrome metabolica rimangono poco chiare. La mancanza di modelli animali che imitino fedelmente queste anomalie vascolari comorbide limita la valutazione di strategie neuroprotettive adattate all'ictus ischemico nel diabete. Inoltre, la neuroinfiammazione causata dalla microglia attivata aggrava ulteriormente la lesione ischemica ed è regolata differenzialmente negli stati^{diabetici 6}. Studi recenti su modelli di diabete su ratti dimostrano che agenti abbassanti il glucosio, come gli agonisti del recettore peptidico-1 simile al glucagone e gli inibitori del cotrasportatore sodio-glucosio-2, conferiscono neuroprotezione, non solo riducendo il volume dell'infarto, ma anche modulando l'attivazione microgliale e migliorando la sopravvivenza^{neuronale 7}. Questi risultati sottolineano la necessità di modelli di ictus ischemico che incorporino le caratteristiche metaboliche e infiammatorie del diabete, per valutare con maggiore precisione l'efficacia terapeutica e i meccanismi sottostanti.

Date le complessità cliniche e biologiche dell'ictus ischemico associato al diabete, sviluppare modelli animali raffinati che integrino la disfunzione metabolica, la patologia endoteliale vascolare e i processi neuroinfiammatori del diabete è una priorità urgente. Questi modelli forniranno piattaforme traslazionali essenziali che collegano intuizioni meccanicistiche con applicazioni cliniche. Inoltre, i progressi nell'identificazione di biomarcatori molecolari e bersagli terapeutici specifici per l'ictus diabetico hanno evidenziato RNA non codificanti, come l'RNA non codificante lungo, SNHG4 (gene ospite 4 a RNA nucleolare piccolo), come potenziali regolatori della progressione della malattia e della risposta^{terapeutica 8}. La valutazione sistematica delle caratteristiche fenotipiche, come la stenosi vascolare, il volume dell'infarcto, i deficit neurologici e gli esiti cognitivi, è essenziale per stabilire la validità e l'utilità nella ricerca di questi modelli. In questa revisione, i modelli non solo vengono riassunti, ma viene fornita un'analisi comparativa della loro fattibilità tecnica, dei tassi di successo e delle limitazioni. L'obiettivo è offrire ai ricercatori un quadro pratico per selezionare il modello composito più appropriato in base ai loro specifici obiettivi sperimentali e alle risorse disponibili.

Protocollo

Istituzione e selezione dei modelli per il diabete

Diabete mellito di tipo 1 (T1DM): modello indotto da streptozotocina
La streptozotocina è un agente chimico ampiamente utilizzato per indurre il T1DM negli animali grazie alla sua citotossicità selettiva verso le cellule β^{pancreatiche 9.} Dopo essere entrata nelle β cellule tramite il trasportatore di glucosio 2, la streptozotocina induce alchilazione e frammentazione del DNA, portando alla morte delle cellule β e alla conseguente carenza di insulina. Questo processo replica efficacemente la caratteristica fisiopatologia tipica del T1DM, caratterizzata da una carenza assoluta di insulina. La distruzione delle cellule β indotta da streptozotocina produce iperglicemia e disturbi metabolici associati simili a quelli osservati nel T1DM¹⁰ umano. Grazie all'induzione rapida e affidabile del diabete nei roditori, il modello della streptozocina è ampiamente utilizzato in studi che esaminano i meccanismi della malattia e gli interventi^{terapeutici 11}. Tuttavia, il diabete indotto da streptozotocina riflette principalmente una carenza di insulina e non cattura le componenti autoimmuni del T1DM umano, limitandone la capacità di rappresentare l'intero spettro patologico.

L'induzione del T1DM tramite streptozotocina richiede un'attenta ottimizzazione dei protocolli di dosaggio e somministrazione per bilanciare la stabilità del modello con la sopravvivenza animale. Sono comunemente utilizzati due approcci principali: un'unica iniezione ad alta dose e più iniezioni a basso dosaggio. Una singola dose elevata (tipicamente 50–65 mg/kg intraperitoneale) induce una rapida e quasi completa distruzione delle cellule β, causando una grave iperglicemia entro¹⁰ giorni. Sebbene efficiente e altamente riproducibile, questo metodo è associato a un aumento della mortalità e a una maggiore tossicità fuori bersaglio. In alternativa, più iniezioni a basso dosaggio (ad esempio, 40 mg/kg al giorno per cinque giorni consecutivi) producono danni graduali alle cellule β. È fondamentale notare che questa distruzione graduale può essere accompagnata da una certa infiltrazione infiammatoria, ma non riproduce l'eziologia autoimmune del T1DM negli esseri^{umani 12}. Questo approccio riduce la mortalità ed è migliore nel modellare le caratteristiche infiammatorie della malattia; Tuttavia, è necessario un monitoraggio prolungato e può esserci variabilità nell'insorgenza e nella gravità del diabete. La scelta di un protocollo appropriato dipende dall'obiettivo sperimentale, con un regime modello ad alto dosaggio adatto all'induzione rapida del diabete e un regime a bassa dose preferito per studi che coinvolgono meccanismi^{immunomediati 13,14}.

