Visualizzazione e analisi quantitativa dell'attivazione di PARP1/PARP2 indotta da genotossine nelle cellule utilizzando un Reporter a base di proteine a fusione fluorescente

Summary

Qui descriviamo un metodo per la visualizzazione basata su cellule, la localizzazione subcellulare e l'analisi quantitativa di focali arricchiti di poli(ADP-ribosio) (PAR) in cellule mammiferiche fissate. Questo saggio consente la quantificazione dei siti di attivazione del PARP indotta dal danno del DNA, inclusi quelli associati alla riparazione da escissione delle basi o alla riparazione della rottura a filamento singolo, nei nuclei delle cellule esposte alla genotossina.

Abstract

Il poli(ADP-ribosio) (PAR) è un polimero di ADP-ribosio sintetizzato da quattro membri della famiglia di enzimi ADP-ribosio polimerasi: PARP1, PARP2, PARP5a e PARP5b. Tuttavia, solo PARP1 e PARP2 sintetizzano PAR in risposta a rotture del DNA. PAR è definita come una modifica post-traduzionale della proteina, ma si dimostra anche che esiste come modifica del DNA o dell'RNA. I livelli di PAR sono ulteriormente regolati dal PARG, una glicoidrolasi del PAR che, insieme a PARP1 e PARP2, modula il livello cellulare di PAR indotto dal danno al DNA. La sintesi dinamica e la degradazione della PAR sono fondamentali per il suo ruolo regolatore nella riparazione del DNA e per la risposta al danno del DNA, che a sua volta influisce sulla riorganizzazione, replicazione, trascrizione e morte cellulare. L'attivazione di PARP1/PARP2 e l'accumulo di PAR possono essere considerati siti di riparazione continua per escissione della base o riparazione di rottura singolo filamento del DNA; tuttavia, numerosi attivatori di PARP1/PARP2 sono anche associati allo stress di replicazione e ad altri processi metabolici del DNA. Una volta formate, le catene PAR facilitano il reclutamento di fattori di riparazione del DNA e risposta al danno (DDR) nei siti di danno al DNA o di insulto genomico tramite i loro domini di legame PAR (PBD). Dieci diversi PBD riconoscono varie regioni della molecola di PAR, inclusi il motivo di legame PAR, il dito di zinco che si lega alla PAR, il dominio WWE e il macrodominio, tra gli altri PBD. Per facilitare l'analisi cellulare della dinamica della PAR, abbiamo utilizzato PBD fusi con proteine fluorescenti verdi potenziate (EGFP) per ottimizzare la quantificazione cellulare dei focus di PAR. Descriviamo un saggio che utilizza un frammento di RNF146 che codifica il dominio PBD/WWE, collegato all'EGFP, per visualizzare e quantificare l'accumulo di PAR nei siti di insulto genomico e BER o SSBR in corso. Descriviamo passaggi sperimentali, tra cui la produzione di particelle lentivirali, la trasduzione della linea cellulare bersaglio, il trattamento delle cellule di mammiferi per indurre danni genomici al DNA, l'acquisizione di micrografie a fluorescenza confocale e la quantificazione semi-automatizzata dei dati.

Introduction

Questo protocollo descrive il saggio LivePAR, che consente la visualizzazione e l'analisi quantitativa del poli(ADP-ribosio) (PAR) nei siti di insulto genomico, principalmente associato alla riparazione da escissione di basi (BER) o alla riparazione della rottura a filamento singolo (SSBR), nelle cellule^{mammiferiche 1,2,3}. La BER è una via cruciale di riparazione del DNA che rimuove basi danneggiate o modificate dal DNA (per le revisioni su BER e PARilazione, vedi 4,5,6,7). La BER inizia con glicosilasi a DNA che riconoscono ed eliminano le basi^{modificate 4}, lasciando un sito apurinico/apirimidinico (AP), ad esempio la glicosilasi purina metilica (MPG), che escidasce le basi^{metilate 8,9}, o 8-osoxanina glicosilasi (OGG1), che escidasce 8-oxoG ^9,10. I siti AP vengono quindi scinditi dall'endonucleasi AP 1 (APE1)11,12,13, creando una incisione nella spina dorsale del DNA. Una polimerasi, ovvero DNA polimerasi β (Polβ)^14,15, adatta e riempie il vuoto usando il filamento non danneggiato come modello, e infine, le ligasi del DNA sigillano il filamento^{riparato 16,17}, ad esempio la DNA ligasi I o la DNA ligasi III.

I principali attori in BER e SSBR sono le poli(ADP-ribosio) polimerasi 1 e 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzimi che rilevano rapidamente le rotture dei filamenti di DNA durante BER o SSBR. Rilevando queste roture, PARP1/PARP2 catalizza l'aggiunta di polimeri ADP-ribosio a sé stesso e ad altre proteine—un processo chiamato PARylation (per revisione,^{vedi 6})—idrolizzando ^NAD+. Questo crea una impalcatura dinamica proteica (PAR) che recluta altri fattori di riparazione del DNA nel sito del danno, migliorando la fedeltà della riparazione del DNA. Per gestire questo impalcatura dinamica di PAR, diverse proteine contribuiscono all'idrolisi e alla rimozione delle catene di PAR, tra cui l'ADP-ribosio-accettore idrolasi 3 (ARH3), l'ADP-ribosio glicosil-idrolasi terminale 1 (TARG1), la mono-ADP-ribosil idrolasi 1/2 (MacroD1/2) e la poli(ADP-ribosio) glicoidrolasi (PARG⁾ 6,21,22,23,24,25,26 . Tuttavia, PARG è principalmente responsabile di questo^{processo 21,27} e svolge un ruolo cruciale nella risposta al danno del DNA (DDR^)28,29.

PARG è quindi criticamente collegato alla funzione di PARP1 e PARP2. Mentre PARP1 e PARP2 creano i polimeri PAR, PARG agisce come un enzima di "pulizia", idrolizzando questi polimeri e invertendo efficacemente la PARilation^30,31. Questo processo è essenziale per completare sia il BER che l'SSBR e per permettere il riciclo di PARP1/PARP2 per rispondere a nuovi danni al DNA. Di conseguenza, PARP1, PARP2, PARylation e PARG lavorano in modo coordinato, garantendo una riparazione efficiente e reversibile del DNA tramite BER e SSBR ^4,6.

L'entità della PARilazione può essere influenzata da vari fattori e svolge un ruolo essenziale nella risposta complessiva al danno^{del DNA 32}. Questi fattori includono l'esposizione a genotossine che aggiungono addotti alle basi del DNA, come N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metilmetanasolinato (MMS), perossido di idrogeno (_H2O2) o tert-butil idroperossido (tBuOOH). Inoltre, l'entità della PARilazione può essere influenzata da molecole che modulano il processo di PARilazione, come il riboside diidronicotinamide (NRH), un precursore del ^NAD+, che potenzia l'attivazione del PARP aumentando i livelli di ^NAD+, o il FK866, un inibitore del NAMPT, che può diminuire i livelli di ^NAD+ e regolare negativamente l'attivazione^{del PARP-3}. Infine, mutazioni genetiche o inibizione da parte di piccole molecole di enzimi come PARP1/PARP2, PARG o altre proteine di riparazione del DNA (ad esempio, difetti nella BER o fattori di ricombinazione omologhi come BRCA1/BRCA2) possono alterare l'attivazione^{di PARP} 33,34,35,36.

Il saggio LivePAR utilizza un frammento della proteina del dito anulare 146 (RNF146) che codifica un dominio WWE (amminoacidi 100–182), collegato a una proteina di fluorescenza verde potenziata (EGFP⁾³. Il dominio WWE è un dominio globulare chiamato così dai residui conservati triptofano (W) e glutammato (E) nel suo sito di legame³⁷. I domini WWE si legano all'iso-ADP-ribosio, la più piccola unità strutturale interna all'interno delle catene^{PAR 38,39}. RNF146 è una ligasi di ubiquitina E3 che riconosce iso-ADP-ribosio^38,40 ed è segnalata come target di proteine coinvolte nel BER (XRCC1, DNA ligasi III e PARP1) per la degradazione^{proteasomale 41}. Collegare questo dominio WWE all'EGFP consente la visualizzazione e la rilevazione dei siti di PARilazione indotti da genotossine nelle cellule di mammiferi. In questo protocollo, descriviamo la generazione di linee cellulari stabili che esprimono il segnalatore LivePAR (Figura 1A), l'induzione di danni al DNA per attivare PARP1/PARP2, la produzione di PAR e l'acquisizione e l'analisi dei dati della microscopia a fluorescenza confocale (Figura 1).