Il modello indotto da streptozotocina del T1DM offre diversi vantaggi, tra cui un'induzione rapida e relativamente stabile del diabete carente di insulina, costo-efficacia e facilità d'uso nei roditori. Queste caratteristiche lo rendono particolarmente adatto per studiare la perdita di β cellule, l'iperglicemia e le complicazioni del diabete associate alla carenza di insulina. Tuttavia, il modello manca di caratteristiche chiave del T1DM negli esseri umani, come la distruzione autoimmune delle cellule β o la presenza di resistenza all'insulina. Di conseguenza, il modello della streptozotocina non ricapitola completamente la complessa immunopatogenesi del T1DM. L'assenza di resistenza all'insulina limita ulteriormente l'applicabilità negli studi che richiedono questo componente. Inoltre, la tossicità da streptozotocina può influenzare altri organi, compromettendo potenzialmente gli esiti sperimentali. Pertanto, sebbene il modello di streptozotocina rimanga una pietra angolare per studi sul T1DM, le limitazioni sottolineano la necessità di utilizzare in modo complementare modelli genetici o autoimmuni, come il topo diabetico non obeso, per indagare i meccanismi immunitari e la progressione della ^{malattia 9,15}.

Diabete mellito di tipo 2 (T2DM)
I modelli indotti dalla dieta di T2DM sono stabiliti principalmente alimentando i roditori con una dieta ricca di grassi e zuccheri, che favorisce obesità, resistenza all'insulina e disregolazione metabolica, imitando così le fasi iniziali del T2DM negli^{esseri umani 16}. Questi modelli riproducono la cascata fisiopatologica iniziando con la resistenza all'insulina periferica, seguita da iperinsulinemia compensatoria e eventuale disfunzione delle cellule β. Gli interventi alimentari portano anche a un aumento dell'adipositità, infiammazione cronica a basso grado e alterazione del metabolismo lipidico, tutti elementi che contribuiscono a una compromessa dell'omeostasi del glucosio. Questi modelli sono particolarmente utili per indagare fattori ambientali e di stile di vita che contribuiscono al T2DM, e per valutare interventi che mirano alla resistenza all'insulina e alla sindrome metabolica. Tuttavia, l'insorgenza e la gravità del diabete possono variare in base alla composizione della dieta, alla durata e alla tensione animale, rendendo necessaria un'attenta ottimizzazione del protocollo. I modelli nutrizionali facilitano anche l'esplorazione dell'interazione tra infiammazione indotta dall'obesità e insufficienza delle β cellule, fornendo informazioni sulla progressione della^{malattia 17}. Sebbene il modello indotto dalla dieta sia eccellente per studiare la resistenza all'insulina e gli effetti degli interventi nello stile di vita, è poco adatto a studiare complicazioni avanzate del diabete, come la nefropatia grave o la calcificazione vascolare avanzata, che sono meglio modellate utilizzando modelli genetici o combinati.

I modelli genetici del T2DM, come i topi db/db e ostetrici/ob, presentano mutazioni che inducono obesità e resistenza all'insulina, modellando efficacemente aspetti chiave della fisiopatologia del T2DM negli esseri^{umani 18}. I topi ostetrici/ob hanno una mutazione nel gene della leptina, che porta a una carenza di leptina, mentre i topi db/db hanno una mutazione nel gene del recettore della leptina che causa resistenza alla leptina. In entrambi i modelli, i topi presentano iperfagia, grave obesità, iperglicemia, iperinsulinemia e progressiva insufficienza β cellulare. Queste alterazioni genetiche producono una profonda resistenza all'insulina e disturbi metabolici, rendendo questi modelli preziosi per indagare i meccanismi genetici e molecolari alla base del T2DM e delle complicazioni associate. Tuttavia, la natura monogenica di queste mutazioni limita la loro capacità di rappresentare l'eziologia poligenica e multifattoriale del T2DM negli esseri umani. Inoltre, la rapida insorgenza del diabete e dell'obesità grave in questi modelli potrebbe non riflettere l'eterogeneità osservata negli esseri umani. Nonostante queste limitazioni, i topi db/db e ostetrici/ob sono ampiamente utilizzati negli studi preclinici e nello sviluppo di farmaci¹⁹.