Il plasmide pMD2.g(VSVG) fornisce la glicoproteina dell'involucro virale (VSVG), che amplia la gamma cellulare che il virus può infettare rispetto alla proteina dell'involucro lentivirale nativa. Il plasmide pRSV-REV fornisce la proteina dell'elemento regolatore (REV), che è un transattivatore cruciale che si lega all'RNA virale e attiva la trascrizione dei geni virali; È essenziale per una replicazione virale efficiente. Il plasmide pMDLg/pRRE fornisce diversi componenti interni chiave di imballaggio, ovvero gag, che codifica la matrice (MA), il capside (CA) e le proteine nucleocapside (NC), pol, che codifica gli enzimi necessari per la replicazione virale e l'integrazione nel genoma della cellula ospite, e l'elemento regolatore dell'RNA (RRE), un elemento RNA che migliora l'efficienza della traduzione dell'RNA virale e dell'imballaggio dell'RNA genomico. Il plasmide pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (Figura 1A) contiene cDNA codificante per la proteina di fluorescenza verde potenziata (EGFP) che viene fusa al C-terminale del dominio WWE di RNF146 (amminoacidi 100–182), un dominio proteico che si lega alle catene poli(ADP-ribosio), e il vettore codifica anche una cassetta di resistenza all'igromicina. Il virus è isolato dal soprandanante della coltura cellulare e può essere conservato a -80 °C o usato immediatamente per la trasduzione (Figura 1B).

Protocol

1. Produzione di lentivirus

NOTA: Questo protocollo utilizza un sistema di confezionamento lentivirale di terza^{generazione 42,43} per generare cellule che esprimono un segnalatore PAR codificato geneticamente. Le particelle lentivirali sono prodotte in celle 293FT utilizzando un sistema a quattro plasmidi composto da componenti di involucro, regolatori e di imballaggio, insieme alla costruzione pLV-EF1A-LivePAR-Hygro che codifica un dominio WWE di RNF146 marcato con EGFP, che lega le catene poli(ADP-ribosio). Il virus risultante viene utilizzato per generare linee cellulari stabili per la visualizzazione e quantificazione dell'accumulo di PAR.

1. Coltivare cellule a basso passaggio di 293FT in DMEM contenenti il 10% di FBS e l'1% di Pen/Strep in un'atmosfera umidificata a 37 °C e 5% di_CO2. Assicurati che le cellule 293FT non siano state in coltura per più di 3 settimane.
   NOTA: Usiamo abitualmente celle da 293FT con numeri di passaggio compresi tra 3 e 10. Le cellule 293FT sono state trasformate e immortalate dall'antigene T grande SV40. Queste cellule hanno un'elevata efficienza di trasfezione, essenziale per la produzione di proteine ricombinanti e gli studi sull'espressione genica. Rispondono bene sia ai metodi di trasfezione a base di lipidi che a quelli di trasduzione virale.
2. Lastra 1,7 × 10⁵ cellule da 293FT su una piastra di coltura tissutale da 60 mm in un volume finale di 5,5 mL di substrato colturale al giorno 1. Riportare le cellule nell'incubatrice per 24 ore.
3. Il secondo giorno (il giorno della trasfezione), aggiungere 375 μL di mezzo DMEM senza FBS e senza penna/streptococco a un tubo sterile per microcentrifugazione da 1,5 mL. Successivamente, si aggiungono 10 μL di un reagente di trasfezione a base di lipidi, 4 μg del plasmide pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg del plasmide pMD2.g(VSVG), 2 μg del plasmide pRSV-REV e 2 μg del plasmide pMDLg/pRRE. Tocca delicatamente il tubo di microcentrifugazione per mescolare il mezzo, il reagente di trasfezione e il DNA plasmidico (evita il vortex). Incubare per 15–30 minuti a temperatura ambiente per permettere la formazione del complesso DNA/reagente di trasfezione.
4. Aggiungi la miscela plasmide/reagente per trasfezione al piatto da 60 mm contenente le celle da 293FT da trasfectare senza rimuovere il mezzo, a gocce. Riportare le cellule nell'incubatrice per 48 ore.
   NOTA: Questo periodo consente la produzione e il rilascio delle particelle lentivirali nel mezzo di crescita.
5. Al quarto giorno, raccogliere il materiale di coltura dalle cellule trasfettate da 293FT per isolare le particelle di lentivirus. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,45 μm per separare i detriti cellulari dalle particelle lentivirali.
6. Determina il titolo del lentivirus con i reagenti disponibili (opzionale).
   NOTA: Questo metodo generalmente produce 10^5-10 6 unità infettive per mL (IFU/mL), il che corrisponde a una molteplicità approssimativa di infezione (MOI) di ~5 se usato come descritto nel passaggio di trasduzione qui sotto.
7. Aliquota, i mezzi contenenti le particelle di lentivirus in quattro crioviali sterili (1,0 mL per tubo) e conservati a -80 °C.

2. Trasduzione

NOTA: Questa sezione illustra il protocollo di trasduzione lentivirale utilizzato per introdurre un transgene nelle linee cellulari (Figura 1B). È stato costantemente efficace nel nostro laboratorio 1,3,33,37,44,45.

1. Coltivare una linea cellulare scelta (basso numero di passaggi) nel terreno appropriato in un'atmosfera umidificata a 37 °C e 5% di_CO2.
   NOTA: Inizia con un passaggio precoce del tipo cellulare necessario. Una nuova fiala di cellule deve essere scongelata e passata almeno una volta prima di essere seminata per la trasduzione.
2. Nel primo giorno, il seme 1 × 10⁵–1,5 × 10⁵ cellule per pozzo, su ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzi in 2 mL di materiale di crescita. Riportare le cellule nell'incubatrice per 24 ore.
3. Il secondo giorno (il giorno della trasduzione), assicurarsi che le cellule siano tra il 20% e il 40% di confluente. Aggiungi 1 mL di virus, 1 mL di materiale di crescita e 2 μL di polibrene (2 mg/mL di calcio) in un tubo conico da 15 mL e mescola delicatamente per inversione (evitando il vortice).
   NOTA: La polibrena viene utilizzata durante la trasduzione del lentivirus per prevenire la repulsione elettrostatica tra le particelle virali e la membrana cellulare. Poiché la polibrene è carica positivamente, interagisce con le glicoproteine virali cariche negativamente, neutralizzandone la carica. Inoltre, il polibrene si lega ai glicosaminoglicani nel mezzo di coltura cellulare, impedendone l'interazione con il virus. La polibrene, quindi, aumenta notevolmente l'efficienza della trasduzione.
4. Rimuovi il materiale di crescita dalla piastra a 6 pozzi e aggiungi la miscela di virus/substrato/polibrene in ogni pozzo. Posizionare le cellule con la miscela di trasduzione in un incubatore contenente un'atmosfera umidificata a 32 ^°C e il 5% di_CO2 per 16–18 ore.
   NOTA: Incubare le cellule a 32 °C durante la notte durante la trasduzione lentivirale è una pratica comune, anche se non essenziale, che aumenta significativamente l'efficacia dell'infezione virale. Abbassare la temperatura rallenta il metabolismo cellulare, riducendo così le difese cellulari e aumentando la suscettibilità alle infezioni virali.
5. Al terzo giorno, sostituire il substrato delle cellule trasdotte dal virus con un nuovo substrato e trasferirle in un incubatore a 37 °C. Incubare per 48 ore.
   NOTA: Questi 2 giorni sono sufficienti perché le cellule producano il transgene RNF146(100–182)-EGFP e diventino resistenti all'igromica.
6. Per sviluppare le linee cellulari policlonali stabili risultanti che esprimono il transgene RNF146(100–182)-EGFP, si inizia la selezione dell'igromicina dopo 2 giorni di incubazione come indicato nel passo 2.5.
   1. In alternativa, espandere questa popolazione di cellule trasdotte in assenza di igromicina e utilizzarla per l'analisi PAR nel corso dei successivi 10–14 giorni (trasduzione transitoria), come descritto in^{precedenza 1}.
7. Trasferire le cellule su una piastra da 100 mm una volta cresciute in presenza di igromicina ed espandere quanto necessario.
8. Prepara le scorte criogeniche delle celle trasdotte per un uso futuro.
9. Validare l'espressione del transgene RNF146(100–182)-EGFP tramite microscopia confocale come descritto nella sezione 3. Il transgene RNF146(100–182)-EGFP sarà espresso in tutta la cellula.
10. Validare l'espressione del transgene RNF146(100–182)-EGFP tramite immunoblotting, come descritto^{altrove 1,37}.