La combinazione di induzione dietetica e somministrazione a bassa dose di streptozotocina costituisce un modello ibrido progettato per replicare la progressione del T2DM, dalla resistenza all'insulina alla disfunzione e fallimento delle cellule^{β 20}. Gli animali vengono inizialmente nutriti con una dieta ricca di grassi per indurre obesità e resistenza all'insulina, imitando i primi disturbi metabolici del T2DM. Successivamente, vengono somministrate basse dosi di streptozotocina per indurre lievi danni alle β cellule, simulando il declino della funzione delle cellule β presente nelle fasi avanzate della malattia. Questo approccio produce un fenotipo caratterizzato da iperglicemia, secrezione di insulina compromessa e resistenza all'insulina persistente che assomiglia molto alla progressione del T2DM negli esseri umani. Il modello è stato applicato con successo in topi e ratti, offrendo una solida piattaforma per indagare le complicazioni del diabete, come la cardiomiopatia e la nefropatia. Facilita inoltre la valutazione degli interventi terapeutici che mirano alla resistenza all'insulina e alla conservazione delle cellule β. Tuttavia, ottenere risultati costanti richiede dosaggio e tempismo precisi, e le risposte possono variare a seconda del ceppo animale e del protocollo^{sperimentale 21}.

La selezione di un modello animale appropriato di T2DM richiede un'attenta valutazione delle caratteristiche metaboliche, della patologia pancreatica e delle complicazioni vascolari, per garantire l'allineamento con obiettivi specifici dello studio. I modelli indotti dalla dieta replicano efficacemente la resistenza all'insulina e la sindrome metabolica correlata all'obesità, ma possono indurre insufficienza β cellulare incoerente e avere complicazioni avanzate limitate. I modelli genetici, come i topi db/db e ostetrici/ob, forniscono fenotipi ben caratterizzati di obesità e resistenza all'insulina con disfunzione progressiva delle β cellule, anche se la natura monogenica limita la generalizzabilità. Il modello combinato di dieta con streptozocina a basso dosaggio offre una rappresentazione più completa della progressione del T2DM, inclusa la perdita di β cellule e le complicazioni vascolari, rendendolo adatto per studi di malattie in stadio avanzato e interventi terapeutici. I ricercatori devono considerare fattori come l'esordio, la gravità, la riproducibilità e la rilevanza per la fisiopatologia umana della malattia, nonché le differenze negli ceppi e nelle risposte specifiche per sesso che possono influenzare gli esiti dei modelli. Per rilevanza traslazionale, si preferiscono modelli che integrano aspetti metabolici e vascolari del T2DM, inclusi nefropatia e cardiomiopatia. In definitiva, la selezione del modello dovrebbe essere guidata dalle specifiche domande meccanicistiche o terapeutiche che vengono poste, bilanciando la complessità sperimentale con la fattibilità^{pratica 17,20,22}  (Figura 2, Tabella 1).

Istituzione e adattamento dei modelli di ictus ischemico

Modelli permanenti e transitori dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO)
Il metodo dell'occlusione filamentosa, comunemente chiamato tecnica di sutura intraluminale, è un approccio sperimentale ampiamente utilizzato per indurre l'ischemia cerebrale focale occludendo l'arteria cerebrale media (MCA) nei modelli animali, in particolare nei^{roditori 23}. Questa tecnica consiste nell'inserire una sutura in nylon monofilamento attraverso l'arteria carotide esterna fino all'arteria carotide interna e avanzarla per bloccare l'origine dell'MCA, simulando così l'ischemia cerebrale locale, come si osserva negli esseri umani con ictus ischemico. La procedura può portare a un'occlusione permanente o transitoria, a seconda che il filamento venga lasciato in posizione o ritirato dopo un periodo definito di ischemia per permettere la reperfusion²⁴. Il modello è apprezzato per la natura minimamente invasiva, la riproducibilità e la rilevanza clinica, poiché l'occlusione dell'MCA è la causa più comune di ictus ischemico negli esseri umani. Il successo del modello può essere confermato monitorando una riduzione del flusso sanguigno cerebrale tramite immagini Doppler e valutando dopo la procedura i deficit neurologici e la dimensione dell'infarto. Le variazioni nel diametro del filamento, nella profondità di inserimento e nella durata dell'occlusione permettono di regolare la gravità dell'insulto ischemico e di indagare diversi meccanismi fisiopatologici e interventi terapeutici. Questo modello è stato determinante nell'elucidare la fisiopatologia dell'ictus e nella valutazione degli agenti^{neuroprotettivi 25}.