3. Microscopia confocale e analisi

NOTA: Questa sezione del protocollo dettaglia la preparazione delle coperture, la semina delle cellule che esprimono LivePAR, l'esposizione ai trattamenti (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi e/o NRH) e la preparazione delle cellule fisse su vetrini del microscopio per l'imaging confocale e l'analisi dei focus PAR (Figura 1C). Descrive inoltre l'uso del software ImageJ e di una macro personalizzata per la quantificazione semi-automatizzata dei focus PAR. Questo protocollo può essere utilizzato per indagare l'influenza di vari fattori (ad esempio, piccole molecole, knockout proteico BER) sulla PARylation dipendente dal danno del DNA ed è stato impiegato con successo nel nostro laboratorio^34,37.

1. Preparazione del copertura
   1. Immergi 20 × 20 mm di copertura per 20 minuti in etere dietilico in un contenitore di vetro in una cappa a fumi.
      NOTA: Usa una cappa per fumi quando lavori con etere dietilico a causa della sua infiammabilità e dei potenziali pericoli.
   2. Rimuovere l'etere dietilico e lavare le coperture in concentrazioni decrescenti di etanolo [100%, 70%, 50%, poi 0% (ddH₂O)].
   3. Rimuovi l'acqua e immergi le coperture per 20 minuti in 1 N HCl con una delicata agitazione.
   4. Rimuovi l'HCl e lava le coperture 3 volte con ddH₂0.
   5. Conserva le coperture in etanolo al 70% a 4 °C fino all'uso.
2. Corazzatura delle celle
   1. Posizionare due coperture sterili da 20 × 20 mm in un piatto di coltura cellulare da 60 mm uno accanto all'altro. Prepara quanti piatti sono necessari per l'esperimento. Assicurati che tutto l'etanolo sia evaporato prima di aggiungere qualsiasi cellula al piatto contenente i copri-scap. Lava via qualsiasi etanolo residuo aggiungendo PBS sterile alla piastra per 10–15 minuti; rimuovere PBS prima di seminare le cellule.
   2. Semina 200.000 cellule che esprimono LivePAR per ogni piatto di coltura cellulare. Lasciare che le cellule si attacchino alle membrane di copertura per 24–36 ore, condizionare il mezzo e iniziare a replicarsi (crescere).
3. Induzione dei fochi PAR
   1. Espone le cellule che esprimono LivePAR a 100 μM NRH, 10 μM PARGi e 10 μM MNNG o 40 μM tBuOOH. Inoltre, per testare la formazione di PAR dipendente da PARP1/PARP2, inibire PARP1/PARP2 aggiungendo 10 μM di PARPi. Aggiungi i composti direttamente sul substrato contenente le cellule dei coverslip e fai girare delicatamente il substrato nei piatti di coltura per distribuire i composti. Incubare i piatti da 60 mm a 37 °C per 60–90 minuti.
      NOTA: La NRH viene utilizzata per garantire che siano disponibili livelli sufficienti di NAD⁺ cellulare per una par-ilazione ottimale mediata da PARP1/^PARP2 33,46,47. PARGi viene utilizzato per impedire che le catene PAR sintetizzate da PARP1/PARP2 vengano scomposte da PARG. MNNG o tBuOOH viene utilizzata per indurre le modifiche alla base del DNA per avviare il BER, che porta all'attivazione di PARP1/PARP2. PARPi viene utilizzato per confermare che il segnale (i fochi) derivi dall'attivazione di PARP1/PARP2.
4. Fissazione delle celle e montaggio dei copri
   1. Rimuovi il substrato e lava con PBS.
      NOTA: Lavare una o due volte con PBS è importante, poiché il mezzo utilizzato per la coltivazione delle cellule contiene un'alta concentrazione di proteine sieriche. Il lavaggio con PBS rimuove anche qualsiasi residuo di MNNG o tBuOOH ancora presente nel substrato.
   2. Prefisso al 4% di formaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Lava le cellule 3 volte con PBS.
   3. Risolvi aggiungendo 3 mL di metanolo freddo (-20 ^°C): acetone (7:3) alle cellule. Posiziona i piatti a -20 ^°C per 9 minuti.
   4. Rimuovi il metanolo: acetone. Lava 3 volte con PBS.