L'applicazione del modello MCAO agli animali con diabete presenta diverse sfide chirurgiche dovute a alterazioni vascolari sistemiche associate al diabete. Il diabete induce fragilità vascolare, disfunzione endoteliale e microangiopatia, compromettendo l'integrità dei vasi e la capacità di^{guarigione 26}. Questi cambiamenti patologici complicano le delicate manipolazioni vascolari necessarie per l'inserimento e la rimozione del filamento, aumentando così il rischio di complicazioni emorragiche e mortalità intraoperatoria. Inoltre, gli animali con diabete spesso presentano risposte fisiologiche compromesse, come alterazione della regolazione della pressione sanguigna e ritardo nella guarigione delle ferite, che possono aggravare la morbilità perioperatoria. La loro maggiore suscettibilità a lesioni ischemiche-reperfusioni e stress ossidativo complica ulteriormente l'interpretazione degli esiti sperimentali. Di conseguenza, i tassi di mortalità nei modelli MCAO negli animali diabetici sono più alti rispetto a quelli nei loro omologhi non diabetici, limitando il potere statistico e la rilevanza^{traslazionale 27}. Affrontare queste sfide richiede un perfezionamento meticoloso delle tecniche chirurgiche, inclusa una gestione delicata del vaso, una selezione precisa dei filamenti e un attento monitoraggio dei parametri fisiologici. Le strategie peri-operatorie, tra cui il controllo glicemico pre-operatorio, protocolli anestesici ottimizzati e cure di supporto post-operatorie, sono anch'esse fondamentali per migliorare la sopravvivenza e garantire la coerenza del modello negli animali con^{diabete 28}.

Sono stati introdotti diversi progressi metodologici per affrontare queste sfide. I miglioramenti nei materiali filamentici, come i monofilamenti rivestiti in silicone con diametri e forme di punta ottimizzati, hanno facilitato un'inserzione più fluida con una riduzione delle lesioni^{vascolari 29}. Queste modifiche permettono un'occlusione più costante con danni endoteliali minimi, particolarmente importante data la fragile vascolarizzazione degli animali con diabete. Le tecniche chirurgiche sono state perfezionate per preservare i rami arteriosi e minimizzare i traumi. Ad esempio, gli approcci che evitano la legatura dell'arteria carotide esterna e la riparazione dell'incisione comune dell'arteria carotide aiutano a mantenere il flusso sanguigno collaterale e a ridurre la variabilità^{dell'ischemia 30}. La gestione preoperatoria, con enfasi su un rigoroso controllo glicemico, mitiga la disfunzione vascolare indotta dall'iperglicemia e lo stress ossidativo, migliorando così gli esiti chirurgici e riducendo la mortalità. I protocolli di cura post-operatoria, tra cui il mantenimento della normotermia, un'idratazione adeguata, l'analgesia e il monitoraggio dei deficit neurologici, migliorano ulteriormente la stabilità del modello. In alcuni studi, agenti neuroprotettivi come antiossidanti (ad esempio, edaravone) sono stati utilizzati per attenuare la lesione ischemica in modelli di^{diabete 31}. Collettivamente, questi miglioramenti contribuiscono all'istituzione di modelli stabili e riproducibili di MCAO negli animali con diabete, facilitando studi traslazionali che riflettono più accuratamente la complessità clinica dei pazienti con ictus^{ischemico 30,31}.

Modelli tromboembolici
L'induzione fotochimica è un approccio sperimentale per creare ischemia cerebrale focale generando trombosi localizzata tramite l'attivazione di coloranti fotosensibili, come Rose Bengal, utilizzando illuminazione laser^{mirata 32}. Dopo la somministrazione sistemica dell'agente fotosensibile, l'illuminazione di specifici vasi cerebrali con un fascio laser focalizzato produce specie reattive di ossigeno che danneggiano l'endotelio, scatenando aggregazione piastrinica e formazione di trombo nel sito irradiato. Questo metodo consente un controllo spaziale e temporale preciso della formazione del trombo, facilitando lo studio dei meccanismi dell'ictus trombotico e la valutazione degli interventi terapeutici. Il modello fotochimico riproduce caratteristiche chiave dell'ictus trombotico nell'uomo, in particolare lesioni endoteliali e formazione di coaguli in situ, rilevanti per gli esseri con ictus ischemico indotto da^{trombosi 33}. Inoltre, la tecnica è minimamente invasiva ed applicabile a varie specie animali. Nel contesto del diabete, dove l'ipercoagulabilità e la disfunzione endoteliale sono diffuse, i modelli fotochimici offrono una piattaforma preziosa per indagare l'interazione tra disturbi metabolici e trombosi. Tuttavia, la dipendenza di questo modello da fotosensibilizzatori esogeni e da apparecchiature laser che richiedono competenze tecniche limita l'uso^{diffuso 34}.

L'embolizzazione microsferica comporta l'iniezione endovenosa o intraarteriosa di microsfere di dimensioni definite per occludere meccanicamente i vasi cerebrali, inducendo così l'ischemia cerebrale embolica^{multifocale 35}. Questo modello è uno strumento prezioso per indagare i meccanismi dell'ictus embolico, in particolare gli effetti di microinfarti multipli e distali. La dimensione e il numero di microsfere possono essere controllati con precisione per generare diversi gradi di lesioni ischemiche e distribuzione degli infarti. Questo approccio è vantaggioso per indagare la formazione di emboli, l'occlusione vascolare e le cascate ischemiche a^{valle 36}. Negli animali con diabete, che spesso presentano ipercoagulabilità e un rischio aumentato di embolia, il modello di embolizzazione della microsfera è particolarmente rilevante per esplorare l'interazione tra disfunzione metabolica e rischio di ictus embolico. Inoltre, questo modello facilita la valutazione di terapie anti-trombotiche e trombolitiche in condizioni emboliche controllate. Tuttavia, il modello della microsfera manca della complessità biologica della formazione e dissoluzione del trombo osservata nell'uomo con ictus, poiché gli emboli sono inerti piuttosto che biologicamente^{attivi coaguli 37}.

L'applicazione di modelli tromboembolici negli animali con diabete presenta sfide specifiche. Lo stato ipercoagulabile preesistente e la disfunzione endoteliale possono portare a una formazione di trombo esagerata e imprevedibile, potenzialmente causando infarti più grandi del previsto o un rischio maggiore di trasformazione emorragica. Nella trombosi indotta da fotochimiche, potrebbe essere necessario titolare le dosi di Rose Bengal negli animali diabetici a causa di alterazione del legame dell'albumina o della pulizia renale. Inoltre, le esigenze tecniche di un targeting laser preciso sono aggravate dalla maggiore fragilità dei vasi durali negli animali con^{diabete 38}. Questi fattori devono essere attentamente considerati nella progettazione degli esperimenti.

I modelli tromboembolici, inclusi l'induzione fotochimica e l'embolizzazione microsferica, offrono vantaggi distinti nella replica della complessa fisiopatologia dell'ictus trombotico nell'uomo, in particolare nel contesto dell'ipercoagulabilità associata al diabete. A differenza dei modelli di occlusione meccanica che simulano principalmente l'ostruzione vascolare, i modelli tromboembolici incorporano processi dinamici, come trombosi, embolia e lesioni vascolari, che riflettono in modo più accurato i meccanismi sottostanti dell'ictus ischemico nei pazienti con^{diabete 39}. Questi modelli permettono di indagare disfunzioni endoteliali, attivazione piastrinica, anomalie della cascata di coagulazione e risposte infiammatorie aggravate dal diabete. Inoltre, forniscono piattaforme per valutare l'efficacia e la sicurezza delle terapie antitrombotiche e per esaminare i meccanismi di formazione e risoluzione del trombo in un ambiente ipercoagulabile. Dato che il diabete è caratterizzato da un aumento del rischio trombotico, guidato da una maggiore reattività piastrinica, elevati fattori di coagulazione e fibrinolisi compromità, i modelli tromboembolici sono particolarmente adatti per studiare i meccanismi dell'ictus e interventi terapeutici adatti alle condizioni diabetiche. Inoltre, la loro capacità di riprodurre infarti multifocali ed eterogenei è in linea con le presentazioni cliniche nei pazienti con diabete e ictus, aumentando così la rilevanza traslazionale⁴⁰ (Figura 3).

Considerazioni chiave nella costruzione di modelli compositi

Sequenza di modellazione
La sequenza temporale utilizzata per stabilire modelli animali compositi di diabete combinato con ictus ischemico è una considerazione cruciale, poiché riflette scenari clinici distinti e obiettivi^{di ricerca 41}. Un approccio comunemente utilizzato consiste nell'induzione del diabete prima dell'ictus ischemico, che rispecchia la condizione clinica in cui il diabete è un fattore di rischio di lunga data che predispone i pazienti all'ictus ischemico. Questa sequenza consente di indagare come l'iperglicemia cronica e i disturbi metabolici influenzino la fisiopatologia dell'ictus ischemico, incluse alterazioni nell'integrità vascolare, attivazione infiammatoria e vulnerabilità^{neuronale 42}. Le evidenze indicano che il diabete cronico aggrava la lesione cerebrale ischemica e peggiora gli esiti neurologici, evidenziando l'importanza di modellare il diabete prima dell'ictus per cogliere queste interazioni^{patologiche 43}. Al contrario, indurre ictus ischemico prima del diabete funge da modello per indagare anomalie metaboliche che emergono come conseguenza dell'ischemia cerebrale. Questo approccio è prezioso per chiarire i meccanismi alla base dell'iperglicemia post-ictus ischemica e della resistenza all'insulina, entrambe note per influenzare le traiettorie di recupero e il rischio di^{recidiva 44}. La motivazione scientifica per selezionare una sequenza rispetto all'altra dipende dal focus specifico della ricerca; I modelli preesistenti di diabete sono adatti per indagare il diabete come fattore di rischio e modificatore della patologia dell'ictus, mentre i modelli di induzione del diabete post-ictus ischemico sono adatti a indagare disturbi metabolici secondari. Inoltre, alcuni studi hanno utilizzato strategie di induzione simultanea o sovrapposte per catturare interazioni fisiopatologiche più^{complesse 45}. Nel complesso, l'applicabilità di ciascuna sequenza varia a seconda dei meccanismi patologici e degli obiettivi traslazionali affrontati, sottolineando la necessità di allineare il design del modello con scenari clinicamente rilevanti e ipotesi^{meccanicistiche 46}.