   5. Pipetta 15 μL di mezzo anti-sfogliamento contenente DAPI sulle vetrine di vetro. Monta delicatamente le coperture sul punto del substrato di montaggio con le celle rivolte verso l'interno, minimizzando le bolle.
   6. Centrare, fissare e sigillare i lati della copertura sulla vetrata applicando una piccola quantità di smalto trasparente per chiodi sui lati della copertura. Posiziona le lamine al buio per far asciugare lo smalto con unghie (~10 min). Conserva i vetrini al buio a 4 °C fino a quando non sono pronti per l'immagine.
5. Cellule di imaging
   1. Immagini tutte le vetrine almeno 10x a un ingrandimento del 63×, usando un microscopio confocale. Rilevare i fochi PAR usando il laser a 488 nm e la colorazione nucleare (DAPI) usando il laser a 405 nm (ad esempio, vedi Figura 2).
6. Analisi delle immagini confocali
   1. Crea un file di testo contenente il testo seguente e chiamalo "LivePAR_Macro". Questo macro facilita la quantificazione "automatica" dei fochi PAR nei nuclei delle cellule che esprimono LivePAR:
      macro "DAPI positive staining [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplicato...", "titolo=duplicato DAPI");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-bit");
      run ("Canali Divisi")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gaussian Blur...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Inverti")
      run ("Riempire i buchi")
      run ("Bacino")
      run("Analizza le particelle...", "dimensione=50.00-Infinito circolarità=0.00-1.00 mostra=Outlines aggiungi escludere include in_situ");
      riname("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Duplicato...", "titolo=GB1 duplicato");
      run("Duplicato...", "titolo=GB20 duplicato");
      selectWindow("GB20")
      run("Gaussian Blur...", "radius=20 stack");
      selectWindow("GB1");
      run("Gaussian Blur...", "radius=1 stack");
      imageCalculator("Sottrai crea stack", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("Risultato di GB1");
      rinomin("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run ("Canali Divisi")
      selectWindow("C1-"+titolo);
      close();
      selectWindow("C2-"+titolo);
      setThreshold(90,255) //il valore 90 può essere modificato per tenere conto della variabilità sperimentale
      run("Analizza le particelle...", "dimensione=0,00-200 circolarità=0,00-1,00 mostra=Maschere riassumono");
      close ("C2-"+titolo);
      selectWindow("Maschera di C2-"+titolo);
      chiude ();
      setBatchMode(falso);
      }
   2. Scarica e installa ImageJ sul computer (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Apri ImageJ e installa la macro (file di testo: LivePAR_Macro) cliccando su Plugin | Macros | Installa.
   4. Apri tutti i file confocali in ImageJ e salvali come file *.tif per preservare i file originali.
   5. Apri un documento di calcolo e salvalo come [data]_[Linea Cellulare]_Foci Analisi.
   6. Analizza un file *.tif alla volta. Premi 1 per trovare i nuclei; quando si apre una finestra intitolata ROI Manager , seleziona tutte le voci nella finestra e premi aggiungi per sovrapporre l'area dei nuclei all'immagine originale. Elimina i nuclei identificati erroneamente. Disegna il nucleo usando lo strumento di selezione a mano libera e premi 2 per quantificare i focus PAR.
      NOTA: Non includere nuclei che non sono completamente all'interno del telaio.
   7. Seleziona ogni nucleo nel ROI manager uno per uno e premi 2. Apparirà un conteggio che indica il numero di foci all'interno del nucleo selezionato. Una volta che i focoli in tutti i nuclei del file sono stati punteggiati, copia e incolla le informazioni nel documento aperto del foglio di calcolo.
   8. Ripeti i passaggi 3.6.6 e 3.6.7 con tutti i file *.tif.
   9. Traccia i focus PAR per nucleo nel software scelto (ad esempio, vedi Figura 3).