Gravità e durata del diabete
La gravità del diabete, caratterizzata dal grado di iperglicemia e resistenza all'insulina, e la durata dello stato diabetico prima dell'induzione dell'ictus ischemico influenzano profondamente gli esiti ischemici cerebrali nei modelli ^{compositi 47}. Elevati livelli di glucosio nel sangue e resistenza all'insulina sono stati associati a volumi infartici maggiori, aumento dello stress ossidativo e compromessa integrità delle unità neurovascolari dopo l'insulto^{ischemico 48}. I modelli a lungo termine di diabete, tipicamente stabiliti tramite esposizione cronica alla streptozotocina o predisposizione genetica, presentano caratteristiche patologiche più pronunciate, come disfunzione endoteliale, risposte infiammatorie aumentate e un recupero funzionale inferiore rispetto ai modelli a breve termine o acuti di iperglicemia⁴⁹. Clinicamente, la durata prolungata del diabete è correlata a tassi più elevati di recidiva e mortalità da ictus, sottolineando l'importanza di incorporare la cronica del diabete nei modelli animali per aumentare la rilevanza^{traslazionale 50}. Inoltre, i marcatori di controllo metabolico, come il livello di emoglobina A1c, hanno dimostrato di influenzare la prognosi dell'ictus ischemico, suggerendo che modelli che rappresentano diversi stati di controllo glicemico possano fornire informazioni significative sulle finestre terapeutiche e sulle strategie^{di intervento 51}. In modo cruciale, la durata dell'iperglicemia influisce direttamente sugli esiti chirurgici. L'iperglicemia cronica (>4 settimane nei roditori) induce un significativo ispessimento della membrana basale vascolare e una disfunzione endoteliale, rendendo i vasi fragili più soggetti a rottura durante l'inserimento del filamento negli interventi chirurgici eseguiti secondo il modello MCAO, aumentando così la^{mortalità 52,53}. Si raccomanda quindi che gli investigatori riportino esplicitamente la durata e la stabilità dello stato diabetico (ad esempio, tramite il monitoraggio seriale della glicemia nel sangue) come variabili critiche per la riproducibilità e per tenere conto della variabilità del volume dell'infarcto. Sulla base di una sintesi della letteratura, è consigliato stabilire una base stabile di diabete diabetica T2DM prima di indurre l'ictus ischemico per studi sul diabete come fattore di rischio. Un protocollo tipico prevede otto settimane di dieta ricca di grassi seguite da una bassa dose di streptozocina (35 mg/kg)^54,55. L'induzione dell'ictus (ad esempio, MCAO transitorio) dovrebbe essere eseguita quattro settimane dopo la streptozocina, una volta che l'iperglicemia (glucosio a digiuno >16,7 mmol/L) è stabile. Secondo la nostra esperienza, questa sequenza produce un modello composito coerente con un tasso di sopravvivenza chirurgica di circa il 65%–70% nei ratti diabetici, rispetto all'>85% nei^{controlli 56}. Pertanto, la selezione dei parametri che determinano la gravità e la durata del diabete deve tenere conto dei loro effetti modulatori sostanziali sulla lesione cerebrale ischemica e sul recupero, consentendo l'esplorazione dei meccanismi fisiopatologici e la valutazione dell'efficacia terapeutica in contesti che imitano l'eterogeneità clinica.

Fattori di sesso e età
Incorporare variabili di sesso ed età in modelli animali compositi di diabete e ictus è essenziale per aumentare la loro rilevanza clinica, poiché questi fattori influenzano significativamente la fisiopatologia della malattia e gli esiti^57,58. L'invecchiamento è un fattore di rischio predominante per diabete e ictus, e i modelli animali anziani replicano con maggiore precisione le condizioni neurovascolari e metaboliche osservate nei pazienti anziani, che costituiscono la maggioranza degli individui con ictus^{ischemico 59}. Cambiamenti legati all'età, come il metabolismo del glucosio compromesso, l'aumento dello stress ossidativo e le risposte immunitarie alterate, possono influenzare la gravità dell'ictus ischemico e il recupero, rendendo necessario l'uso di animali più anziani per catturare questi^{effetti 60}. Anche le differenze di sesso giocano un ruolo fondamentale, poiché gli ormoni sessuali modulano la sensibilità all'insulina, le vie infiammatorie e la neuroprotezione. Ad esempio, l'estrogeno modula il metabolismo del glucosio e fornisce una protezione parziale contro lesioni ischemiche, sottolineando l'importanza di includere maschi e femmine per chiarire i meccanismi specifici del^{sesso 61}. I disegni sperimentali che tengono conto di sesso ed età facilitano l'identificazione delle risposte differenziali a ischemia e diabete, migliorando così l'interpretabilità e la rilevanza traslazionale dei rischi. Strategie, come analisi stratificate e inclusione equilibrata di entrambi i sessi tra le fasce d'età, sono raccomandate per minimizzare la confusione e informare meglio approcci terapeutici personalizzati. In generale, tenere conto di sesso ed età nella costruzione dei modelli è essenziale per colmare il divario tra gli studi preclinici e la traduzione clinica (Figura 4).

Risultati

In conclusione, lo sviluppo di modelli animali che rappresentino accuratamente il diabete, concomitante con ictus ischemico, è essenziale per far avanzare la comprensione della complessa interazione tra disregolazione metabolica, disfunzione delle β cellule, complicanze vascolari e lesioni ischemiche cerebrali. Da un punto di vista esperto, costruire questi modelli compositi richiede un approccio attento e scientificamente fondato che consideri la sequenza temporale dell'induzione della malattia, la modulazione precisa della gravità del diabete e l'inclusione di variabili biologiche critiche come sesso ed età. Questa strategia di modellazione completa aumenta la rilevanza clinica e il potenziale traslazionale dei risultati preclinici, affrontando così le sfide persistenti negli studi sull'ictus ischemico e il diabete.

Considerando l'eterogeneità degli approcci pubblicati, nessun modello singolo ha catturato pienamente la fisiopatologia multifaccettata nei pazienti con diabete e ictus ischemico acuto. Pertanto, è essenziale una combinazione di modelli adattati a obiettivi di ricerca specifici, che vanno dagli studi meccanicici sulla lesione vascolare diabetica alle valutazioni dell'efficacia terapeutica. Le evidenze esaminate sottolineano il valore unico di questi modelli compositi nell'elucidare i meccanismi con cui il diabete aggrava la patologia dell'ictus ischemico, inclusi disfunzioni endoteliali, infiammazione e compromessa riparazione neurovascolare. Inoltre, questi modelli sono piattaforme indispensabili per valutare nuovi agenti neuroprotettivi, accelerando così l'identificazione e la validazione di trattamenti efficaci.

I ricercatori devono dare priorità alla standardizzazione dei protocolli di costruzione dei modelli per garantire riproducibilità e comparabilità tra i laboratori. Sviluppare modelli animali che imitino più accuratamente le realtà cliniche di una popolazione anziana con diabete diabetica di tipo 2DM è particolarmente cruciale, date le tendenze demografiche e l'aumento del rischio di ictus ischemico nei pazienti anziani. Integrare approcci multi-omici, come genomica, proteomica e metabolomica, in questi modelli offre un potenziale significativo per identificare biomarcatori e bersagli terapeutici specifici per comorbidità. Queste strategie integrative aiuteranno a colmare il divario tra la ricerca di base e l'applicazione clinica, facilitando la traduzione delle intuizioni sperimentali in strategie di medicina personalizzata.

In sintesi, il continuo perfezionamento e applicazione dei modelli animali compositi diabete-ictus costituisce una pietra angolare per l'avanzamento delle intuizioni meccanicistiche e dell'innovazione terapeutica. Armonizzando metodologie di ricerca diverse e sfruttando i progressi tecnologici, i ricercatori possono affrontare in modo più efficace le sfide cliniche urgenti derivanti dall'intersezione tra diabete e ictus ischemico, migliorando infine i risultati per i pazienti (Figura 5).

Si raccomanda che, per i ricercatori alle prime armi, iniziare con un modello dietato ad alto contenuto di grassi/basso dosaggio di streptozocina, combinato con MCAO transitorio, offra il miglior equilibrio tra rilevanza fisiopatologica e fattibilità tecnica. Al contrario, l'uso della trombosi indotta da fotochimiche negli animali diabetici non è consigliato, senza esperienza pregressa, a causa del rischio aumentato di infarti di dimensioni variabili e complicazioni chirurgiche.