Results

Le cellule che esprimono la sonda LivePAR possono essere generate producendo un lentivirus che codifica per la proteina di fusione RNF146(100-182)-EGFP (Figura 1A). Le cellule possono essere valutate dopo l'espressione transitoria fino a due settimane dopo la trasduzione o come linee cellulari stabili dopo la selezione nell'igromicina (Figura 1B)¹. Dopo il trattamento con genotossina, i focus PAR indotti ...

Discussion

Il saggio LivePAR è stato sviluppato per rilevare siti di danno al DNA genomico nucleare in cui PARP1/PARP2 sintetizza attivamente le catene PAR. Per ottenere ciò, un frammento di RNF146 che codifica il dominio WWE (amminoacidi 100–182) è stato fuso a EGFP 1,2,3,37. Ulteriori sonde PAR che abbiamo descritto codificano EGFP fuso con residui di amminoacidi da 1 a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
, sostanze chimiche e peptidi
0,45 & micro; m Durapore filtri steriflip	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
Coperture per microscopio 20 x 20 mm	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Acetone	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Piatti per coltura cellulare, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Piatti per coltura cellulare, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Piastre di coltura cellulare, 6 pozzi	VWR	Catalogo # 62406-161
Crioviali, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Etere dietilico	Thermo Fisher Scientific	Gatto # 60-29-7
Dimetilsolfossido	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Filtri sterili usa e getta, 0,45 & micro; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Etanolo, 200 proof	Decon Labs	Catalogo # 2701
Vetri per microscopio in vetro	Thermo Fisher Scientific	Catalogo # 12-544-4
Siero fetale bovino inattivato dal calore	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Acido cloridrico	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Igromicina	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Grandi salviette Kim	Kimberly-Clark	Gatto# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Cat# 631280
Metanolo	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Diidrossi-5-(idrossimetil) tetraidrofurano-2-il]-4H-piridina-3-carboxamide)	Marie Migaud o  NuChem Sciences Inc
Inibitore del PARG (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
Inibitore del PARPi (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penicillina/streptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Reagente di trasfezione)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Vectashield (H-1000) mezzo di montaggio anti-sfadatura	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
Linee cellulari
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(derivata da cellule renali embrionali umane trasformate con l'antigene T grande SV40)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Donazione generosa da	N/A
(Linea cellulare tumorale di glioblastoma umano)	Dr. Ian Pollack (Università di Pittsburgh)	N/A
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(cellule epiteliali del pigmento retinico umano immortalizzato da hTERT)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(Linea cellulare di osteosarcoma umano)	ATCC	Cat# HTB-96
DNA ricombinante
pMDLg/pRRE	Azione da laboratorio # 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Azione di laboratorio # 254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Stock da laboratorio # 252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR è il dominio WWE di RNF146, residui amminoacidi 100-182, fusi a EGFP; contiene una cassetta a resistenza all'igromicina)	Stock di laboratorio # 1727	Addgene, Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator (per la preparazione delle figure)	Adobe Systems	Versione 2024
GraphPad Prism	GraphPad	Versione 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html