Figura 1. Meccanismi fisiopatologici dell'ictus ischemico aggravati dal diabete. Lo schema illustra i percorsi chiave attraverso cui il diabete amplifica la lesione ischemica cerebrale. Il pannello A rappresenta una disregolazione metabolica (iperglicemia e resistenza all'insulina), che porta a stress ossidativo e disfunzione mitocondriale. Il pannello B mostra disfunzione endoteliale vascolare, integrità della BBB compromessa e ispessimento della membrana basale. Il pannello C evidenzia la risposta neuroinfiammatoria aumentata, con la microglia attivata (Iba-1+) che rilascia citochine pro-infiammatorie (IL-1β, TNF-α). Abbreviazioni: BBB, barriera emato-encefalica; ROS, specie reattive di ossigeno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Stabilimento di modelli animali di diabete: T1DM e T2DM. Approcci comuni per indurre T1DM e T2DM nei roditori. Pannello sinistro: protocolli di iniezione di streptozotocina per il DM T1. Panel destro: modelli dietetici, genetici (db/db, ostetricia) e combinati (dieta ad alto contenuto di grassi + streptozocina a basso dosaggio) per il diabete diabetico tipo 2. Sono elencate le caratteristiche principali e i limiti di ogni modello. Abbreviazioni: T1DM, diabete mellito di tipo 1; Diabete mellitus di tipo 2, tipo 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Modelli chirurgici e tromboembolici di ictus ischemico. I principali modelli di ictus ischemico adattati agli animali con diabete. R: Occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) a base di filamenti per ischemia permanente o transitoria. B: Modello tromboembolico che utilizza Rose Bengal e illuminazione laser per indurre trombosi localizzata. C: Modello di embolizzazione microsferica che produce infarti multifocali. Sono indicate considerazioni tecniche per la vascolarizzazione diabetica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Costruzione di modelli animali compositi di diabete e ictus ischemico. Variabili critiche da considerare quando si combinano modelli di diabete e ictus: sequenza temporale (diabete prima vs. ictus ischemico), gravità e durata del diabete, e variabili biologiche (età e sesso). L'interazione di questi fattori determina la rilevanza clinica e l'utilità traslazionale del modello composito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Valutazione fenotipica e applicazioni traslazionali di modelli di diabete e ictus ischemico. Misure chiave di esito per la valutazione dei modelli di diabete e ictus, inclusi il volume infartto, i deficit neurologici, la funzione cognitiva, la patologia vascolare e i marcatori infiammatori. Vengono inoltre evidenziate applicazioni traslazionali, come lo screening dei farmaci, la scoperta di biomarcatori e gli studi sui meccanismi, possibilitati da questi modelli. Abbreviazioni: MRI, risonanza magnetica; mNSS, punteggio di gravità neurologica modificato; SNHG4, gene ospite 4 di RNA nucleolare piccolo; HbA1c, emoglobina A1c. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Obiettivo di ricerca	Modello Diabetico Raccomandato	Modello di corsa consigliato	Punti di forza chiave per questo obiettivo	Limitazioni critiche / Note
Screening della neuroprotezione	Dieta+STZ (T2DM)	MCAO transitorio (tMCAO)	Imita i profili comuni dei pazienti T2DM; La reperfusione consente uno studio mirato degli agenti neuroprotettivi	Alto tasso di mortalità nei ratti diabetici; richiede un'esecuzione chirurgica precisa ed esperta
Trombosi / Antipiastrine	Genetico (db/db)	Fototrombosi	Riproduce lo stato ipercoagulabile diabetico; La trombosi localizzata modella eventi di rottura della placca	L'allineamento laser richiede competenze tecniche avanzate; La composizione dei coaguli differisce dalla patologia umana
Infiammazione / Microglia	STZ (T1DM)	MCAO permanente (pMCAO)	L'iperglicemia grave scatena una risposta infiammatoria esagerata; Nessuna reperfusione elimina variabili di confusione	Non replica la resistenza all'insulina, una caratteristica chiave nella maggior parte dei pazienti clinici con ictus
Riparazione vascolare / angiogenesi	Anziani + Dieta+STZ	Tromboembolico (coagulo)	Combina il fenotipo vascolare invecchiato con la vascolopatia diabetica per imitare la riparazione post-ictus	Alta variabilità nella localizzazione dei coaguli e nel conseguente volume dell'infarto

Tabella 1. Linee guida per la selezione di modelli compositi di diabete e ictus ischemico basati sugli obiettivi di ricerca.